用于组织特异性细胞培养与递送的细胞外基质来源泡沫及微载体的制备

本方案的总体目标是辅助测定由组织特异性细胞外基质（ECM）制备的、未经化学交联的泡沫或多孔微载体的尺寸，用于三维体外细胞培养模型，或作为细胞递送系统中的促再生支架。该方法有助于回答应用细胞生物学和组织工程领域中的关键问题，例如三维细胞微环境如何介导细胞功能与组织再生。该技术的主要优势在于，能够制备出几何结构可调、模拟天然组织特异性ECM成分的支架，并且在长期培养中保持稳定，无需额外交联。

根据文本方案将组织来源的细胞外基质（ECM）冻干后，使用锋利的手术剪将脱细胞组织精细剪碎。为进行冷冻研磨，取25毫升不锈钢研磨室（用于实验室球磨系统），装入剪碎的冻干ECM，并加入两个10毫升的不锈钢研磨球。将装好的研磨室封闭后完全浸入液氮中，持续三分钟。

然后以30赫兹的频率研磨冷冻样品3分钟。重复将样品浸入液氮并进行研磨，直至细胞外基质（ECM）被研磨成细粉。称取250毫克切碎或冷冻研磨后的细胞外基质（ECM），转移至15毫升离心管中。

向离心管中加入5毫升22摩尔的NaH2PO4缓冲液，并在管上标记液面位置。然后，通过将7.5毫克α-淀粉酶加入1毫升22摩尔的NaH2PO4缓冲液中，制备α-淀粉酶储备液。接着，向样品中加入100微升α-淀粉酶储备液。

然后加入22摩尔的NaH2PO4，使最终体积达到10毫升。在300转/分钟和室温条件下持续振荡悬浮液72小时。在1500 × g下离心10分钟。

小心收集并弃去上清液，注意不要扰动已消化的细胞外基质沉淀。然后加入10毫升用双蒸水稀释的5% NaCl溶液，重悬沉淀物，并在300 RPM条件下持续振荡10分钟。重复洗涤两次后，使用10毫升双蒸水重悬沉淀。

然后在室温下以300 RPM持续振荡悬浮液10分钟。再次离心样品后，小心收集并弃去上清液，避免扰动已消化的ECM沉淀。加入2摩尔乙酸至5毫升刻度线。

然后涡旋振荡。接着将悬浮液在37摄氏度、120转/分钟条件下持续振荡过夜。次日，使用配备10毫米宽锯齿探头的手持式匀浆器，在室温下以10秒为间隔反复匀浆细胞外基质（ECM）悬浮液，直至无可见碎片残留。

在匀浆间隔期间，将悬液置于盛有冷水的烧杯中，以防止过热。将细胞外基质（ECM）悬液在37摄氏度下孵育，并以120转/分钟持续振荡，直至悬液变暖。然后使用2 mol/L乙酸将样品悬液稀释至所需浓度。

使用3毫升注射器和18号针头，将ECM悬液注入所需模具中。根据模具的形状，可制备出多种几何形态的泡沫材料。盖好模具后，在-20或-80摄氏度下冷冻。

然后将模具放入冻干机瓶中。将瓶子连接到实验室冷冻干燥系统，干燥24小时或直至完全干燥。将 cryomilled ECM 悬液在100 RPM条件下持续振荡孵育过夜。

将三毫升 ECM 悬液加入三毫升鲁尔锁型注射器中，并将带翼输液装置连接到注射器的针筒口。将注射器固定在注射泵内。然后将针头固定在铁架台上，使针尖垂直朝下，距离低型杜瓦瓶顶部四至六厘米。

接下来，将一个鳄鱼夹电极连接到针尖上，并确保该鳄鱼夹连接至高压电源的正极端。将一条铝箔折叠在真空烧瓶的边缘上，然后将第二个鳄鱼夹电极连接到铝箔的外缘。

将其连接至电源的接地端。向杜瓦瓶中加入液氮，液面距瓶口约一厘米，使金属箔的四分之三浸入液氮中。然后将注射泵的输注速率设置为每小时30毫升，并按照文本协议对样品进行电喷雾处理。

输注完成后，小心倒出杜瓦瓶中多余的液氮，留下约25毫升液氮悬浮微载体，以确保其保持冷冻状态。立即通过一次顺畅的倾倒动作，将微载体连同液氮转移至50毫升离心管中。然后使用刮勺收集杜瓦瓶中残留的冷冻微载体。

将它们一同加入离心机。为准备冻干，用带有小孔的铝箔覆盖离心管。将盖好铝箔的离心管放入冻干机瓶中。

然后立即将烧瓶连接至冻干机，过夜干燥样品。轻轻将冻干后的泡沫转移至含有过量无水乙醇的50毫升离心管中。同样，在用于收集的原始离心管中，用过量无水乙醇重新悬浮冻干的微载体。

使用移液管，将微载体通过具有特定孔径的不锈钢筛网过滤至新的50毫升离心管中，以去除任何聚集体并筛选出所需尺寸范围的微载体。将样品在4摄氏度下孵育4小时，或直至泡沫或微载体沉降至离心管底部。随后，在超净工作台内采用无菌操作技术，使用移液管从支架中移除无水乙醇，并加入过量用无菌PBS稀释的95%乙醇。

将支架置于 4°C 条件下孵育 4 小时，或直至支架完全沉降至再水化容器底部。通过梯度乙醇溶液逐步对支架进行再水化。每一步均需在 4°C 条件下孵育支架，直至其沉降至容器底部后，再更换下一种溶液。

用无菌 PBS 替换以进行额外两次冲洗，以去除残留的乙醇。将样品储存在 100% 无菌 PBS 中，置于 4 摄氏度条件下，直至准备进行细胞培养。在重新水化后的一至两周内使用支架。

图中展示了利用脱细胞脂肪组织、猪脱细胞真皮组织以及猪脱细胞左心室组织作为细胞外基质（ECM）来源所制备的ECM衍生泡沫材料和微载体的示例，表明该技术可应用于多种脱细胞组织，以生成具有组织特异性的生物支架。

在进行冷冻研磨或切碎、酶消化和匀浆处理后，可将样品分装至容器中，再进行冷冻和冻干。该图展示了在48孔组织培养板模具中制备的再水化DAT、DDT和DLV研磨泡沫。这些DAT、DDT和DLV泡沫采用浓度为35毫克/毫升的冷冻研磨ECM制备，冷冻温度为-80摄氏度。

为了利用电喷雾技术制备来源于细胞外基质（ECM）的微载体，针对每种ECM来源的悬浮液浓度，可通过调节针头规格、输注速率和电压，以生成直径在350至500微米范围内的离散球形微载体，随后进行可控再水化。最后，通过扫描电镜（SEM）显示的DAT、DDT和DLV微载体表明，其超微结构的尺寸可能因去细胞化ECM来源的不同而有所差异。本视频中介绍的方法可用于制备多种由纯的、未经化学交联的ECM构成的组织特异性微载体和泡沫材料，其基质来源为去细胞化组织。

通过上述步骤，可在静态或动态条件下将细胞接种于泡沫材料和微载体上，并可将其作为细胞诱导性基质用于体外细胞培养及体内应用。