Name: 使用微流体装置来衡量寿命和细胞表型单芽殖酵母细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学习使用微流体装置测量单芽殖酵母细胞寿命与细胞表型的方法。该技术可同时追踪母细胞寿命及分子标记，为研究细胞衰老机制提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究得到了美国国立卫生研究院资助项目 AG043080 和国家自然科学基金（NSFC）项目编号 11434001 的支持。我们感谢 Lucas Waldburger 对手稿的校对。

1. 硅片模具的制备
注意：光刻掩模使用 AutoCAD 软件设计，并由商业公司制造。该设计包含三层不同的图案（<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55412/single_cell_trap.dwg" target="_blank">补充文件 1</a>）。第一层、第二层和第三层的高度分别约为 4 µm、10 µm 和 50 µm。硅晶片模具通过软光刻技术由光刻掩模制备9,10。
<ol>
	<li>将硅片在 200 °C 下烘烤 10 分钟，以蒸发水分。在硅片上旋涂负性光刻胶 SU-8。 
	注意：以5,000 rpm转速旋涂SU-8 3005 30秒，形成第一层；以3,000 rpm转速旋涂SU-8 2010 30秒，形成第二层；以2,000 rpm转速旋涂SU-8 3025 30秒，形成第三层。</li>
	<li>在图案转移前对涂覆的晶圆进行软烘。将晶圆对准并曝光于 &#34;直接接触&#34; 使用掩模对准器进行模式化。 
	注意：第一层在 95 °C 下软烘 2 分钟，第二层在 95 °C 下软烘 3 分钟，第三层在 95 °C 下软烘 15 分钟。曝光剂量使用 100 mJ/cm²。2 对于第一层，130 mJ/cm2 用于第二层，以及 200 mJ/cm2 第三层。</li>
	<li>曝光后，将晶圆进行后烘，并使用SU-8显影液进行显影。用N₂吹干晶圆2 用枪吹干，并在 200 °C 下硬烤晶圆 30 分钟。 
	注意：使用透明胶带将硅晶片模具固定在直径为15 cm的塑料培养皿上，图案面朝上。通常，我们在同一模具上放置多个相同的芯片结构，以便同时制备多个微流控芯片。每个模具可重复使用多次以制备微流控芯片。</li>
</ol>
2. 微流控芯片制备
<ol>
	<li>将一个洁净的称量舟放在天平上，并对天平进行去皮归零。向称量舟中倒入 50 g PDMS 基液。</li>
	<li>向称量舟中加入 5 g PDMS 固化剂（与 PDMS 基液的质量比为 1:10）。 
	注意：该用量基于使用直径为 15 cm 的培养皿和模具。若使用不同尺寸的培养皿，请相应调整试剂用量。</li>
	<li>使用一次性移液管搅拌 PDMS 基液和固化剂。从称量舟边缘开始，缓慢向内搅拌。充分搅拌数分钟，直至混合物中出现细小气泡；充分混合对 PDMS 的聚合至关重要。</li>
	<li>缓慢将混合物倒入培养皿中，确保混合物完全覆盖硅晶片模具。</li>
	<li>将培养皿放入真空环境中 10 分钟，以去除 PDMS 混合物中的所有气泡。若混合物表面仍有残留气泡，可用移液管吹除。</li>
	<li>将带有 PDMS 的硅晶片模具置于 75 °C 烤箱中孵育约 2 小时。</li>
	<li>小心地将聚合后的 PDMS 层从硅晶片模具上剥离，避免损坏模具结构。或者，使用单刃工业剃刀片，在图案周围保留至少 5 mm 的边缘，直接将 PDMS 从硅晶片模具上切割下来，然后轻轻剥离 PDMS 层。</li>
	<li>将 PDMS 层放置在实验台上，使图案面朝上。使用单刃工业剃刀片小心切割出单个芯片，每个芯片边缘需保留足够边距，以避免损伤结构。</li>
	<li>保持图案面朝上，使用打孔笔（内径 0.75 mm）垂直穿过通道两侧的进样口和出样口圆圈打孔。 
	注意：这些孔将作为培养基流动的通道。因此，必须准确穿过圆圈，并完全穿透 PDMS 层。确保清除孔中的 PDMS 柱状物。</li>
	<li>再次将打孔针插入每个打好的孔中，检查孔的通畅性。确保针头能从另一侧穿出，表明无堵塞。在图案表面贴上透明胶带，然后轻轻撕下以清除灰尘颗粒。重复此步骤至少三次。最后在 PDMS 表面保留一块干净的透明胶带，以维持无菌状态。</li>
	<li>在 PDMS 的另一侧重复此操作，并同样保留最后一块胶带。</li>
	<li>准备一块尺寸为 24 mm × 30 mm、厚度为 0.13–0.17 mm 的盖玻片。喷洒 70% 乙醇于玻片表面，并用除尘纸擦干以实现表面灭菌；此外，也可用高压灭菌水清洗玻片后用除尘纸擦干。</li>
	<li>将盖玻片和 PDMS 转移至塑料培养皿中。从 PDMS 上移除透明胶带，并将图案面朝上放置。转移过程中避免接触图案表面。</li>
	<li>将塑料培养皿放入等离子体处理仪中。对 PDMS 和盖玻片进行氧气等离子体处理，使其表面具有亲水性，操作参数如下：处理时间 75 秒；气体流速 20 cc/min；压力 200；功率 100 W。</li>
	<li>小心地将 PDMS 放置在盖玻片上，使两个亲水表面（即等离子体处理时朝上的表面）相接触。确保 PDMS 与盖玻片之间无气泡存在。</li>
	<li>将 PDMS 芯片在 75 °C 烤箱中孵育至少 2 小时。 
	&#8203;注意：微流控结构不完善可能导致实验过程中液体泄漏至显微镜上。因此，需用镊子轻轻从 PDMS 边缘提起，检查 PDMS 与盖玻片之间的键合情况。轻微提起时 PDMS 不应与盖玻片分离，表明键合成功。</li>
</ol>
3. 实验准备
<ol>
	<li>准备导管。
	<ol>
		<li>在制备PDMS芯片前1天，分别将输入和输出导管浸入70%乙醇溶液中。</li>
		<li>用5 mL注射器吸取灭菌水以冲洗导管。将导管连接至注射器，用水冲洗每根导管。</li>
		<li>重复冲洗步骤至少3次，以清除残留的乙醇。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用10倍物镜的光学显微镜检查PDMS通道，确保结构完整且一致。用透明胶带将PDMS芯片固定在显微镜载物台上。 
	注意：在步骤2中应一次性制备多个芯片，以确保有备用芯片，尤其是在首次制作该装置时。</li>
	<li>用5 mL注射器吸取灭菌水，将注射器固定在注射泵上，并插入相应的输入和输出导管。设定清洗速度为750 µL/h，冲洗芯片约10分钟。在此期间，分支通道上的气泡应被冲洗掉；若仍有残留气泡，可手动调节流速以消除气泡。</li>
	<li>酵母样品准备。
	<ol>
		<li>将1 mL已制备的酵母样品（OD600 0.6–0.8）转移至两个1.5 mL微量离心管中，在3,000 × g条件下离心5分钟。</li>
		<li>吸除每管中的大部分上清液，并将剩余部分合并，形成0.5 mL样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>暂停注射泵，并将输入导管从PDMS芯片上取下。</li>
	<li>手动反转注射泵，使每个输入导管中吸入一小段空气泡（长度为1至2 cm）。继续操作，吸入酵母样品；空气泡将显示样品边界，并指示已吸入的样品量。 
	注意：避免将样品吸入注射器内。</li>
	<li>将输入导管重新插入PDMS芯片，并重启泵，以750 µL/h的速度加载细胞。</li>
	<li>保持注射泵运行10分钟，然后在显微镜下观察细胞加载情况；成功加载的标志是超过60%的悬垂柱下方捕获到细胞。</li>
	<li>切换至营养液，并将流速调整为400 µL/h，用于细胞培养。</li>
	<li>选择显微镜的观察位置。 
	注意：进行寿命测量时，使用40倍物镜的光学显微镜，每15分钟拍摄一次图像；进行荧光报告基因分析时，使用60倍油镜的荧光显微镜，每15分钟拍摄一次图像。</li>
</ol>

<ol><li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+of+individual+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li>
<li>Polymenis, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology%3A+High-tech+yeast+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell biology: High-tech yeast ageing.</a> Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275(2012).</li>
<li>Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+technologies+for+yeast+replicative+lifespan+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies.</a> Mech Ageing Dev. , (2016).</li>
<li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra,, Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li>
<li>Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+high-resolution+microscopic+observation+of+replicative+aging+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast.</a> J Vis Exp. (78), e50143(2013).</li>
<li>Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9364-9369 (2015).</li>
<li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/16/2/012/meta">Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.matsci.28.1.153">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+telomerase+inactivation+accelerates+aging+independently+of+telomere+length%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length.</a> Cell. 160 (5), 928-939 (2015).</li>
<li>Boy-Marcotte, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heat+shock+response+in+yeast%3A+differential+regulations+and+contributions+of+the+Msn2p%2FMsn4p+and+Hsf1p+regulons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons.</a> Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).</li>
<li>Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+principles+of+the+yeast+G1%2FS+switch%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Design principles of the yeast G1/S switch.</a> PLoS Biol. 11 (10), e1001673(2013).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

PDMS 装置需要 freshly 制备，否则在将管路插入装置时产生的气泡将难以去除。步骤 3.4 通过浓缩细胞来提高细胞加载效率，至关重要。为了提高实验通量，通常在同一块 PDMS 芯片上使用 4 至 6 个模块，并连接至独立运行的泵，以同时进行 4 至 6 个不同的实验（不同菌株或培养基成分）。
与传统的酵母复制衰老检测方法（使用显微解剖）相比，本文介绍的微流控方法更省力且耗时更短。此外，微流控装置能够对多种细胞或分子参数进行详细定量分析，包括细胞大小、细胞周期动态、细胞形态以及各种分子标记物。该微流控方法通过在PDMS微垫下固定母细胞，同时自动冲走子代细胞，从而实现高分辨率显微镜下的长期细胞追踪。
该装置采用柔软的PDMS微垫来捕获母细胞4，其基本结构与Huberts et al. 在其研究中描述的类似7。但在装置设计和实验方案上存在若干差异。本装置中更宽的PDMS垫允许部分新生子代细胞被捕获并进行分析（<s...

芽殖酵母是衰老研究中一种强大的模式生物。然而，传统的酵母寿命检测依赖于显微解剖，不仅劳动强度大，而且通量较低1,2此外，传统的显微解剖方法无法提供单个母细胞在衰老过程中各种细胞和分子特征的详细信息。微流控装置的发展使得测量酵母寿命以及追踪母细胞整个生命周期中的分子标记物和多种细胞表型成为自动化过程。3,4,5,6,7,8将酵母细胞载入微流控装置后，可在显微镜下通过自动延时成像进行追踪。借助图像处理工具，可提取多种细胞和分子表型特征。3,6,8包括寿命、大小、荧光报告基因、细胞形态、细胞周期动态 等等。其中许多信息难以甚至无法通过传统的显微解剖方法获得。自数年前成功开发以来，微流控装置已在酵母衰老研究中发挥重要作用3,4,6,7此后，多个研究团队相继发表了对早期设计的改进方案5许多酵母实验室已采用微流控装置进行相关研究。
在处于指数生长期的细胞培养物中，可供观察的衰老母细胞数量极少。因此，用于寿命测定的微流控装置的总体设计原则是保留母细胞并去除子代细胞。其中一种设计利用了酵母进行不对称细胞分裂的特性：装置中的结构可截留体积较大的母细胞，同时使较小的子代细胞被冲洗去除。本文所描述的微流控芯片采用柔软的聚二甲基硅氧烷（PDMS）垫（垂直悬柱）来捕获母细胞（图1）。类似设计的装置此前已有报道3,4,6,7。本实验方案采用更简化的微流控装置制备流程，以及一种优化后的细胞加载方法，适用于延时成像实验。微流控装置中的一个关键参数是用于捕获母细胞的PDMS垫的宽度。本装置采用更宽的PDMS垫，可在每个垫下保留更多的母细胞，其中包括大量新生母细胞，可对其整个生命周期进行追踪。除了寿命测定外，当需要对细胞进行多代追踪或必须完成整个生命周期观察时，本实验方案也适用于单细胞延时成像实验。

<table><tbody><tr><td>3'' &amp;lt;111&gt; 硅晶圆</td><td>Addison Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2000 和 3000 系列</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&amp;reg; 184 硅橡胶弹性体套件</td><td>ellsworth</td><td>2065622</td><td>包含 Sylgard&amp;reg; 硅橡胶弹性体基料和固化剂</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>VWR</td><td>391-1502</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-core&amp;trade; 打孔器（内径 0.75 mm）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29002513</td><td></td></tr><tr><td>24 mm × 40 mm SLIP-RITE&amp;reg; 盖玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>102440</td><td></td></tr><tr><td>3M Scotch 胶带</td><td>ULINE</td><td>S-10223</td><td></td></tr><tr><td>VWR&amp;reg; 剃刀刀片</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>纯乙醇，Koptec</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Whoosh-Duster&amp;trade;</td><td>VWR</td><td>16650-027</td><td></td></tr><tr><td>5 mL BD 注射器（鲁尔锁&amp;trade; 接头）</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>聚四氟乙烯标准壁管（100 英尺，AWG 规格：22，标称内径：0.028 英寸）</td><td>Component Supply Company</td><td>SWTT-22</td><td></td></tr><tr><td>针头套装</td><td>Component Supply Company</td><td>NEKIT-1</td><td></td></tr><tr><td>干燥器</td><td>HACH</td><td>2238300</td><td></td></tr><tr><td>实验室烘箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>13246516GAQ</td><td></td></tr><tr><td>尼康 TE2000 显微镜，配备 40X 和 60X 物镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蔡司 Axio Observer Z1，配备 40X 和 60X 物镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Longerpump</td><td>TS-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

利用微流控装置测量单个出芽酵母细胞的寿命和细胞表型

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

芽殖酵母 Saccharomyces cerevisiae 是衰老研究中的重要模式生物。遗传学研究已发现许多在不同物种间对寿命具有保守作用的基因。然而，衰老和死亡的分子机制仍不明确。为了系统性地理解酵母衰老背后的分子机制，我们需要高通量的方法来测量寿命，并在单细胞水平上量化各种细胞和分子表型。此前，我们开发了微流控装置，可在整个母细胞寿命期间对其进行追踪，同时冲走新生的子细胞。本文介绍了一种制备微流控芯片及建立微流控实验的方法。该装置可利用多个通道同时追踪不同条件下或不同酵母菌株的细胞。典型的实验设置可实现每个通道数百个细胞的追踪，并在整个细胞寿命期间进行高分辨率显微成像。我们的方法还可对单个细胞的寿命、分子标记物、细胞形态以及细胞周期动态进行详细表征。此外，我们的微流控装置能够捕获大量新生的母细胞，这些细胞可通过后续的图像分析加以识别，从而实现更高精度的寿命测定。

实验结束后，可以从记录的时间序列图像中提取细胞的寿命以及多种细胞和分子表型。由于可以从每个细胞中提取多种不同的特征，分析的第一步是对细胞和事件进行标注，包括细胞的位置与边界，以及所追踪的各种事件的发生时间，例如出芽事件。这些标注将有助于日后回溯同一组细胞并分析不同的特征。利用图像分析软件（如 ImageJ11）及其相关插件，可根据细胞的记录标注从图像数据中提取一系列表型信息。
以下是使用微流控装置测量表型的几个示例。通过计数每个被捕获的母细胞产生的芽体数量，并结合Kaplan-Meier估计法，可以获得酵母的寿命表型。最初被捕获在微流控装置中的细胞年龄未知。为了减少因这些未知年龄带来的寿命测量偏差，以往的方法采用被捕获细胞上芽痕的平均数量来校准寿命4,7。然而，芽痕的测量需要对细胞进行额外...

本文介绍了一种优化的实验方案，用于制造微流控芯片以及建立微流控实验，以测量单个酵母细胞的寿命和细胞表型。

芽殖酵母酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是衰老研究中的重要模式生物。遗传学研究已揭示了许多具有保守效应的基因……

本实验的总体目标是制备一种专用的微流控装置，并利用它来测量单个酵母细胞的寿命及其细胞表型。该方法有助于回答酵母衰老研究领域中的一些关键问题，例如：为何母细胞会衰老并死亡？哪些是导致细胞稳态丧失并最终引发细胞衰老与死亡的早期分子事件？该技术的主要优势在于，我们能够同时追踪母细胞、其寿命以及多种分子标记物，从而寻找与寿命相关联的分子事件。尽管该方法可为研究酵母衰老提供见解，也可应用于其他领域，例如监测需要对多代细胞进行检测的参与性次级反应。通常，初次接触该方法的研究者会遇到困难，因为微流控装置的制备、细胞加载以及显微镜的设置均需大量练习才能成功操作。事先对该方法进行演示至关重要，因为将酵母正确加载至微流控装置中具有较大难度。首先，按照随附文本方案中所述的标准技术制备用于该装置的硅晶片模具。将模具有结构的一面朝上放入一个15厘米的培养皿中。使用胶带将模具固定在培养皿上。接下来，将一个洁净的称量皿放在天平上，并对天平去皮归零。向称量皿中倒入 50 克 PDMS 基液，然后加入 5 克 PDMS 固化剂。使用一次性移液管搅拌 PDMS 基液和固化剂。从称量舟的边缘开始，缓慢向内移动。充分搅拌混合物数分钟，直至混合物中形成细小气泡。将混合物缓慢倒入培养皿中，使其完全覆盖硅晶片模具。然后将培养皿置于真空环境中10分钟，以去除PDMS混合物中的所有气泡。若取出后混合物表面仍有残留气泡，可用移液器吹除。接着，将器件在75摄氏度下烘烤2小时。当冷却至室温后，小心沿模具周围的PDMS切割，然后轻柔地将聚合后的PDMS层从硅片模具上剥离，避免对模具结构造成任何损伤。将PDMS层放置于实验台面，使带有图案的一面朝上。使用单刃工业剃刀刀片仔细切割出单个芯片，保留足够的边缘余量，以避免损伤芯片结构。将带有图案的一面朝上，使用打孔笔垂直穿过通道两侧的入口和出口圆圈进行打孔。通过再次将打孔笔针头插入每个孔中检查孔道是否通畅，确保针头能从另一侧穿出，表明无堵塞。接下来使用胶带清除顶面的灰尘颗粒和碎屑。此步骤至少重复三次，并在PDMS上保留一片干净的透明胶带，以维持无尘表面。然后将装置翻转，对PDMS的另一侧重复此操作。这一侧也留下最后一段胶带。现在准备一个玻璃表面作为装置的基底。选择一块尺寸为24毫米×30毫米、厚度在13至17毫米之间的盖玻片。用70%乙醇喷洒玻璃表面，再用除尘剂吹干以对表面进行灭菌。随后将盖玻片和PDMS转移至塑料培养皿中。去除PDMS上的透明胶带，将带有图案的一面朝上放置于培养皿中，避免接触其上表面。然后将培养板放入等离子体腔室中，对PDMS和盖玻片进行氧气等离子体处理，以使表面具有亲水性。随后将培养板从等离子体腔室中取出，并小心地将PDMS与盖玻片经等离子体处理后的表面相互贴合。确保PDMS与盖玻片之间无气泡。最后，将装置转移至烘箱中，在75摄氏度下烘烤至少两小时。在制备PDMS芯片前一天，将输入和输出管路浸入70%乙醇溶液中。第二天，用5毫升注射器吸取灭菌水，将每根管子套在注射器上，用水冲洗管子，对每根管子进行清洗。重复清洗步骤至少三次，以去除残留的乙醇。随后在光学显微镜下检查PDMS通道。使用10倍物镜确保结构一致且完整。用透明胶带将完整的PDMS芯片固定在显微镜载物台上。将装有无菌水的5毫升注射器连接至注射泵，并将相应的进样和出样管路插入装置中。将流速设置为每小时750微升，冲洗芯片约10分钟。观察通道，确保所有气泡被冲洗干净。若10分钟冲洗后仍有气泡残留，手动调节流速以去除气泡。将1毫升制备好的酵母样品转移至两个1.5毫升微量离心管中，在3,000 × g条件下离心5分钟。弃去每管中的大部分上清液，并将剩余部分合并，形成5毫升样品。酵母样品准备就绪后，从PDMS芯片上取下进样管。手动反转注射泵，使每个进样管吸入一段长度为1至2厘米的小气泡，然后吸入细胞培养物。然后将进样管重新插入PDMS芯片中，并重新启动泵，以750微升每小时的速度加载细胞。保持注射泵运行10分钟，随后在显微镜下观察细胞加载的进展情况。成功的加载应使超过60%的悬柱下方捕获到细胞。为了维持酵母细胞的生长，将注射器中的溶液更换为营养液，并将流速调整至每小时 400 微升。通过计数每个被捕获的母细胞产生的芽体数量，并估算 Kaplan-Meier 生存曲线，可获得酵母的寿命表型。使用本方案时，装置可频繁捕获已捕获细胞新分裂出的子代细胞。这些细胞随后会转变为新生的母细胞，可通过下游图像分析软件进行识别。这些新生的母细胞可提供更准确的寿命测量结果。在本实验中，新生母细胞的平均寿命略长，大约多出两个世代。除了出芽数量外，还可以从成像数据中提取连续两次出芽事件之间的时间间隔。随着细胞寿命接近终点，出芽频率会显著减慢，表明这些衰老细胞处于不健康状态。在进行该操作时，需注意使用新制备的芯片以避免产生气泡，同时可根据需要提高细胞浓度，以提升细胞加载效率。该技术开发后，为酵母衰老领域的研究人员探索导致衰老表型的早期分子变化铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备这种微流控装置，以及如何利用它来测量单个细胞的寿命和细胞表型。

using-microfluidic-devices-to-measure-lifespan-cellular-phenotypes

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用微流体装置来衡量寿命和细胞表型单芽殖酵母细胞

酵母的时序性衰老是指细胞在静止期随着时间推移而丧失活力的现象。本文介绍一种用于定量测定酵母时序性寿命的高通量方法。...

通过老化细胞的再生长定量酵母时序性寿命

本文介绍了一种测定酵母母细胞复制寿命的通用实验方案。...

测量芽殖酵母的复制寿命

本文介绍了一组DNA突变检测方法，这些方法可与酵母时序性寿命模型相结合，用于研究在衰老过程中调控或导致基因组DNA不稳定的基因/通路。...

使用 S. cerevisiae 时序寿命模型研究年龄依赖性基因组不稳定性

我们介绍一种简单的方法，用于制备微流控装置，可在无需洁净室或软光刻技术的情况下，对多种不同菌株施加类似的动态条件。...

一种用于研究多种不同菌株的微流控装置

本文介绍了一种微流控装置的操作方法，该装置可在单个出芽酵母细胞的整个复制和/或时间寿命过程中，实现连续、高分辨率的显微成像。...

芽殖酵母复制性衰老的连续高分辨率显微观察

我们提供了一种简单的实验方案，用于获取酵母细胞生长过程的荧光显微镜视频，以及一个基于图形用户界面的软件包，用于提取单细胞时间序列数据。该分析方法结合了自动化的谱系追踪与分裂时间分配，并整合了可视化检查及对追踪数据的手动校正。...

获取芽殖酵母荧光延时成像并利用GRAFTS分析单细胞动态

本方案介绍了用于原核微生物单细胞分析的微流控皮升级生物反应器（PLBR）的制备、装置搭建及基本操作。作为原理验证，对具有工业相关性的微生物进行了分析，从而获得了在特定时间段内的生长速率、形态特征及表型异质性等方面的深入信息，而这些信息采用传统方法极难实现。...

用于微生物单细胞分析的微流控皮升级生物反应器：制备、系统搭建与操作

我们介绍一种利用延时显微镜对酵母细胞在固体培养基上生长形成菌落过程中的单个细胞生长表型进行定量分析的方法，称为“单细胞倍增评估酵母活细胞阵列”（ODELAY）。该方法可直接观察并量化基因型相同的细胞在形成菌落过程中所表现出的群体异质性。...

ODELAY：一种用于酵母生长多参数定量分析的大规模方法

单细胞微流控分析 Bacillus subtilis

以下是一种通过增加拷贝数抑制子筛选来鉴定基因相互作用的实验方案，适用于酿酒酵母（Saccharomyces...

一种用于表征调控线虫时序性寿命遗传关联的抑制子筛选方法 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

学习使用微流体装置测量单芽殖酵母细胞寿命与细胞表型的方法。该技术可同时追踪母细胞寿命及分子标记，为研究细胞衰老机制提供重要工具。

利用微流控装置测量单个出芽酵母细胞的寿命和细胞表型

探索更多视频