Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

该方案的总体目标是使用连续截短的重组蛋白和通过点印迹杂交进行肽扫描来识别单克隆抗体识别的线性 B 细胞表位。这种方法可以帮助回答有关抗原和抗体之间分子相互作用的关键问题。这种技术的主要优点是它的简单性和效率。

然后，鉴定表位可用于更全面的研究，例如治疗和诊断应用。演示该程序的是我实验室的博士后Chien-温 Chen。首先，在杂交无血清培养基中培养 RGM56 小鼠单克隆杂交瘤细胞。

将细胞培养物保存在 175 T 培养瓶中，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳下。孵育 5 天后，收集变黄的培养基，并在 4 摄氏度下以 4， 500 倍 G 离心上清液 30 分钟。然后，丢弃沉淀的细胞碎片以获得溶液中的抗体。

接下来，向 5 mL 色谱柱中加入 2 mL 50% 蛋白 G Agro 浆液，并用 10 mL 冰冷的 PBS 平衡树脂，相当于 10 体积的预装树脂。将 200 mL 先前制备的抗体溶液上样到平衡柱上，丢弃通过色谱柱的馏分。使用 10 毫升冰冷的 PBS，洗涤色谱柱两次。

最后，要从树脂中搜集抗体，向色谱柱中加入 10 mL pH 值为 2.7 的毫摩尔甘油溶液。在微量离心管中收集 900 μL 馏分，该离心管之前填充有 100 μL 10X 中和缓冲液。将纯化的抗体储存在补充有叠氮化钠的 50% 甘油溶液中，温度为零下 20 摄氏度。

按照文本方案中的说明准备构建体并转化大肠杆菌 BL21 细胞。然后，将单个菌落转移到含有 3 毫升 LB 肉汤并补充每毫升 100 微克氨苄青霉素的 15 毫升试管中，并松散地盖上试管。在 37 摄氏度下以 150 RPM 振荡孵育培养物。

监测 600 纳米培养物的光密度。当达到 0.6 左右时，将培养物冷却至 25 摄氏度。然后，添加终浓度为 0.4 毫摩尔的 IPTG 以诱导重组蛋白的表达。

将培养物在 25 摄氏度下以 200 RPM 的转速振荡再孵育 4 小时。孵育后，将 1 毫升细菌培养物转移到微量离心管中。将细胞以 12， 000 倍 G 离心 1 分钟，弃去上清液。

用微量移液管上下移液，将细胞沉淀重悬于 100 微升变性缓冲液中。并通过剧烈涡旋混合所得悬浮液，以获得即用型重组蛋白样品。为了进行斑点印迹杂交，将每种合成肽溶解在 DMSO 中，以获得 10 毫克/毫升的溶液。

然后，在甲醇中活化 PVDF 膜 2 分钟，并用改良的 Towbin 缓冲液再平衡 2 分钟。用改良的 Towbin 缓冲液冲洗一张色谱纸，然后将平衡的 PVDF 膜放在上面。让膜静置，直到缓冲液从其表面消失。

使用 10 μL 吸头，将每种肽或重组蛋白样品加入 2 μL 到膜上，并风干 10 分钟。在膜上发现符号是该方案中最关键的步骤。需要特别注意将精确量的样品加载到 PVDF 膜的小区域上。

接下来，在添加 5% 脱脂牛奶的 TBST 缓冲液中，在室温下轻轻摇动，封闭膜 30 分钟。在补充有 5% 脱脂牛奶的 TBST 缓冲液中稀释 RGM56 单克隆抗体。并将抗体溶液加入膜上。

将膜在 37 摄氏度下孵育 1 小时，同时轻轻摇晃。孵育后，去除抗体溶液。并在 TBST 缓冲液中洗涤膜两次，轻轻摇动 5 分钟。

然后，将用 TBST 缓冲液和 5% 脱脂牛奶稀释的二抗溶液添加到膜中。将膜在 37 摄氏度下孵育 1 小时，同时轻轻摇动。孵育后，弃去抗体溶液，在 TBST 缓冲液中洗涤膜两次，轻轻摇动 5 分钟。

然后，在室温下用底物溶液在黑暗中显影膜 15 分钟。当信号出现时，用双蒸水洗涤膜以终止反应。风干膜后，使用成像系统捕获斑点印迹图像。

最后，使用图像分析软件测量每个点印迹的强度。这里展示的是全长神经坏死病毒密码蛋白，包括氨基酸 1 到 338 及其连续截短的变体。为了确认转化的细菌细胞中蛋白质的表达，使用抗 6XHis 抗体进行斑点印迹分析，显示存在所有正在研究的蛋白质。

然后，通过使用 RG-M56 单克隆抗体的斑点杂交分析重组蛋白。分析显示，抗体识别的蛋白质表位存在于肽 195 至 338 中。最后，通过肽扫描鉴定出由 20 或 8 个氨基酸残基组成的表位。

丙氨酸扫描显示，缬氨酸残基在 197 和 199 位点以及胱氨酸在 201 位的取代消除了表位的结合能力和斑点印迹杂交。同样，在结合强度分析中观察到结合亲和力降低，证实鉴定的残基对于表位与 RGM56 单克隆抗体的结合至关重要。这种肽鉴定技术可用于开发治疗性肽药物或肽药物。