使用基于酶的生物传感器来衡量进补和阶段性谷氨酸在阿尔茨海默氏症小鼠模型

在这里，我们描述了用于测量补药和采用酶联微电极阵列（MEA） 在体内阶段性细胞外谷氨酸的变化的空间和时间上精确的方法的设置，软件导航，和数据分析。

该程序的总体目标是使用酶联微电极阵列测量体内强直和阶段性细胞外谷氨酸变化。这种方法可以帮助回答神经科学领域的关键问题，例如细胞外神经递质水平和神经递质释放和清除的快速动力学在疾病状态下是否会改变。这项技术的主要优点是微电极阵列可以测量离散大脑区域内的特定神经递质变化，使其成为一种空间和时间上精确的方法，同时具有最小的侵入性。

演示该程序的是我实验室的 Holly Hunsberger 和 Ryan Heslin。要开始此过程，请在 MEA 上用所需的酶包被一对记录位点，用无活性蛋白质基质包被另一对记录位点。然后，使用 10 微升 Hamilton 注射器吸取谷氨酸氧化酶或蛋白质基质。

轻轻按压柱塞，在注射器尖端分配一小滴溶液。为了靶向 MEA 记录位点，在解剖显微镜下，通过将记录位点与代表一层的溶液液滴短暂接触，将溶液应用于适当的记录位点。在涂布到记录部位之间设置一分钟的计时器。

现在，将参比电极穿过塑料臂上的开口。将参比电极放入含有 PBS 的烧杯中，并确保它不接触烧杯底部。接下来，将参比电极连接到头部平台，并将 MEA 连接到电镀到头部平台的 mPD。

将 MEA 放入溶液烧杯中，使只有 MEA 尖端浸没在溶液中。请勿将 MEA 吸头浸入黑色气泡以外的液体中。这样做可能会损坏 MEA。

然后，选择桌面上的电镀图标。在电镀工具菜单中，验证是否输入了正确的设置。之后，选择 exit software 完成电镀。

校准前，用去离子水冲洗镀 mPD 电极尖端并存放 24 小时。在此过程中，打开 37 摄氏度的加热垫并将头部载物台连接到录音控制系统。然后，将 MEA 吸头插入 40 毫升搅拌的 0.5 摩尔 PBS 中。

接下来，将参比电极连接到头部载物台。轻弹参比电极尖端以确保没有气泡。之后，打开录制程序，确保设置正确，选择 MEA 编号，然后单击 校准，然后按开始。

等待 5 到 10 分钟进行平衡，并在基线稳定后开始校准。接下来，选择 Baseline 并添加 500 μL 抗坏血酸。然后，一旦电流达到新的稳定平台，请选择 干扰。

如果 MEA 电镀正确，则不应观察到任何变化。接下来，加入 40 微升 20 毫摩尔 L-谷氨酸。一旦电流达到新的稳定平台，将第一次添加标记为分析物。

重复 3 次，总共添加 3 次谷氨酸。然后，加入 40 微升多巴胺。并选择 Test Substance。

随后，加入 40 微升过氧化物。选择 Test Substance 并在校准完成后单击停止按钮。在此步骤中，将微量移液器放在所有四个铂金记录位点的中央，并使用粘性蜡和造型粘土将其安装在 MEA 上方 50 至 100 微米处。

使用 DC 适配器，将红色正极线夹在金引脚侧准备好的银线上，将黑色负极线夹在铂浴阴极上。接下来，插入 DC 适配器并寻找正确的电镀工艺。浴电极上应出现气泡，参比电极应变为银灰色。

在此过程中，将动物放入立体定位装置中，并使用耳杆稳定其头部。确保动物被固定并且头部不移动。然后，使用无菌棉签涂抹眼药膏。

之后，用修剪器剃光头。并使用小手术剪刀去除耳朵附近的皮毛。随后，将碘酒和酒精交替涂抹在头皮上 3 次。

在此之后，在头皮中间切开一个并铺开皮肤。用无菌棉签吸收任何血液，并涂抹过氧化氢以促进前囟和 lambda 的出现。通过测量前囟和 lambda 的背腹和内侧，确保头部位置正确。

将 pregma 处的坐标设置为零，并标记目标坐标。接下来，在标记周围钻取。然后，将 MEA 连接到头部载物台。

用第一个所需的溶液回注移液器。确保在没有溶液的移液器上留出间隙，以便检查被排出的溶液。然后，将管路连接到玻璃微量移液器上。

找到附加了 MEA 的前堟，并将坐标设置为零。将 MEA 移动到所需的坐标并慢慢降低 MEA，直到尖端接触到大脑。接下来，将背腹坐标归零，然后慢慢将 MEA 降低到大脑中。

将参比电极放置在远离 MEA 的位置，使其仍与大脑保持液体接触以完成电路。在记录程序上，单击所需的校准电极，然后单击执行实验开始记录。获得稳定的基线后，将压力喷射器设置为 0.6 秒和 0.5 psi，然后按下压力喷射器上的红色按钮进行喷射。

记录进样板上移动的时间和压力以及体积刻度，并在必要时进行任何记录。之后，用连接微量移液器的 MEA 取出，用去离子水冲洗，然后在 PBS 中浸泡过夜，直到所有血液消失。在海马体的 CA3 和 CA1 区域，载体处理的 TauP301L 小鼠的强直谷氨酸水平显着增加，这种影响因利鲁唑处理而减弱。

在这里，CA3 中氯化钾诱发谷氨酸释放的基线匹配代表性记录显示利鲁唑治疗减弱了在载体-TauP301L 小鼠中观察到的谷氨酸释放幅度的显着增加。氯化钾的局部施用导致细胞外谷氨酸的强劲增加，并迅速恢复到强直水平。用利鲁唑处理减弱氯化钾局部施用后，在载体处理的 TauP301L 小鼠中观察到的氯化钾显着增加，诱发谷氨酸释放。

海马的这个甲酚紫染色切片证实了 MEA 轨迹在 CA3 和 CA1 中的位置。在尝试此过程时，请务必记住手稿中列出的故障排除步骤。例如，为了减少嘈杂的信号，请记住将系统接地并及时按照步骤作。