基于β-内酰胺酶的导电生物传感器检测法用于检测生物分子相互作用

本阻抗生物传感器检测法的总体目标是利用杂合β-内酰胺酶技术来检测生物分子间的相互作用。我们描述了一种利用嵌合β-内酰胺酶蛋白检测抗体-抗原相互作用的方法。该方法的原理基于通过测定β-内酰胺酶活性所释放的质子来检测结合反应。

与传统免疫传感器相比，该技术的主要优势在于使用了一种嵌合型β-内酰胺酶，通过杂交蛋白来检测分析物，从而实现更廉价且更快速的传感检测。本实验操作将由研究生研究人员Mathieu Dondelinger进行演示。首先按照文本方案中的描述准备蛋白质样品和溶液。将电极的尖端浸入96孔板的孔中，每孔加入300 µL电极预处理溶液，在室温下轻轻混匀孵育2分钟，以完成可重复使用电极的制备。

重复此步骤三次。然后，将电极尖端浸入含有蒸馏水的96孔板的孔中，每孔300 µL，室温下轻轻混匀浸泡2分钟，以清洗电极。为再生电极，将电极尖端浸入含有再生溶液的96孔板的孔中，每孔300 µL，在4 °C下过夜或在室温下放置1小时。

然后，将电极尖端浸入含有磷酸盐缓冲液（PBS）的96孔板中进行三次洗涤，每孔加入300 µL PBS，每次洗涤在室温下轻柔混匀2分钟。通过在电极表面滴加15 µL浓度为40 µg/mL的磷酸盐缓冲液配制的溶菌酶（HEWL）溶液，将鸡蛋清溶菌酶包被到聚苯胺电极表面。

将电极在室温下孵育一小时。随后，将传感器芯片的电极部分浸入含有磷酸盐缓冲液的96孔板孔中，每孔加入300 µL磷酸盐缓冲液，进行三次洗涤。每次洗涤在室温下轻轻混匀，持续两分钟。

在电极表面滴加30微升封闭液，使电极充分饱和。室温孵育1小时。然后，按前述方法洗涤三次。

用结合缓冲液将BlaP-cAb-Lys3或BlaP溶液稀释至20微克/毫升。然后，取15微升稀释后的溶液滴加到电极上，在室温下孵育1小时。

抗原与纳米抗体反应后，用洗涤液将电极洗涤三次。然后将传感器的电极浸入96孔板的孔中，每孔含有300 µL检测缓冲液，进行缓冲液洗涤。随后短暂孵育一分钟。

检测时，将数字万用表连接至计算机，然后通过铜质电路部分将传感器芯片连接到数字万用表。在标记为正极的电极上施加50微升4毫摩尔的苄青霉素溶液，以启动传感器响应。

在标记为阴性的电极上加入50微升检测溶液，作为阴性对照。使用连接的数字万用表监测30分钟内的电导值。可在屏幕上实时查看数据，或以文本文件形式导出数字数据。

这些原始数据可以绘制成图形输出，以表示参考电极与样品电极之间电导率随时间变化的测量结果。为了构建嵌合蛋白，使用了A类β-内酰胺酶BlaP作为载体蛋白。此处，催化残基以红色显示。

位于溶剂暴露环中的插入位点以黄色标示。将名为 cAb-Lys3 的骆驼科抗体片段插入到 BlaP 中，获得的嵌合蛋白 BlaP-cAb-Lyse3 能够结合 HEWL，同时保留β-内酰胺酶活性。

在加载BlaP-cAb-Lys3之前，将HEWL固定在聚苯胺编码电极上。固定化的嵌合蛋白催化苄青霉素水解时释放质子，从而引起电导率变化，用户可对此进行解读。该传感器包含八个芯片，组织为四对。

每张芯片包含三个电极：一个涂覆聚苯胺的工作电极、一个参比电极和一个对电极。对于每一对芯片，标记为“negative”的芯片对应阴性对照，而标记为“positive”的芯片对应待测样本。此处显示的是电导测量结果，表明 BlaP-cAb-Lys3 与 HEWL 之间的特异性相互作用。

电导率的变化源于固定化的嵌合型β-内酰胺酶对抗生素水解所引发的质子释放。对于阴性对照——天然β-内酰胺酶BlaP，则未检测到任何结合信号。一旦掌握该技术，在操作正确且实验条件优化的情况下，可在半天内完成实验。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为将抗体片段插入 BlaP 具有挑战性。在尝试该操作时，需要牢记所获得数据的质量取决于嵌合型β-内酰胺酶的功能活性。在完成该操作后，可进一步采用其他方法对检测到的相互作用进行定量分析，以确定该相互作用的平衡结合常数。

该技术问世后，为免疫生物传感器领域的研究人员探索从生物体到各种环境样本中的分子相互作用开辟了道路。由于嵌合型β-内酰胺酶技术是一种通用工具，可用于对主流中的任何抗体或蛋白质片段进行功能化修饰，该技术的应用前景广泛，可应用于多种生物分子的检测。因此，它有望被用于开发廉价且快速的诊断工具，广泛应用于人类健康和动物健康等多个领域。