使用微流体装置来衡量寿命和细胞表型单芽殖酵母细胞
2017年3月30日
本文介绍用于生产微流体芯片和微流体实验的设置来测量的寿命和单个酵母细胞的细胞表型进行了优化的协议。
该实验的总体目标是制造一种专门的微流控装置，并使用它来测量单个酵母细胞的寿命和细胞表型。这种方法可以帮助回答酵母衰老领域的一些关键问题，例如母细胞为什么会衰老和死亡，以及导致细胞稳态丧失并最终导致细胞衰老和死亡的早期分子事件是什么？这项技术的主要优点是我们可以同时追踪母细胞、追踪它们的寿命和各种分子标志物，因此我们可以寻找与寿命相关的分子事件。
虽然这种方法可以提供对酵母老化的见解，但它也可以应用于其他领域，例如监测需要多代细胞检查的参与的次要反应。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为微流体装置的制造、细胞加载、显微镜设置需要大量的练习才能成功执行。这种方法的事先演示至关重要，因为很难在微流体装置中正确加载酵母。
开始使用随附文本协议中描述的标准技术为器件制造硅晶片模具。将其特征面朝上放入 15 厘米培养皿中。用胶带将霉菌固定在培养皿上。
接下来，将干净的称量船放在天平上并撕碎天平。将 50 克 PDMS 碱倒入称量舟中，然后加入 5 克 PDMS 固化剂。用一次性移液器搅拌 PDMS 基质和固化剂。
从称重船的边缘开始，慢慢向内移动。彻底搅拌混合物几分钟，直到整个混合物中形成小气泡。将混合物缓慢倒入培养皿中，使其完全覆盖硅晶片模具。
然后将培养皿置于真空中 10 分钟，以去除 PDMS 混合物中的所有气泡。如果从真空中取出后混合物表面仍有气泡，请使用移液器将其吹出。接下来，将设备在 75 摄氏度下烘烤两个小时。
冷却回室温后，小心地切开模具周围的 PDMS，然后轻轻地从硅晶片模具上剥离聚合 PDMS 层，避免对晶片模具的结构造成任何损坏。将 PDMS 层放在工作台上，图案面朝上。用单刃工业剃须刀片小心地切出单个芯片，从每个芯片的边缘保留足够的余量，以避免施工损坏。
将图案面朝上，使用穿孔笔通过通道两侧的入口和出口圆圈直接向下打孔。将穿孔笔针头再次插入孔中，检查每个孔。确保针头可以从另一侧出来，表明没有堵塞。
接下来，使用胶带清洁顶面的灰尘颗粒和碎屑。重复此步骤至少三次，并在 PDMS 上留下一块干净的透明胶带，以保持表面无尘。然后将设备翻转过来，并在 PDMS 的对面站点重复此过程。
将最后一条胶带也留在这一侧。现在为设备的底座准备一个玻璃表面。选择 24 毫米 x 30 毫米、厚度在 13 到 17 毫米之间的盖玻片。
将 70% 乙醇喷洒在玻璃上，并用除尘剂干燥以对表面进行消毒。然后将盖玻片和 PDMS 转移到塑料板上。从 PDMS 上取下透明胶带，将样板面朝上放入印版中，不要接触顶面。
然后将板转移到等离子室中。对 PDMS 和盖玻片进行氧气等离子体处理，以使表面具有亲水性。然后从等离子室中取出板，并小心地将 PDMS 的等离子处理表面连接到盖玻片中。
确保 PDMS 和盖玻片之间没有气泡。最后，将设备转移到烤箱中，在 75 摄氏度下烘烤至少两个小时。在 PDMS 芯片制备前一天，将输入和输出管浸入 70% 乙醇溶液中。
第二天，用高压灭菌的水填充 5 毫升注射器，然后将试管放在注射器上并用水冲洗试管来清洗每根试管。重复洗涤步骤至少 3 次以去除残留的乙醇。接下来在光学显微镜下检查 PDMS 通道。
使用 10 X 物镜确保结构一致且完整。使用透明胶带稳定显微镜平台上的完整 PDMS 芯片。将装有无菌水的 5 毫升注射器固定到注射泵上，并将相应的输入和输出管插入设备。
将流速设置为每小时 750 微升，然后冲洗芯片约 10 分钟。观察频道以确保所有气泡都被冲走。如果冲洗 10 分钟后仍有气泡，请手动调整速度以消除气泡。
将 1 毫升制备好的酵母样品转移到两个 1.5 毫升微量离心管中，并以 3， 000 倍 G 离心样品 5 分钟，从每个试管中取出大部分上清液，并将剩余上清液合并形成 5 毫升样品。酵母样品准备好后，从 PDMS 芯片中取出输入管。手动反转注射泵，吸入一个 1 到 2 厘米长的小气泡，每个输入管，然后吸入细胞培养物。
然后将输入管插回 PDMS 芯片中，并重新启动泵，以每小时 750 微升的速度加载细胞。将注射泵保持开启状态 10 分钟，然后在显微镜下检查细胞上样进度。成功加载会将细胞捕获在超过 60% 的悬浮柱下。
为了维持酵母细胞，将注射器中的溶液换成营养溶液，并将速度调整为每小时 400 微升。酵母的寿命表型可以通过计算每个被困母细胞产生的芽数并估计 Kaplan-Meier 估计器来获得。使用该方案，该设备经常捕获从已经捕获的细胞中出芽的新鲜子细胞。
然后，这些细胞变成新鲜的母细胞，可以使用下游图像分析软件进行鉴定。这些新鲜的母细胞提供了更准确的寿命测量。在这个实验中，新鲜母细胞的平均寿命略长约两代。
除了芽的数量外，还可以从成像数据中提取两个连续出芽事件之间的时间间隔。出芽在其寿命结束时急剧减慢，表明这些衰老细胞处于不健康状态。在尝试此程序时，请务必记住使用新鲜制备的芯片以帮助避免气泡，并在需要时增加细胞浓度以提高细胞加载效率。
开发后，这项技术为酵母老化领域的研究人员探索导致衰老表型的早期分子变化铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何制作这种微流控设备以及如何使用它来测量单细胞中的寿命和细胞表型有很好的了解。
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概述
本文介绍了一种创建专门用于测量单个酵母细胞寿命和细胞表型的微流控装置的协议。该方法旨在解决酵母衰老领域的关键问题，特别是关于母细胞衰老过程的问题。
关键研究组成部分
科学领域
- 微流控
- 细胞生物学
- 酵母衰老
背景
- 微流控装置允许对细胞环境进行精确控制。
- 了解酵母衰老可以提供对更广泛的生物衰老过程的洞察。
- 跟踪母细胞及其分子标记对于这项研究至关重要。
- 将酵母正确装入微流控装置是具有挑战性的，需要练习。
研究目的
- 测量单个酵母细胞的寿命。
- 调查导致细胞衰老的分子事件。
- 将寿命与各种分子标记相关联。
使用的方法
- 微流控装置的制造。
- 将酵母细胞装入装置中。
- 用于观察的显微镜设置。
- 细胞表型和寿命的跟踪。
主要结果
- 成功跟踪母细胞及其寿命。
- 识别与衰老相关的分子标记。
- 对酵母细胞衰老过程的洞察。
- 在其他细胞研究领域的潜在应用。
结论
- 微流控方法为酵母衰老提供了宝贵的洞察。
- 装置制造和细胞装入的挑战可以通过练习克服。
- 该技术可能适用于其他需要长期细胞观察的研究领域。
常见问题
Executive Industry Relevance
This microfluidic approach enables high-resolution, longitudinal tracking of single-cell aging dynamics, providing mechanistic insights into cellular homeostasis loss that can inform target validation in aging-related pathways. By correlating molecular markers with lifespan outcomes in a controlled microenvironment, the method supports predictive confidence in early-stage hypothesis testing for conserved longevity mechanisms. Its scalability across strains and conditions positions it as a reusable discovery platform for de-risking therapeutic targets in age-associated diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking molecular events to functional aging phenotypes in single cells.
- Operational Value: Supports biological de-risking through real-time correlation of biomarkers with lifespan trajectories.
- Scientific Value: Enhances target confidence by identifying conserved molecular drivers of aging across genetic backgrounds.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized, reproducible biological systems for quantitative phenotypic screening across multiple channels.
- Operational Value: Delivers high-resolution imaging and budding frequency readouts that enable reliable compound effect assessment.
- Scientific Value: Facilitates assay scalability by trapping hundreds of cells per channel for longitudinal analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system insights by characterizing cellular aging dynamics with single-cell resolution.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through standardized lifespan and phenotype measurement.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by distinguishing causal molecular events from correlative changes in aging.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven aging research that informs lead identification through phenotypic anchoring of molecular targets.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by tracking real-time molecular markers alongside replicative lifespan in mother cells.
- Screening: Delivers quantitative, time-resolved phenotypic outputs such as budding intervals and morphology changes for compound screening.
- Analytics: Generates Kaplan-Meier survival estimates and single-cell lineage data to enable comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing conserved aging phenotypes translatable to higher eukaryotic models.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular platform adaptable to multiple yeast strains and environmental conditions for repeated use.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in linking molecular markers to aging outcomes.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized device fabrication and cell loading protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of ineffective interventions in aging pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying targets with strong phenotypic validation in aging models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication and sterile biomolecular handling.
- Depends on access to plasma treatment systems, syringe pumps, and fluorescence microscopy setups.
- Necessitates cross-team standardization for consistent chip preparation and yeast strain handling.
- Involves adaptation considerations when extending to non-yeast model systems due to differences in cell size and adhesion.
- Limited by the need for meticulous bubble removal and surface cleaning to ensure reliable cell trapping and imaging.
