利用基于酶的生物传感器测量阿尔茨海默病小鼠模型中的紧张性和时相性谷氨酸

本实验的总体目标是利用酶联式微电极阵列在活体中测量谷氨酸的紧张性与时相性细胞外浓度变化。该方法有助于回答神经科学领域的一些关键问题，例如在疾病状态下，细胞外神经递质水平以及神经递质释放与清除的快速动态过程是否发生改变。该技术的主要优势在于，微电极阵列能够测量特定脑区内的特异性神经递质变化，因而具有较高的空间和时间分辨率，同时具备微创性。

本实验操作将由我实验室的 Holly Hunsberger 和 Ryan Heslin 演示。开始该操作时，先用所需的酶包被 MEA 上的一对记录位点，再用非活性蛋白基质包被另一对记录位点。然后，使用 10 微升 Hamilton 注射器吸取谷氨酸氧化酶或蛋白基质。

轻轻按压活塞，在注射器尖端挤出少量液滴。在解剖显微镜下，将液滴短暂接触MEA记录位点，使溶液覆盖目标记录位点，此过程形成一层。每次涂覆记录位点后，设置计时器，间隔一分钟再进行下一次涂覆。

现在，将参比电极从塑料臂的开口处穿过，然后将其放入盛有 PBS 的烧杯中，并确保电极不接触烧杯底部。接着，将参比电极连接至前置放大器头级，并将MEA连接至头级上的mPD板。

将MEA放入盛有溶液的烧杯中，确保只有MEA的尖端浸入溶液。不要将MEA尖端浸入液体中超过黑色气泡部分，否则可能会损坏MEA。

然后，选择桌面上的电镀图标。在电镀工具菜单中，确认已输入正确的设置。随后，选择退出软件以完成电镀过程。

用去离子水冲洗mPD镀膜的电极尖端，并在校准前存放24小时。在此步骤中，打开37摄氏度的加热板，并将前置放大器连接到记录控制系统。然后，将MEA尖端插入40毫升搅拌中的0.5摩尔PBS溶液中。

接下来，将参考电极连接到头级放大器。轻弹参考电极尖端，确保无气泡存在。然后，打开记录程序，确认设置正确，选择MEA编号，点击校准，然后按开始。

平衡5到10分钟，待基线稳定后开始校准。接着，选择“基线”，加入500微升抗坏血酸。然后，待电流达到新的稳定平台期后，选择“干扰物”。

如果MEA电镀良好，则不应观察到任何变化。接着，加入40微升20毫摩尔的L-谷氨酸。待电流达到新的稳定平台后，将第一次加入标记为分析物。

重复三次，共进行三次谷氨酸添加。然后，加入 40 µL 多巴胺。并选择测试物质。

随后，加入 40 µL 过氧化氢。校准完成后，选择测试物质并点击停止按钮。在此步骤中，将微量移液器置于四个铂金记录位点的中央，并使用粘性石蜡和油灰将其固定在 MEA 上方 50 至 100 µm 处。

使用直流适配器，将红色正极导线夹在金针一侧已准备好的银丝上，将黑色负极导线夹在铂金浴阴极上。接着，插入直流适配器并观察是否出现正确的镀层过程。此时，电解浴电极处应有气泡产生，参比电极应变为银灰色。

在此操作中，将动物置于立体定位仪中，并使用耳杆固定其头部。确保动物已固定稳妥，头部不会移动。然后，使用无菌棉签涂抹眼药膏。

随后，使用修剪器剃除头部毛发，并用小型手术剪刀去除耳部周围毛发。接着，交替使用碘酒和酒精对头皮进行三次消毒。

随后，在头皮中部做一切口并分开皮肤。用无菌棉签吸去血液，并涂抹过氧化氢以清晰暴露前囟和后囟。通过测量前囟和后囟的背腹向和内外侧位置，确保头部处于正确位置。

将前囟处的坐标设为零，并标记目标坐标。接着，在标记周围钻孔。之后，将多电极阵列（MEA）连接至头端放大器。

用第一种所需溶液回填移液管。务必在移液管中留出一段无溶液的空隙，以便观察排出的溶液。然后，将管路连接到玻璃微移液管上。

在 MEA 附着的情况下找到前囟，将坐标设为零。移动 MEA 至目标坐标，缓慢降低 MEA，直至其尖端接触脑组织。接着，将背腹向坐标归零，然后缓慢将 MEA 插入脑内。

将参考电极放置在远离MEA的区域，但仍需保持其与脑组织液相接触，以完成电路。在记录程序中，点击选定已校准的电极，然后点击“开始实验”以启动记录。获得稳定基线后，将压力喷射仪设置为0.6秒和0.5 psi，按下压力喷射仪上的红色按钮进行喷射。

在注射记录表上记录时间、压力以及注射器移动的体积刻度，必要时添加备注。随后，用移液器取下MEA，用去离子水冲洗，并在PBS中浸泡过夜，直至血液完全清除。在海马体的CA3和CA1区域，经溶媒处理的TauP301L小鼠的张力性谷氨酸水平显著升高，而利鲁唑治疗可减弱该效应。

在此，基础状态下匹配的代表性记录显示，在CA3区，氯化钾诱导的谷氨酸释放经利鲁唑处理后，TauP301L小鼠溶剂对照组中观察到的谷氨酸释放幅度显著增加被减弱。局部应用氯化钾可引起细胞外谷氨酸水平显著升高，并迅速恢复至基础张力水平。在TauP301L小鼠中，经溶剂处理后，局部应用氯化钾在DG、CA3和CA1区均观察到氯化钾诱导的谷氨酸释放显著增加，而利鲁唑处理可减弱该效应。

该海马体的焦油紫染色切片证实了多电极阵列（MEA）在CA3和CA1区的走行位置。在实施该操作过程中，需牢记文稿中列出的故障排除步骤。例如，为减少噪声信号，务必对接地系统进行检查，并及时按步骤操作。