借助肽扫描技术鉴定单克隆抗体识别的线性B细胞表位

本方案的总体目标是利用序列截短的重组蛋白和点印迹杂交法进行肽段扫描，鉴定单克隆抗体识别的线性B细胞表位。该方法有助于解答有关抗原与抗体之间分子相互作用的关键问题。该技术的主要优点在于其操作简便和高效性。

随后可将鉴定出的表位用于更深入的研究，例如治疗和诊断应用。演示该实验操作的是我实验室的博士后陈建文（Chien-Wen Chen）。首先，在无血清杂交瘤培养基中培养RGM56小鼠单克隆杂交瘤细胞。

将细胞培养物置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下，在175 T培养瓶中进行培养。孵育五天后，待培养基变黄时收集培养液，并在4摄氏度下以4,500 × g离心30分钟。随后弃去沉淀的细胞碎片，获得含抗体的上清液。

接下来，将 2 毫升 50% 蛋白 G 琼脂糖浆液加入 5 毫升层析柱中，并用 10 毫升预冷的 PBS（pH 7.4）平衡树脂，洗涤体积相当于预装树脂体积的 10 倍。将 200 毫升先前制备的抗体溶液上样至已平衡的层析柱中，弃去穿流组分。使用 10 毫升预冷的 PBS 洗涤层析柱两次。

最后，为了从树脂中洗脱抗体，向柱中加入10毫升pH为2.7的毫摩尔浓度甘油溶液。将洗脱液以每管900微升收集至预先加入100微升10倍浓度中和缓冲液的微量离心管中。将纯化后的抗体保存于含叠氮化钠的50%甘油溶液中，置于-20摄氏度储存。

按照文本方案中的描述制备质粒并转化大肠杆菌BL21细胞。然后，挑取单个菌落接种于含有3毫升LB液体培养基（补充100微克/毫升氨苄青霉素）的15毫升离心管中，并将管盖松开。在37摄氏度、150 RPM振荡条件下培养菌液。

在600纳米波长下监测培养物的光密度。当光密度达到约0.6时，将培养物冷却至25摄氏度，然后加入IPTG至终浓度为0.4毫摩尔，以诱导重组蛋白的表达。

将培养物在25摄氏度、200转/分钟的条件下继续孵育四小时。孵育结束后，取一毫升细菌培养液转移至微量离心管中。在12,000 × g 条件下离心一分钟，弃去上清液。

使用移液器上下吹打，将细胞沉淀重悬于100微升变性缓冲液中。通过剧烈涡旋震荡充分混匀所得悬液，以获得可直接使用的重组蛋白样品。进行点印迹杂交前，将每种合成肽溶解于DMSO中，配制成10毫克/毫升的溶液。

然后，将PVDF膜在甲醇中活化2分钟，再用改良Towbin缓冲液平衡2分钟。用改良Towbin缓冲液冲洗一张层析滤纸，将平衡后的PVDF膜置于其上。静置至膜表面缓冲液完全消失。

使用10微升枪头，将每种肽或重组蛋白样品各2微升点加到膜上，并在空气中干燥10分钟。在膜上点样是本实验方案中最关键的步骤。将精确量的样品加载到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜的较小区域时，需要格外小心。

接下来，将膜置于含有5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中，室温下轻轻摇动孵育30分钟进行封闭。用含有5%脱脂奶粉的TBST缓冲液稀释RGM56单克隆抗体，并将抗体溶液加入膜中。

将膜在 37 摄氏度下孵育一小时，同时轻轻振荡。孵育结束后，移除抗体溶液，并用 TBST 缓冲液轻轻振荡洗涤膜两次，每次五分钟。

然后，将用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液稀释的二抗溶液加入膜中。在37摄氏度下轻轻振荡孵育一小时。孵育结束后，弃去抗体溶液，并用TBST缓冲液轻轻振荡洗涤膜两次，每次五分钟。

然后，在避光条件下，于室温下用底物溶液孵育膜15分钟。当信号出现后，用双蒸水洗涤膜以终止反应。将膜自然晾干后，使用成像系统采集点印迹图像。

最后，使用图像分析软件测量每个点印迹中各点的强度。此处展示的是全长的神经坏死病毒编码蛋白，包含第1至338位氨基酸，以及其系列截短突变体。为确认蛋白在转化细菌细胞中的表达，使用抗6XHis抗体进行点印迹分析，结果显示所有待研究的蛋白均成功表达。

随后，采用点印迹杂交分析重组蛋白，所用抗体为RG-M56单克隆抗体。分析结果显示，该抗体识别的蛋白表位位于第195至338位肽段。最后，通过肽段扫描鉴定出由20个或8个氨基酸残基组成的表位。

丙氨酸扫描显示，197 和 199 位缬氨酸残基以及 201 位半胱氨酸残基的取代完全消除了该表位与 RGM56 单克隆抗体的结合能力及点印迹杂交信号。结合强度分析同样观察到结合亲和力下降，证实所鉴定的残基对表位与 RGM56 单克隆抗体的结合至关重要。该肽段鉴定技术可用于开发治疗性肽类药物或肽类医药制剂。