Name: 基于β-酶的电导生物传感器检测技术在分子间相互作用中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 学习基于杂交β-内酰胺酶的电导生物传感器技术，用于检测抗体-抗原相互作用并测量质子释放。该方法比传统免疫传感器更快速、经济，适用于生物分子相互作用研究。

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作者感谢比利时瓦隆大区在SENSOTEM和NANOTIC研究项目框架内的资助，以及国家科学基金（F.R.S.-F.N.R.S）提供的财政支持。

1. 蛋白质样品制备
<ol>
	<li>按照我们之前的研究方法制备并纯化杂合蛋白BlaP-cAb-Lys315。将蛋白储存于50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，缓冲液组成为：8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4 和 0.24 g KH2PO4 溶解于800 mL蒸馏水中，在定容至1 L前将溶液pH调节至7.4。用滤膜过滤除菌处理蛋白溶液。</li>
	<li>配制鸡卵清溶菌酶（HEWL）储备液。将100 mg（40,000 单位/mg）市售HEWL溶解于10 mL磷酸盐缓冲液（PBS，见步骤&#160;2.1.1）中。使用孔径0.22 μm的滤膜过滤，对蛋白溶液进行除菌处理。</li>
</ol>
2. 生物传感器检测
<ol>
	<li>溶液与缓冲液的配制
	<ol>
		<li>通过将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4 和 0.24 g KH2PO4 溶解于 800 mL 去离子水中，配制 50 mM PBS。用 1 N HCl 或 1 N NaOH 将 pH 调至 7.4，再将溶液定容至 1 L。过滤除菌后，于 4 °C 保存。</li>
		<li>通过将 3 g 酪蛋白水解物溶解于 100 mL 上述配制的 PBS 中（见步骤&#160;2.1.1），配制封闭/饱和溶液。过滤除菌后，于 4 °C 保存。</li>
		<li>通过将 1 g 酪蛋白水解物溶解于 100 mL 上述配制的 PBS 中（见步骤&#160;2.1.1），配制结合溶液。过滤除菌后，于 4 °C 保存。</li>
		<li>通过将 100 μL Tween 20（100%）加入 100 mL 上述配制的 PBS 中（见步骤&#160;2.1.1），配制洗涤溶液（0.1% Tween - PBS）。于 4 °C 保存。</li>
		<li>通过将 1 mL Triton X-100（100%）加入 100 mL 上述配制的 PBS 中（见步骤&#160;2.1.1），配制电极预处理溶液（1% Triton X-100 - PBS）。于 4 °C 保存。</li>
		<li>通过将 26 g KCl 溶解于去离子水中并定容至 100 mL，配制电极再生溶液（3.5 M KCl）。过滤除菌后，于 4 °C 保存。</li>
		<li>通过将 0.29 g NaCl 溶解于去离子水中并定容至 1 L，配制 5 mM NaCl 溶液。过滤除菌后，于 4 °C 保存。随后，通过将 26.7 mg 苄青霉素溶解于 20 mL 5 mM NaCl 溶液中，配制检测溶液（4 mM 苄青霉素）。过滤除菌后，于 -20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>传感器的制备与再生 
	注：聚苯胺涂层传感器芯片由 P. Bogaerts 博士、S. Yunus 博士和 Y. Glupczynski 教授（比利时鲁汶天主教大学 - CHU Mont-Godinne）研发并慷慨提供。该传感器的描述以及用于合成这些传感器的聚苯胺电聚合方法详见其先前的研究工作17。简而言之，该系统采用可重复使用的传感器，包含八个独立芯片，通过传统的印刷电路板（PCB）技术制造。每个芯片由三个圆形电极组成：顶部为工作电极，聚苯胺在此电极上电化学合成；中间为参比电极；底部为对电极。参比电极和对电极均在碳层上使用固态 Ag/AgCl 银汞齐进行功能化处理。
	<ol>
		<li>将传感器尖端浸入含有 300 µL/孔电极预处理溶液（1% Triton X-100 - PBS，见步骤&#160;2.1.5）的 96 孔板孔中，进行 3 次清洗。每次清洗在室温下轻柔混匀 2 分钟。</li>
		<li>将传感器尖端浸入含有 300 µL/孔去离子水的 96 孔板孔中，于室温下轻柔混匀 2 分钟，以冲洗电极。</li>
		<li>将传感器尖端浸入含有 300 µL/孔再生溶液（3.5 M KCl，见步骤&#160;2.1.6）的 96 孔板孔中，在 4 °C 下过夜或在室温下处理 1 小时，以再生电极。</li>
		<li>将传感器尖端浸入含有 300 µL/孔磷酸盐缓冲液（见步骤&#160;2.1.1）的 96 孔板孔中，进行 3 次清洗。每次清洗在室温下轻柔混匀 2 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在传感器上进行结合实验
	<ol>
		<li>将 15 µL 用 PBS 配制的 40 µg/mL HEWL 溶液滴加至电极表面，使 HEWL 涂覆于电极的 PANI（聚苯胺）表面。于 4 °C 过夜或室温孵育 1 小时。</li>
		<li>将传感器芯片的电极部分浸入含有 300 µL/孔磷酸盐缓冲液（见步骤&#160;2.1.1）的 96 孔板孔中，进行三次电极清洗。每次清洗在室温下轻柔混匀 2 分钟。</li>
		<li>在电极表面滴加 50 µL 封闭溶液（见步骤&#160;2.1.2），以封闭电极。室温孵育 1 小时。随后按前一步骤所述清洗三次（见步骤&#160;2.3.2）。</li>
		<li>将 BlaP-cAb-Lys3 溶液用结合溶液（见步骤&#160;2.1.3）稀释至 20 µg/mL，并将 15 µL 该稀释液滴加至电极表面。室温孵育 10 分钟。抗原-纳米抗体反应完成后，使用洗涤溶液（见步骤&#160;2.1.4）按前述步骤清洗三次。随后用 PBS 冲洗电极一次（见步骤&#160;2.1.1）。</li>
		<li>检测时，通过铜电路部分将传感器芯片连接至数字万用表。然后，在正极电极上滴加 50 µL 检测溶液（见步骤&#160;2.1.7），在负极电极上滴加 50 µL 5 mM NaCl 溶液（见步骤&#160;2.1.7），以启动传感器响应。室温孵育 30 分钟，并使用数字万用表监测电导率。 
		注：该万用表由 P. Bogaerts 博士、S. Yunus 博士和 Y. Glupczynski 教授（比利时鲁汶天主教大学 - CHU Mont-Godinne）提供。该恒电位仪通过 USB 接口由计算机控制，可同时分析传感器上的八个不同芯片。Yunus 及其同事开发的软件17可生成实时曲线图，显示参比电极与样品电极之间的电导差随时间的变化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

在本研究中，我们介绍了一种利用 BlaP β-内酰胺酶作为载体蛋白对纳米抗体进行功能化的方法，并证明了可成功将所获得的杂合蛋白应用于电位传感器检测。与其它生物传感器检测方法相比，本工作的主要创新之处在于抗体部分与产生电信号的酶活性之间实现了共价偶联。这种所谓的蛋白质插入技术具有若干优势与局限性，将是本节讨论的重点。
杂合β-内酰胺酶技术的优势。
β-内酰胺酶是高效的酶 
影响生物传感器灵敏度和信噪比的最重要参数之一，是用于产生信号的酶活性。在此背景下，β-内酰胺酶具有多项优势：它们分子量小（≈29 kDa）、为单体结构、非常稳定，更重要的是，与其他用于电位型传感器检测的酶（如葡萄糖氧化酶、脲酶、脂肪酶、过氧化物酶或碱性磷酸酶）相比，具有更高的比活性和更高的催化转换速率20。基于上述所有原因，β-内酰胺酶是多种生物传感器检测中的首选酶类。
直接插入到 &#946;β-内酰胺酶可提高插入蛋白/结构域...

生物传感器是一类分析装置，它将生物分子相互作用与被称为换能器的物理或化学信号装置相结合1。所记录的信号可被解读并转换，用于监测固定化分子与游离分子之间的相互作用。大多数生物传感器使用抗体来检测分析物，例如激素或不同病原体标志物2。可采用多种传感器形式，包括基于质量、磁性、光学或电化学的生物传感器。其中，电化学生物传感器是使用最广泛的传感器之一，其功能是将结合事件转化为电信号。所有基于抗体的生物传感器的性能和灵敏度主要取决于两个关键参数：i）抗体的质量；ii）用于产生信号的系统的特性2。
抗体是高分子质量的二聚体蛋白（150–160 kDa），由两条重链和两条轻链组成。轻链与重链之间的相互作用主要通过疏水相互作用以及一个保守的二硫键来稳定。每条链均包含一个可变区，该区主要通过三个称为互补决定区（CDR1-2-3）的高变区与抗原相互作用。尽管该领域已取得诸多进展，但在低成本表达系统中大规模表达全长抗体仍面临挑战。例如, E. coli）常常导致不稳定且易聚集的蛋白质产生。因此，人们已设计出多种抗体片段，例如单链可变区片段3 （ScFvs ≈ 25 kDa）。它们由一条重链和一条轻链的可变区组成，通过一段合成的氨基酸序列共价连接。然而，由于这些片段会将其疏水区域的较大部分暴露于溶剂中，因此往往稳定性较差，并具有聚集倾向。4在此背景下，单链骆驼科抗体片段（称为纳米抗体或VHHs）似乎是ScFvs的理想替代物。这些结构域对应于骆驼科单链抗体的可变区。与传统抗体不同，骆驼科抗体不含轻链，仅包含两条重链。5因此，纳米抗体是能够以与传统抗体相似的亲和力结合抗原的最小单体抗体片段（12 kDa）。6此外，与其它全长抗体或抗体片段相比，它们具有更高的稳定性和溶解性。最后，由于其分子尺寸较小且互补决定区3（CDR3）环较长，能够识别隐蔽的表位并结合酶的活性位点。7,8如今，这些领域正受到广泛关注，并已被整合到生物传感器技术中。例如，Huang 等开发了一种基于纳米抗体的生物传感器，用于检测和定量人前列腺特异性抗原（PSA）9.
如上所述，生物传感器检测中的一个重要参数是用于产生电信号的系统的效率。因此，基于酶的电化学生物传感器受到越来越多的关注，并已广泛应用于医疗保健、食品安全和环境监测等多个领域。这类生物传感器依赖于酶对底物的催化水解反应来产生电信号。在此背景下，已有研究表明，与碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶等其他多种酶相比，β-内酰胺酶具有更高的特异性、更高的灵敏度以及更简便的实验操作性10。β-内酰胺酶是一类能够通过水解作用使细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性的酶。这类酶通常为单体结构，具有高度稳定性、高效性且分子量较小。此外，将功能结构域或多肽插入到β-内酰胺酶中可形成双功能嵌合蛋白，已被证明是研究蛋白质-配体相互作用的有效工具。事实上，近期研究显示，将抗体可变区片段插入TEM1 β-内酰胺酶后，所获得的嵌合蛋白仍能以高亲和力结合其靶抗原。有趣的是，抗原的结合被证实可诱导TEM1催化活性的变构调控11,12。此外，我们在多项研究中表明，将蛋白质结构域插入Bacillus licheniformis BlaP β-内酰胺酶的允许性环区，可生成功能性的嵌合蛋白，非常适合用于监测蛋白质-配体相互作用13,14。我们最近将一种名为cAb-Lys3的纳米抗体插入BlaP的这一允许性插入位点15。该纳米抗体被证实可结合鸡蛋清溶菌酶（HEWL）并抑制其酶活性16。我们发现，所构建的嵌合蛋白BlaP-cAb-Lys3对HEWL仍保持高特异性和高亲和力，同时其β-内酰胺酶活性未受影响。随后，我们将这种嵌合β-内酰胺酶技术与电化学生物传感器成功结合，证明所产生的电信号强度依赖于固定在电极上的BlaP-cAb-Lys3与HEWL之间的相互作用。事实上，BlaP对β-内酰胺类抗生素的水解会释放质子，该过程可被转化为定量的电信号。将嵌合β-内酰胺酶技术与电化学生物传感器相结合的方法具有快速、灵敏、定量以及可实时检测信号的优点。本文详细描述了该方法学。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000225&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1551128</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris&amp;ndash;HCl</td><td>Roche</td><td>10812846001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NIST2186II</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>丙氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>HClO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka</td><td>34288</td><td>1 M HClO4 溶液，经销商：Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>酪蛋白水解物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22090</td><td></td></tr><tr><td>青霉素钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0900000</td><td></td></tr><tr><td>鸡蛋清溶菌酶</td><td>Roche</td><td>10837059001</td><td></td></tr><tr><td>庚烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246654</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>氨水溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>380539</td><td>28% NH3&amp;nbsp;in H2O，经双重蒸馏纯化（浓？）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;实验室耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 孔板&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657165</td><td>CELLSTAR 6 孔板</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 计</td><td>WTW</td><td>1AA110</td><td>Lab pH 计 inoLab pH 7110</td></tr><tr><td>真空过滤系统</td><td>Nalgene</td><td>NALG300-4100</td><td>带接收瓶的滤器，经销商：VWR</td></tr><tr><td>电位传感器芯片</td><td></td><td></td><td>由 Yunus 及同事制备（参考文献 16）</td></tr><tr><td>PGSTAT30 Autolab</td><td>Metrohm Autolab</td><td></td><td>已停产，后继型号为 Autolab PGSTAT302N</td></tr><tr><td>数字万用表，METRAHit 22M</td><td>Gossen Metrawatt</td><td></td><td>已停产，后继型号为 Metrahit Base</td></tr></tbody></table>

基于β-内酰胺酶的导电生物传感器检测法用于检测生物分子相互作用

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

生物传感器正变得越来越重要，并已广泛应用于病原体检测、分子诊断、环境监测和食品安全控制等多个领域。在本研究中，我们利用β-内酰胺酶作为高效的报告酶，开展了多项蛋白质-蛋白质相互作用研究。此外，这类酶能够接受肽段或结构化蛋白质/结构域的插入，这极大地促进了其在构建嵌合蛋白中的应用。在最近的一项研究中，我们将一个单结构域抗体片段插入到Bacillus licheniformis BlaP β-内酰胺酶中。这些小型结构域也被称为纳米抗体，定义为骆驼科动物来源的单链抗体的抗原结合结构域。与常见的双链抗体类似，它们对其靶标具有高亲和力和高特异性。所获得的嵌合蛋白在保持β-内酰胺酶活性的同时，对其靶标表现出高亲和力，表明纳米抗体和β-内酰胺酶两个部分均保持功能完整。在本研究中，我们报道了一种详细的实验方案，将我们的杂合β-内酰胺酶系统与生物传感器技术相结合。通过检测酶催化活性所释放的质子引起的电导率变化，可实现对纳米抗体与其靶标特异性结合的检测。

BlaP-cAb-Lys3 嵌合蛋白的设计与构建
图1展示了将cAb-Lys3插入来自地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的A类β-内酰胺酶BalP的一个容许性环区。该插入位于Asp198和Lys199残基之间。在cAb-Lys3的两侧各引入了一个凝血酶切割位点。携带编码BlaP-cAb-Lys3嵌合蛋白的组成型表达质粒的细胞能够在低浓度氨苄青霉素存在下生长。该结果表明，这种嵌合β-内酰胺酶具有可溶性，正确折叠，并能成功分泌至细菌的周质空间，在其中有效提供对氨苄青霉素的抗性。我们进一步分析了该嵌合蛋白的双功能特性。如我们先前的研究报道，实验数据显示，该嵌合蛋白中的β-内酰胺酶部分以及cAb-Lys3部分均保留了其生物学活性15。
电导型生物传感器检测</p...

在本研究中，我们报道了一种基于杂合β-内酰胺酶技术的电导型生物传感器新方法，用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。该方法依赖于β-内酰胺水解过程中质子的释放。

生物传感器正变得越来越重要，并已广泛应用于病原体检测、分子诊断、环境监测等多个领域……

本阻抗生物传感器检测方法的总体目标是利用杂合β-内酰胺酶技术检测生物分子间的相互作用。我们描述了一种利用嵌合β-内酰胺酶蛋白检测抗体-抗原相互作用的方法。该方法的原理基于通过测定β-内酰胺酶活性所释放的质子来检测结合反应。与传统免疫传感器相比，该技术的主要优势在于使用了一种嵌合型β-内酰胺酶，通过杂交蛋白检测分析物，从而实现更廉价、更快速的传感检测。本实验操作将由研究生研究人员Mathieu Dondelinger进行演示。首先按照文本方案中的描述准备蛋白质样品和溶液。将电极的尖端浸入96孔板的孔中，每孔加入300 µL电极预处理溶液，在室温下轻轻混匀孵育2分钟，以完成可重复使用电极的制备。重复此步骤三次。然后，将电极尖端浸入含有去离子水的96孔板的孔中，每孔300微升，室温下轻轻混匀2分钟，以冲洗电极。为再生电极，将电极尖端浸入含有再生溶液的96孔板的孔中，每孔300微升，于4摄氏度下孵育过夜，或在室温下孵育1小时。然后，将电极尖端浸入含有磷酸盐缓冲液（PBS）的96孔板中进行三次洗涤，每孔加入300 µL PBS，每次洗涤在室温下轻柔混匀2分钟。通过在电极表面滴加15 µL浓度为40 µg/mL的磷酸缓冲液配制的鸡卵清溶菌酶（HEWL）溶液，将溶菌酶包被到聚苯胺电极表面。将电极在室温下孵育一小时。随后，将传感器芯片的电极部分浸入含有磷酸盐缓冲液的96孔板孔中，每孔加入300 µL磷酸盐缓冲液，进行三次洗涤。每次洗涤在室温下轻轻混匀，持续两分钟。在电极表面滴加30微升封闭液，使电极充分饱和。室温孵育1小时。随后，按前述方法洗涤三次。用结合缓冲液将BlaP-cAb-Lys3或BlaP溶液稀释至每毫升20微克。然后，取15微升稀释后的溶液滴加到电极上，在室温下孵育1小时。抗原与纳米抗体反应后，用洗涤液将电极洗涤三次。然后将传感器的电极浸入含有检测缓冲液的96孔板孔中（每孔300 µL检测缓冲液）进行洗涤，并在检测缓冲液中短暂孵育1分钟。检测时，将数字万用表连接至计算机，然后通过铜质电路部分将传感器芯片连接到数字万用表。在标记为正极的电极上施加50微升4毫摩尔的苄青霉素溶液，以启动传感器响应。在标记为阴性的电极上加入50微升检测溶液作为阴性对照。使用连接的数字万用表监测30分钟内的电导值。可在屏幕上实时查看数据，或以文本文件形式导出数字数据。这些原始数据可进行绘图，以生成随时间变化的参考电极与样品电极之间电导率变化的图形化输出结果。为构建嵌合蛋白，采用A类β-内酰胺酶BlaP作为载体蛋白。此处，催化残基以红色显示。位于溶剂暴露环上的插入位点以黄色标示。将名为 cAb-Lys3 的骆驼科抗体片段插入到 BlaP 中，获得的嵌合蛋白 BlaP-cAb-Lyse3 能够结合 HEWL，同时保留β-内酰胺酶活性。在加载BlaP-cAb-Lys3之前，将HEWL固定在聚苯胺编码电极上。固定化的嵌合蛋白催化苄青霉素水解时释放质子，从而引起电导率变化，用户可对此进行解读。传感器包含八个芯片，组织为四对。每个芯片包含三个电极：一个聚苯胺涂层的工作电极、一个参比电极和一个对电极。对于每一对芯片，标记为“negative”的芯片对应阴性对照，而标记为“positive”的芯片对应待测样本。图中显示的是导电性测量结果，表明BlaP-cAb-Lys3与HEWL之间的特异性相互作用。电导率的变化源于固定化的嵌合型β-内酰胺酶对抗生素水解所诱导释放的质子。对于阴性对照——天然β-内酰胺酶BlaP，则未检测到任何结合信号。一旦掌握该技术，在操作正确且实验条件优化的情况下，可在半天内完成实验。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为将抗体片段插入BlaP具有挑战性。在尝试该操作时，需要牢记所获得数据的质量取决于嵌合型β-内酰胺酶的功能活性。在完成该操作后，可进一步采用其他方法对检测到的相互作用进行定量分析，以确定该相互作用的平衡结合常数。该技术问世后，为免疫生物传感器领域的研究人员探索从生物体到各种环境样本中的分子相互作用开辟了道路。由于嵌合型β-内酰胺酶技术是一种多功能工具，可用于对主流中的任何抗体或蛋白质片段进行功能化修饰，该技术的应用前景广泛，可应用于多种生物分子的检测。因此，它有望被用于开发低成本、快速的诊断工具，广泛应用于人类健康和动物健康等多个领域。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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