Name: 细胞外基质衍生的泡沫和微载体如组织特异性细胞培养和交付平台的制造 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 学习利用脱细胞组织通过冷冻研磨和电喷雾技术制备无化学交联的细胞外基质泡沫和微载体，用于三维细胞培养和组织工程研究。该方法可构建具有可调几何结构的仿生支架。

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加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）和加拿大卫生研究院（CIHR）为本研究提供了资助。作者谨此感谢Amin Rizkalla博士提供其静电喷雾系统，感谢西安大略大学纳米制造中心提供扫描电镜成像设备的使用，感谢Mount Brydges屠宰场提供猪组织样本，以及感谢Aaron Grant博士、Brian Evans博士和Robert Richards博士在本研究中提供的临床合作支持。

1. 脱细胞组织处理
<ol>
	<li>脱细胞化与冷冻干燥
	<ol>
		<li>按照既定方案对目标组织进行脱细胞化处理。 
		注意：本研究中的支架是依据已发表的人类深部肌腱组织（DAT）28、猪深部真皮组织（DDT）8 和猪深部脂肪组织（DLV）32 的脱细胞化方案制备的。也可使用市售的不溶性胶原蛋白来制备泡沫或多孔微载体，例如来源于牛肌腱的胶原蛋白，在10 - 50 mg/mL浓度范围内已成功应用。其他来源的不溶性胶原蛋白也可使用，但可能需要优化以确定能够形成稳定支架的浓度范围。</li>
		<li>用镊子将水合状态的脱细胞化组织或纯化的胶原蛋白转移至50 mL离心管中，并加入足量的双蒸水（ddH2O）浸没组织，总体积最多为35 mL。</li>
		<li>将样品在-80 °C下冷冻过夜，离心管应水平放置，以在后续冷冻干燥过程中最大化升华表面积。</li>
		<li>取下离心管盖，将冷冻样品转移至冷冻干燥瓶中。</li>
		<li>使用实验室冷冻干燥机对样品进行冷冻干燥，持续48 - 72小时，或直至完全干燥。 
		注意：干燥时间可能因不同的冷冻干燥设备和脱细胞化组织类型而异。</li>
		<li>使用锋利的手术剪将冻干的细胞外基质（ECM）精细剪切成小块（约1 - 2 mm3）。</li>
		<li>将剪碎的ECM储存于干燥器中，待后续处理时使用。 
		注意：建议立即使用剪碎的ECM，以防止其从环境中吸收水分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>低温研磨（泡沫制备可选步骤）
	<ol>
		<li>将剪碎的冻干ECM装入实验室球磨系统的25 mL不锈钢研磨腔中，并加入两个直径为10 mm的不锈钢研磨球。</li>
		<li>封闭研磨腔，并将其完全浸入液氮中3分钟。</li>
		<li>在30 Hz（1,800 rpm）条件下研磨冷冻样品3分钟。</li>
		<li>重复步骤1.2.2和1.2.3，直至ECM被研磨成细粉。 
		注意：所需重复次数可能因ECM来源不同而异。例如，DAT通常需要3次研磨循环才能获得细粉。</li>
		<li>用刮勺将粉末转移至玻璃小瓶中，密封后储存在干燥器中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ECM悬浮液的制备
	<ol>
		<li>称取250 mg剪碎的ECM（用于制备泡沫）或低温研磨后的ECM（用于制备泡沫或多孔微载体），转移至15 mL离心管中。分别参见步骤1.1.6和第1.2节以了解剪碎ECM和低温研磨ECM的制备方法。 
		注意：本方案旨在制备50 mg/mL的ECM悬浮液，适用于人类DAT、猪DDT和猪DLV。根据具体的ECM来源，可能在更高或更低的起始浓度下也能形成均匀悬浮液。</li>
		<li>向离心管中加入5 mL 0.22 M NaH2PO4（pH 5.4）缓冲液，并在管壁上标记液面位置。</li>
		<li>通过将7.5 mg α-淀粉酶溶于1 mL 0.22 M NaH2PO4（pH 5.4）缓冲液中配制α-淀粉酶储备液。取100 μL该储备液（含0.75 mg α-淀粉酶，相当于干组织质量的0.3% w/w）加入样品中，再用0.22 M NaH2PO4补足至终体积10 mL。</li>
		<li>在室温下以300 rpm持续振荡悬浮液72小时。</li>
		<li>在1,500 × g条件下离心10分钟。小心收集并弃去上清液，避免扰动已消化的ECM沉淀。将沉淀物重悬于10 mL用ddH2O稀释的5% NaCl溶液中。</li>
		<li>重复步骤1.3.5，共用ddH2O中的5% NaCl溶液清洗两次。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀物重悬于10 mL ddH2O中。</li>
		<li>在室温下以300 rpm持续振荡悬浮液10分钟。</li>
		<li>在1,500 × g条件下离心10分钟。小心收集并弃去上清液，避免扰动已消化的ECM沉淀。</li>
		<li>向步骤1.3.2中标记的5 mL刻度处加入0.2 M乙酸。</li>
		<li>在37 °C下以120 rpm持续振荡过夜。</li>
		<li>在室温下使用配备10 mm宽锯齿探头的手持式匀浆器，以每次10秒的间隔对ECM悬浮液进行匀浆处理，直至无可见碎片残留。每次匀浆间隔之间将样品置于冷水中冷却，以防过热。 
		注意：根据ECM来源的不同，可能需要用0.2 M乙酸进一步稀释以获得均一悬浮液。ECM悬浮液过度冷却可能导致黏度升高，影响匀浆效率。若观察到黏度增加，可将样品重新加热至37 °C后继续处理。</li>
		<li>在4 °C下储存，可用于后续泡沫或多孔微载体的制备，最长可保存一个月。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞外基质来源的泡沫材料制备
<ol>
	<li>将步骤 1.3.13 中获得的细胞外基质（ECM）悬液（切碎或冷冻研磨）在 37 °C、120 rpm 持续振荡条件下孵育，直至悬液变暖。</li>
	<li>用 0.2 M 乙酸将 ECM 悬液稀释至所需浓度。 
	注意：根据 ECM 来源不同，可在 10 - 100 mg/mL 范围内制备稳定的泡沫，其中 DAT、DDT 和 DLV 推荐使用 15 - 50 mg/mL 的浓度范围。通常，较高浓度下制备的泡沫孔隙略小，但在培养中更稳定，且更易于操作。</li>
	<li>使用带有 18 G 针头的 3 mL 注射器，以防止 ECM 悬液中产生气泡，将 ECM 悬液注入所需模具中。为制备 DAT、DDT 和 DLV 泡沫，向经细胞培养处理的 48 孔板中每孔加入 400 μL 浓度为 35 mg/mL 的 ECM 悬液。 
	注意：所选模具的形状和 ECM 悬液的体积将决定最终泡沫的几何形态。</li>
	<li>盖好模具，并通过将其置于 -20 °C 或 -80 °C 冰箱中过夜冷冻。 
	注意：冷冻温度可能影响泡沫的孔隙率。与 -80 °C 相比，在 -20 °C 冷冻时会形成更大的冰晶，从而产生更大的孔隙33。为制备具有均匀多孔结构的泡沫，应确保模具不与导热表面接触，以避免定向冷却。</li>
	<li>将含有冷冻样品的模具放入冻干机瓶中。将冻干机瓶连接至实验室冷冻干燥系统，并干燥 24 小时。 
	注意：在冻干前，样品必须始终保持冷冻状态。</li>
	<li>将冻干后的泡沫储存于干燥器中，直至使用。</li>
</ol>
3. 细胞外基质来源的微载体的制备 通过 电喷雾
注意：电喷雾装置的示意图见图2。
<ol>
	<li>将步骤 1.3.13 中获得的冻干 ECM 悬液孵育 37 °C 以100 rpm持续振荡过夜。 
	注意：使用冷冻研磨的细胞外基质（ECM）制备ECM来源的微载体，以确保悬液中微载体的更高均一性，并防止在电喷雾过程中发生堵塞。</li>
	<li>将3 mL ECM悬液加入3 mL鲁尔锁型注射器中，并将带翼输液器连接至注射器接口。 
	注意：可使用多种规格的针头，需注意针头的选择可能会影响所制备微载体的大小和形状。制备 DAT、DDT 和 DLV 微载体时，应使用 25 G 针头。</li>
	<li>将注射器固定在注射泵中。将针头固定在铁架台上，并调整针尖位置，使其垂直朝下，距离矮型杜瓦瓶顶部 4 - 6 cm（建议使用 250 - 500 mL 规格的杜瓦瓶）。</li>
	<li>将一个鳄鱼夹电极连接到针尖，并将其接到高压电源的正极端。</li>
	<li>将一条铝箔（12 × 5 cm）折叠在真空烧瓶的边缘上。</li>
	<li>将第二个鳄鱼夹电极连接到金属箔的外边缘，并将其连接至电源的接地端。</li>
	<li>将液氮加入杜瓦瓶中，至距离瓶口约1 cm处，使铝箔的3/4浸入液氮中。 
	注意：必须保持杜瓦瓶内充满液氮。在电喷雾过程中，液氮液面距离瓶口顶部不得超过2 cm。为维持电喷雾过程中液氮液面高度恒定，需持续补充液氮。</li>
	<li>将注射泵的输注速率设置为 30 mL/h。 
	注意：改变输注速率可能会影响微载体的形状和直径，但推荐范围为25 - 35 mL/h。虽然该参数高度依赖于悬浮液的黏度，但低于25 mL/h的流速可能导致生成较大的微载体。在极低流速下，微载体的大小和形状可能变得不均匀。当输注速率超过35 mL/h时，所生成液滴的均一性可能下降 通过 电喷雾过程可能受到干扰，导致微载体呈非球形且粒径分布更广34.</li>
	<li>施加20 kV电压，并启动注射泵以开始电喷雾。 
	注意：电压可调节以控制微载体的大小，其对直径的影响通常大于输注速率。推荐电压范围为 15 – 25 kV。电压升高时，微载体直径预计减小。35.</li>
	<li>输注完成后，小心倒出杜瓦瓶中多余的液氮，保留约 25 mL 液氮使微载体保持悬浮状态，以确保其持续处于冷冻状态。</li>
	<li>立即将微载体连同液氮一次性平稳倒入50 mL离心管中。用刮勺收集杜瓦瓶内残留的冷冻微载体，并加入离心管中。 
	注意：根据杜瓦瓶的大小，可先将液氮中的微载体倒入一个中等大小的容器中，然后立即转移至50 mL离心管中。</li>
	<li>用带有小孔的铝箔覆盖装有微载体悬液的离心管，为冻干做准备。</li>
	<li>将盖好的离心管放入冻干瓶中，立即连接冻干瓶至冻干机，过夜干燥样品。 
	注意：必须将微载体悬浮于液氮中，以确保在此步骤前不会发生解冻，因为解冻可能导致微载体塌陷和/或聚集。采用上述电喷雾条件、在35 mg/mL浓度下制备的DAT、DDT和DLV微载体，其水合状态下的直径通常介于350 - 500 μm 大小。尺寸分布可能因细胞外基质（ECM）来源不同而有所差异。</li>
	<li>将冻干的微载体保存在干燥器中，直至使用时取出。</li>
</ol>
<img alt="使用注射泵和高压电源的静电喷雾装置示意图，显示喷雾区域。" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图2. 微载体制造中所用静电喷雾装置的示意图。 A：关键静电喷雾设备的布置图，包括注射泵和高压电源，以及针头相对于液氮杜瓦瓶的位置。B：静电喷雾示意图，包含推荐的电压、进样速率和距离范围。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 细胞培养用泡沫和微载体的制备
<ol>
	<li>再水化
	<ol>
		<li>用镊子将冻干泡沫转移至含有过量无水乙醇（~99.9%）的50 mL离心管中（乙醇与泡沫的体积比约为5:1）。同样，将冻干微载体在收集时所用的原离心管中用过量无水乙醇重悬。使用移液管将微载体溶液经不锈钢筛网（孔径已知）过滤至新的50 mL离心管中，以去除任何聚集体并筛选出目标尺寸范围的微载体。 
		注意：如果泡沫在TCPS板中制备，可直接在这些容器中重新水化。</li>
		<li>孵育于 4 °C 4小时或直至泡沫或微载体因重力沉降至离心管底部。后续所有步骤均须在层流罩中进行，并使用无菌试剂及规范的无菌操作技术。</li>
		<li>使用血清移液管移除无水乙醇，向支架中加入过量（5:1 比例）用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）稀释的 95% 乙醇。于 4 °C 4小时，或直至ECM来源的支架沉降至再水化容器底部。</li>
		<li>通过一系列浓度的乙醇（90、85、80、75、70、50、25 和 0%，用无菌 PBS 稀释）逐步对支架进行再水化。每一步均需孵育 4 °C 待支架沉降至容器底部后再更换溶液。若观察到支架内部有气泡形成，需在轻微负压下对支架进行脱气处理。</li>
		<li>用无菌 PBS 替换，再清洗两次，以去除残留的乙醇。</li>
		<li>储存于100%无菌PBS中 4 °C 待细胞培养时使用。水化后1至2周内使用支架。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞接种前的准备
	<ol>
		<li>在接种前一天，使用镊子将泡沫材料转移至经细胞培养处理的孔板或Transwell小室中，并加入足量的细胞培养基（根据目标细胞类型选择），以完全浸没支架。例如， 2.5 mL/支架，置于12孔板中）。同样，让微载体在离心管中依靠重力自然沉降，用移液管小心吸除PBS，避免扰动微载体，然后加入细胞培养基，使培养基与微载体的体积比达到5:1。 
		注意：接种人脂肪源性间充质干细胞（ASCs）时，使用添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM:Ham's F12培养基（Dulbecco改良Eagle培养基:Ham's F12营养混合物）。</li>
		<li>更换细胞培养基，共冲洗一次。</li>
		<li>将支架在细胞培养基中于37°C平衡过夜 37 °C支架将于次日准备好用于接种细胞。 
		注意：泡沫材料可在细胞培养插件或组织培养孔板中进行静态接种29，或使用实验室摇床进行动态接种36根据细胞外基质（ECM）来源、处理方法及悬浮浓度的不同，动态接种可增强细胞的初始黏附、增殖和浸润。可使用旋转培养系统对微载体进行动态接种。11.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

总体而言，与基于二维组织培养聚苯乙烯（TCPS）的标准培养模型或合成支架相比，来源于脱细胞组织的生物支架能更接近地模拟天然细胞微环境中细胞外基质（ECM）复杂的三维组成与结构。如前所述，细胞与细胞外基质的相互作用在介导细胞在体外培养及体内环境中的行为方面具有至关重要的作用。1. 鉴于细胞外基质（ECM）的生化、生物物理和生物力学特性具有组织特异性，越来越多的证据支持在设计用于组织工程的生物材料时采用组织特异性策略，同时也支持在构建更符合生理相关性的培养模型时采用此类方法 体外 实验20利用脱细胞组织作为起始材料，我们的方法可将组织特异性细胞外基质（ECM）的复杂成分整合到更可定制的支架结构中。尽管机械和酶处理步骤会导致天然ECM超微结构的丧失，但既往关于脱细胞脂肪组织（DAT）的研究已表明，脂肪来源ECM的指导性作用在这些支架形式中得以保留，提示生物支架的组成是调控细胞功能的关键介质11,29与完整的脱细胞组织相比，使用ECM衍生的泡沫和微载体作为细胞培养基质的一个显著优势在于其更高的均一性，这有助于改善细胞分布以及细胞-细胞/细胞-ECM相互作用的均匀性。
本文所述方法可用于制备多种组织特异性生物支架，适用于细胞培养和组织工程应用。例如，除脱细胞化主动脉瓣（DAT）、脱细胞化双叶瓣（DDT）和脱细胞化肺动脉瓣（DLV）外，本实验室已成功应用这些技术，利用脱细胞化的骨、软骨、髓核、纤维环以及商品化的牛腱来源不溶性胶原制备出三维多孔泡沫支架。从一个 体外 从研究视角来看，这些生物支架可作为高保真三维细胞培养模型的基础，用于研究细胞生物学、生理学或疾病病理学38，作为高通量药物筛选平台中的生物活性底物39或作为干细胞分化的指导性基质40,41. 浓度为25 - 50 mg/mL制备的DAT、DDT和DLV泡沫具有长期稳定性 体外 培养（已测试长达28天）。此外，这三种微载体均能在低剪切力的旋转培养系统（10–15 rpm）的动态条件下支持细胞贴附和增殖，至少持续2周。对于 体内 生物相容性好且可生物降解的细胞外基质来源的泡沫材料和微载体，作为即用型产品，在促进有序组织重塑与再生方面具有广阔应用前景11,29此外，这种具有细胞黏附性的支架可作为细胞治疗的递送系统42,43例如，将同种异体脂肪干细胞（ASCs）接种于DAT泡沫材料后，植入免疫功能健全的大鼠模型皮下，结果表明该材料可促进血管生成和脂肪生成。29与完整的脱细胞真皮基质（DAT）相比，经过更深度处理的DAT泡沫降解速度显著加快，3周时体积即减少50%，并随着与宿主组织的整合而在12周时几乎完全被吸收。然而，这些泡沫也诱导了更强的促血管生成反应，表明经酶消化的细胞外基质具有独特的促再生效应。类似地，来源于细胞外基质的微载体也可用于 体外 动态培养系统中的细胞培养基质及可注射细胞递送载体11,30,44更具体而言，微载体的小直径和大表面积能够在小体积内递送大量细胞，同时提供一种基质，有助于维持细胞活力并提高注射部位的细胞滞留率。30在任何活体系统中使用之前，必须确保来源的细胞外基质基本不含具有抗原性的细胞成分和/或可能具有细胞毒性的脱细胞试剂，以免引发宿主的不良反应7.
蛋白水解酶胃蛋白酶常用于制备来源于细胞外基质（ECM）的水凝胶15。胃蛋白酶是一种非特异性蛋白酶，可将胶原蛋白及其他ECM蛋白消化成小片段45。尽管已有报道称由胃蛋白酶消化ECM制备的水凝胶具有调控细胞行为的作用，但其局限性在于这些材料通常机械强度极低46。在我们最初开发DAT微载体时，采用了复合策略，即将经胃蛋白酶消化的DAT与海藻酸钠混合后逐滴加入CaCl2溶液中，形成球形微珠30。随后对微珠进行光交联，并使用柠檬酸钠提取海藻酸钠。除了需要化学交联外，该方法的一个关键局限是所制备的微载体在粒径小于900–950 µm时稳定性较差30。本研究中所采用的方法摒弃了胃蛋白酶，转而使用糖酵解酶α-淀粉酶对ECM进行更为温和的消化。据推测，α-淀粉酶可切割胶原蛋白端肽区域的碳水化合物基团，从而提高其在乙酸中的溶解度37。该方法能够分离出高度聚合的胶原蛋白，可用于制备完全由ECM来源的泡沫材料和微载体，且无需化学交联剂或其他添加剂。这些生物支架通过结构完整保留的胶原原纤维之间的物理相互作用和氢键得以稳定，类似于天然ECM微环境中的胶原结构。
这些泡沫是一种高度灵活的平台，可根据所选的特定模具制成多种几何形状。对于细胞培养研究，可直接在 TCPS 孔板中浇铸泡沫，以形成不同厚度的涂层或三维支架。为制备表面高度均一的三维泡沫，建议设计一种可在两侧用塑料或玻璃盖玻片密封的定制模具。可采用绞碎或低温研磨的细胞外基质（ECM）来合成泡沫。通常情况下，我们发现低温研磨所得的泡沫在宏观上更柔软，并且在较低浓度下超微结构更为松散31,36。根据组织来源的不同，额外的机械处理步骤可能会引起 ECM 成分的变化，从而影响细胞功能。例如，在我们之前的研究中，绞碎的 DLV 泡沫中可检测到层粘连蛋白（laminin），但在低温研磨的 DLV 泡沫中则无法检测到31。相比之下，在绞碎和低温研磨的 DAT 泡沫中均可检测到 I 型胶原、IV 型胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白36。除了机械处理步骤外，通过调节 ECM 悬液浓度和冷冻温度，可在一定程度上调控泡沫的孔隙率和孔径大小47。通常情况下，较低浓度的泡沫（约 10 - 15 mg/mL）在定性上更具多孔性，但可能迅速收缩，并在长期培养中稳定性较差31,36。类似地，较慢的冷冻速率（通常通过较高的冷冻温度实现）会因制备过程中形成的冰晶尺寸较大，导致泡沫中产生更大的孔隙29。所有这些参数都可能影响细胞与材料的相互作用，包括细胞黏附、浸润和重塑。例如，在较高 ECM 浓度下制备的泡沫上，细胞生长可能局限于表面区域，尤其是在使用绞碎的 ECM 来源和静态培养条件下36。
对于微载体而言，可调节的关键参数包括细胞外基质（ECM）悬浮液浓度、针头规格和施加电压，其中较高浓度通常可产生在长期动态培养条件下更稳定的微载体。启动静电喷雾后，ECM悬浮液滴应迅速下落至培养瓶中心，朝向铝箔收集器方向。为防止聚集，必须确保微珠在接触铝箔之前先接触液氮。针头与液氮表面之间的距离可进行调整以满足上述要求。需要注意的是，根据每种特定ECM来源的性质，可能需要进行优化，尤其是在选择能够形成稳定生物支架的浓度范围时。另一个关键因素是用于制备起始材料的脱细胞化方案，因为会降解ECM或残留试剂（例如，表面活性剂）的脱细胞方法可能对所得泡沫和微载体的稳定性产生负面影响。如果遇到生物支架稳定性问题，可尝试的解决方案包括采用更缓慢的再水化过程、提高ECM悬浮液浓度，以及比较使用剪碎法与冷冻研磨法制备的ECM。若上述所有方法均未能解决问题，则可能需要考虑采用其他脱细胞化方案或更换ECM来源。
为确保支架制备过程中的可重复性，必须对方案中的某些步骤格外注意。在对脱细胞组织进行低温研磨时，建议在冻干后立即于干燥环境中进行研磨，以减少颗粒因吸收环境湿气而发生聚集的可能性。在微载体的制备过程中，建议将悬浮液分小批次进行电喷雾，每批次最大体积不超过3 mL，以避免样品冷却不均导致喷针堵塞的问题。此外，电喷雾完成后，必须防止微载体发生解冻。为保持其球形形貌和机械稳定性，微载体应从液氮中取出后，置于盛有液氮的容器中运输，并立即进行冻干处理。最后，无论是多孔泡沫支架还是微载体，其再水化步骤均需在数天内缓慢进行。快速再水化可能导致支架在宏观和/或微观尺度上发生结构塌陷。此外，再水化过程必须缓慢，以防止支架内部产生微小气泡，而这些气泡在轻微真空条件下脱气可能需要较长时间。
综上所述，本文介绍的方法可用于制备多种由纯的、未经化学交联的细胞外基质（ECM）组成的组织特异性泡沫材料和微载体。对于生物研究人员而言，其优势在于这些生物支架易于操作，在进行组织学、免疫组织化学或基因与蛋白质表达分析等实验时，可像处理天然组织一样进行加工。此外，这些来源于ECM的支架可通过酶降解以回收接种的细胞群体，也可直接用作可生物降解且生物相容性良好的细胞递送载体。总体而言，这一灵活的平台技术在多种应用中具有重要价值，包括用于研究细胞功能的三维细胞培养、细胞扩增基质以及促进再生的生物支架等。

细胞外基质（ECM）由蛋白质、糖蛋白和多糖组成的复杂三维网络构成1。过去曾认为其主要起结构性支撑作用，但现在已充分认识到，ECM包含多种具有重要功能的生物活性分子2。细胞与ECM之间的相互作用可调控细胞的存活、黏附、迁移、增殖和分化3。尽管ECM大分子的主要类别在不同组织和物种间通常高度保守，但每种组织都具有独特的基质成分和结构4。总体而言，组织特异性的ECM提供了一种具有指导作用的微环境，介导从亚细胞水平到组织/器官水平的功能调控5。
由于细胞外基质（ECM）在介导细胞功能方面具有关键作用，人们日益关注开发来源于ECM的生物支架，用于组织工程和再生医学领域的应用。特别是，脱细胞化方法已被广泛研究，作为一种从多种组织中获取ECM的手段，用作组织再生和细胞递送的支架材料5,6,7。脱细胞化通常包括一系列机械、化学和/或生物处理步骤，旨在去除细胞及细胞成分，同时尽可能减少对ECM三维结构和成分的改变8。通过文献调研可以发现，几乎人体所有组织均有相应的脱细胞化方案被报道7。
尽管脱细胞组织可直接用作可植入支架或三维细胞培养基质，但在细胞外基质结构致密的组织中，细胞浸润可能受限9此外，细胞外基质的天然异质性可能导致去细胞化基质中细胞黏附和分布的差异，这可能会对细胞反应产生影响10总体而言，尽管去细胞化组织在某些应用中具有前景，但以其完整形式应用时，在调节支架特性（包括形状、孔隙率和刚度）以及递送方式方面具有较大的局限性 体内 应用。
为了克服这些局限性，许多研究团队正在采用进一步的加工方法，以脱细胞组织为基底材料制备定制化的支架结构。最简单的方式可能包括将脱细胞组织进行低温研磨，以制备可注射的组织特异性细胞外基质微粒11这些细胞外基质颗粒可作为具有细胞指导功能的组分，与其他生物材料复合构建支架，例如 原位 交联水凝胶12,13,14除了机械处理外，脱细胞组织还可通过蛋白水解酶和/或糖酵解酶进行酶消化，以制备来源于细胞外基质的水凝胶、泡沫材料、微载体及涂层15,16,17以及合成用于3D打印的生物墨水18.
除了组织工程应用外，ECM来源的生物支架在构建更高保真度的模型方面也具有巨大潜力 体外 用于生物研究的模型。迫切需要开发能够更好模拟天然细胞微环境的三维细胞培养系统19. 大多数 体外 迄今为止的细胞培养研究均在组织培养用聚苯乙烯（TCPS）上进行，而该材料与活体组织中生物学上复杂且动态的细胞微环境几乎没有相关性20尽管在受控环境中培养细胞便于研究细胞间的相互作用，但在这些简化的刚性二维基质上培养会改变细胞的黏附和形态，以及细胞间和细胞与细胞外基质（ECM）间的相互作用21,22在二维组织培养聚苯乙烯（2D TCPS）上观察到的细胞适应性变化可能影响调控多种细胞功能（包括存活、增殖、迁移和分化）的细胞内信号通路，这引发了关于二维培养研究在建模中的相关性问题 体内 系统23. 人们日益认识到，细胞行为在二维条件下可能存在巨大差异 与 三维系统24，且细胞与细胞外基质之间的生化和生物力学信号转导是调控细胞功能的关键介质25许多研究团队已尝试通过在TCPS上包被胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白等细胞外基质（ECM）组分，以克服传统二维系统的局限性。尽管这些策略可改善细胞黏附并可能改变细胞反应，但这些模型仍受限于其二维构型，无法模拟天然ECM复杂的空间结构和生化特性26,27.
我们的生物工程实验室一直致力于开发来源于细胞外基质（ECM）的生物支架，作为三维细胞培养和组织工程应用的基质。特别是，我们率先将脱细胞脂肪组织（DAT）用作脂肪组织再生的支架平台28。此外，我们已建立方法，利用经蛋白酶消化的DAT或糖酵解酶α-淀粉酶消化的DAT合成三维微载体和多孔泡沫材料29,30,31。值得注意的是，我们在所有这些支架形式中均证实，脂肪组织来源的ECM为人类脂肪来源的干细胞/基质细胞（ASCs）在体外培养中的脂肪向分化提供了诱导性微环境。最近，我们将制备方法进一步拓展，利用经α-淀粉酶消化的猪脱细胞左心室（DLV）（脱细胞方法借鉴自Wainwright et al.32）制备三维多孔泡沫，并证明该泡沫可有效支持人心包脂肪来源ASCs早期心肌向标志物的表达31。
本文详细描述了利用α-淀粉酶消化的细胞外基质（ECM）完全制备非化学交联的三维多孔泡沫和微载体的方法，可用于构建生物学上复杂的三维结构 体外 细胞培养基质以及作为组织再生的生物材料。理论上，任何含有高分子量胶原蛋白的细胞外基质（ECM）来源均可作为这些技术的起始材料。为展示该方法的灵活性，已将其应用于利用人腹直肌筋膜（DAT）和猪脱细胞真皮组织（DDT）制备组织特异性生物支架8以及猪源DLV作为代表性实例。 图1 提供了细胞外基质来源的泡沫和微载体的制备过程的可视化概述。
<img alt="用于组织特异性细胞培养的细胞外基质制备过程；脱细胞化、冻干、接种。" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 组织特异性细胞外基质来源的泡沫与微载体的制备方法概览。1. 按照既定的脱细胞化方案制备的脱细胞化组织，可用于构建组织特异性的细胞外基质来源生物支架。图中展示了水合状态下的人类脱细胞化脂肪组织（DAT，制备方法见Flynn 201028）、猪源脱细胞化真皮组织（DDT，制备方法见Reing, J. E., et al. 20108）和猪源脱细胞化心外膜（DLV，制备方法见Wainwright et al. 201032）的宏观图像，作为可用于起始材料的细胞外基质来源的代表性示例。比例尺为3 cm。2. 将脱细胞化组织进行冻干处理，然后3. 机械切碎。比例尺为1 cm。4. 切碎后的细胞外基质可进一步进行低温研磨，此步骤在制备泡沫支架时为可选，但在合成微载体时为必需。比例尺为3 mm。5. 将切碎或低温研磨后的细胞外基质用α-淀粉酶消化并均质化，以形成均匀的细胞外基质悬液。比例尺为1 cm。6a) 在泡沫支架制备过程中，将细胞外基质悬液转移至用户自定义的模具中，冷冻后冻干，从而生成具有明确几何形状的多孔三维支架。比例尺为1 cm。6b) 在微载体制备过程中，将低温研磨后的细胞外基质悬液进行电喷雾处理，以生成独立的球形微载体。比例尺为2 mm。7. 随后可对所得的泡沫支架和微载体逐步再水合，并接种细胞。图中展示了人脂肪源性干细胞（ASCs，活细胞呈绿色）接种于DAT泡沫支架（左）和DAT微载体（右）的代表性图像。比例尺为100 µm。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>冰醋酸</td><td>BioShop</td><td>ACE222.500</td><td></td></tr><tr><td>鳄鱼夹导线</td><td>VWR</td><td>470149-728</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-101</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;α-淀粉酶</td><td>Sigma</td><td>101074694</td><td>来自米曲霉</td></tr><tr><td>分析天平</td><td>赛多利斯</td><td>CPA225D</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75004251</td><td>配有可摆动桶式转子，适用于15 &amp;和 50 mL 离心管</td></tr><tr><td>离心管（15 mL）</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>离心管（50 mL）</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.205</td><td></td></tr><tr><td>牛跟腱胶原蛋白（不溶性）</td><td>Sigma</td><td>C9879&amp;nbsp;</td><td>或类似的不溶性胶原来源；可作为去细胞化组织的替代物用于制备泡沫和微载体</td></tr><tr><td>冷冻研磨系统</td><td>Retsch</td><td>20.745.0001</td><td>MM 400</td></tr><tr><td>干燥器</td><td>Fisher Scientific</td><td>8624426</td><td>用于冻干 ECM 和生物支架的储存</td></tr><tr><td>DMEM: F12 Hams</td><td>Sigma</td><td>D6421</td><td>用于增殖培养基</td></tr><tr><td>杜瓦瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-196-6</td><td>低型；体积范围 250 - 500 mL</td></tr><tr><td>双蒸水（ddH₂O）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td>来自 Barnstead GenPure xCAD 水纯化系统</td></tr><tr><td>D-PBS（磷酸盐缓冲液）</td><td>Wisent</td><td>311425125</td><td></td></tr><tr><td>细胞外基质（ECM）</td><td></td><td></td><td>从人脂肪组织、猪皮或猪心肌中分离，如 Flynn 所述 &lt;em&gt;等&lt;/em&gt; 2010，Reing &lt;em&gt;等&lt;/em&gt; 2010，以及 Wainwright &lt;em&gt;等&lt;/em&gt; 2010（参考文献编号 #28、8、32）</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Greenfield Specialty Alcohols 公司</td><td>P016EAAN</td><td>绝对值</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Wisent</td><td>80150</td><td>用于增殖培养基</td></tr><tr><td>镊子</td><td>VWR</td><td>37-501-32</td><td>用于转移泡沫</td></tr><tr><td>-20℃冰箱 &amp;deg;C)</td><td>VWR</td><td>97043-346</td><td></td></tr><tr><td>-80℃ 冰箱 &amp;deg;C)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>EXF40086A</td><td></td></tr><tr><td>玻璃小瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-339-26D</td><td>储存冻干的低温研磨ECM</td></tr><tr><td>手持式匀浆器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-359-251</td><td>转速：8,000 - 30,000 rpm</td></tr><tr><td>匀浆器配件：锯齿底端发生器探头</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-261-17</td><td>10 x 95 毫米</td></tr><tr><td>液氮</td><td></td><td></td><td>用于电喷雾</td></tr><tr><td>冻干机</td><td>Labconco</td><td>7750021</td><td>FreeZone4.5</td></tr><tr><td>研磨室</td><td>Retsch</td><td>02.462.0213</td><td>推荐体积为25 mL</td></tr><tr><td>研磨珠</td><td>VWR</td><td>16003-606</td><td>直径10 mm，推荐使用不锈钢</td></tr><tr><td>18 G 针头</td><td>VWR</td><td>C ABD305185</td><td>用于将细胞外基质悬液分装至模具中</td></tr><tr><td>轨道摇床培养箱</td><td>SciLogex</td><td>832010089999</td><td>温度控制（37 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>用于增殖培养基</td></tr><tr><td>Pipet-Aid XP</td><td>Mandel Scientific</td><td>DRU-4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>铁架台</td><td>VWR</td><td>470019-526</td><td></td></tr><tr><td>铁架台夹</td><td>VWR</td><td>21573-606</td><td></td></tr><tr><td>Safety-Lok 注射器</td><td>BD</td><td>309606</td><td>用于微载体制造和分配ECM悬液的3 mL鲁尔锁型注射器</td></tr><tr><td>血清移液管（10&amp;nbsp;mL</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管（25 mL）</td><td>Sarstedt</td><td>86.1685.001</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>BioShop</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>BioShop</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>药勺</td><td>VWR</td><td>89259-968</td><td>用于收集微载体</td></tr><tr><td>手术剪</td><td>VWR</td><td>82027-590</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>VWR</td><td>10117-490</td><td>微处理器控制</td></tr><tr><td>高压电源</td><td>伽马高压研究</td><td>ES30P-5W/DDPM</td><td>可支持推荐的15 - 25 kV电压范围</td></tr><tr><td>12孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565321</td><td>用于泡沫制备过程中的模具；也可选择其他尺寸或用户自定义模具</td></tr><tr><td>带翼输液器</td><td>Terumo</td><td>22258092</td><td>30 cm 管路长度，25 G 3/4&quot; 推荐使用；也可使用其他规格的针头，这可能会影响微载体的直径</td></tr></tbody></table>

用于组织特异性细胞培养与递送的细胞外基质来源泡沫及微载体的制备

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

细胞功能由其与细胞外基质（ECM）的相互作用所介导，而ECM具有复杂的组织特异性成分和结构。本文重点介绍制备来源于ECM的多孔泡沫和微载体的方法，这些材料可作为生物学相关基质，用于先进的三维研究 体外 细胞培养模型，或作为组织工程与再生医学中的促再生支架及细胞递送系统。利用脱细胞组织或纯化的不溶性胶原作为起始材料，这些技术可用于合成具有可定制几何结构的多种组织特异性生物支架。该方法包括机械处理和温和的酶消化，以获得细胞外基质（ECM）悬液，并通过控制冷冻和冷冻干燥程序，进一步制备成三维泡沫或多孔微载体。这些完全由ECM衍生的支架具有高度孔隙率，且无需使用可能对细胞功能产生负面影响的化学交联剂或其他添加剂即可保持稳定。通过调节ECM悬液浓度、机械处理方式或合成条件等因素，可在一定程度上调控支架的性能。总体而言，这些支架结构坚固、易于操作，可像天然组织一样用于大多数标准生物学检测，提供一种模拟天然ECM成分的多功能且用户友好的三维细胞培养平台。综上所述，这种制备定制化ECM来源泡沫和微载体的简便方法，可能引起生物学家和生物医学工程师的广泛兴趣，作为组织特异性的细胞指令性平台 体外 和 体内 应用。

在本研究中，我们以人源深部筋膜组织（DAT）、猪源深部真皮组织（DDT）和猪源脱细胞肺组织（DLV）为代表性示例，制备了来源于细胞外基质（ECM）的泡沫材料和微载体，证明该技术可利用多种脱细胞组织作为ECM来源，制备组织特异性的生物支架（图1）。无论是泡沫材料还是微载体的制备，均采用Nishihara方法，通过糖酵解酶α-淀粉酶37对胶原蛋白进行溶解，从而将脱细胞组织起始材料转化为黏稠的ECM悬浮液，并进一步通过控制冷冻和冷冻干燥工艺合成生物支架。
制备泡沫材料时，可将脱细胞组织通过机械剪切或冷冻研磨处理，以增大其表面积，随后进行酶消化。经α-淀粉酶处理并均质化后，将所得的细胞外基质（ECM）悬液注入自定义模具中，随后冷冻并冻干。所得支架可在干燥状态下长期稳定保存。在用于细胞培养研究之前，必须对冻干支架进行可控的再水化处理，从而形成由纯ECM衍生的多孔、高度水合的均质泡沫材料（图3A）。若泡沫再水化过快，会因快速膨胀而破坏精细的结构特征，导致结构完整性丧失和塌陷。通常情况下，再水化后的泡沫可保持原始模具所定义的形状，且无需化学交联即可保持稳定。图3B展示了使用浓度为35 mg/mL、在-80 °C条件下冷冻制备的经冷冻研磨ECM所获得的DAT、DDT和DLV泡沫的代表性扫描电子显微镜（SEM）图像。
<img alt="聚合物形貌对比；DAT、DDT 和 DLV 样品的光学图像与 SEM 显微照片。" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3. 使用浓度为 35 mg/mL 并在 -80 °C 冷冻的 cryomilled ECM 悬液制备的 DAT、DDT 和 DLV 泡沫的代表性图像。A：在再水化后，使用 48 孔组织培养板模具合成的 DAT、DDT 和 DLV 粉碎泡沫的大体视图。比例尺代表 1 cm。B：DAT、DDT 和 DLV 泡沫的扫描电镜（SEM）图像，显示均一的多孔超微结构。比例尺代表 100 µm。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
通过静电喷雾技术，也可将冷冻研磨的细胞外基质（ECM）悬浮液制备成纯ECM来源的微载体（图2）。针对每种ECM来源，可通过调节悬浮液浓度、针头规格、进样速率和电压，在控制性再水化后生成直径为350–500 μm的独立球形微载体（图4A）。微载体虽可保存于冻干状态，但为便于操作，建议在乙醇中重悬后分装或过筛，以获得所需粒径范围。扫描电镜（SEM）成像表明，微载体的超微结构可能因去细胞化组织来源的不同而有所差异（图4B）。
<img alt="材料分析中DAT、DDT、DLV颗粒结构的显微镜与扫描电镜图像。" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4. 使用浓度为35 mg/mL、进样速率为0.5 mL/min、施加电压为20 kV的冷冻研磨ECM悬浮液制备的DAT、DDT和DLV微载体的代表性图像。A：水合状态下的DAT、DDT和DLV微载体宏观视图。比例尺代表4 mm。B：DAT、DDT和DLV微载体的扫描电镜图像，显示其超微结构和尺寸可因ECM来源不同而有所差异。比例尺代表100 µm。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
支架的机械性能取决于细胞外基质的来源以及所采用的加工方法即 研磨与冷冻研磨）、ECM 悬液浓度以及冷冻温度。通常情况下，所制备的支架材料质地柔软且顺应性良好，已有报道显示其 DAT 的杨氏模量范围为 1 - 5 kPa（50 &amp; 100 mg/mL29 以及DLV泡沫（20 - 50 mg/mL）31，以及 &lt; 微载体的压缩模量为1 kPa。由于冷冻研磨法制备的泡沫结构更为疏松，其通常比切碎法制备的泡沫更柔软。准确表征这些泡沫材料的压缩性能需要使用配备高灵敏度负荷传感器的专用力学测试系统。通常情况下，由于制备过程中涉及酶消化、匀浆等额外处理步骤，以及支架本身为非共价交联结构，泡沫材料和微载体的弹性模量往往低于天然脱细胞组织。然而，这一情况可能因目标组织类型的不同而有所差异。例如，在前期研究中，我们发现当以高细胞外基质浓度（100 mg/mL）制备切碎法脱细胞脂肪组织（DAT）泡沫时，其弹性模量与天然脂肪组织相近。29.
重新水化的ECM来源的泡沫和微载体可在静态或动态培养条件下接种细胞，为细胞提供支持性平台 体外 细胞培养研究和/或 体内 细胞递送。尽管支架通常能够支持细胞黏附，但接种效率将取决于细胞外基质（ECM）来源、支架的几何结构与孔隙率，以及目标细胞类型。因此，接种方法和细胞密度需根据用户设定的条件进行优化。对于上述所述的泡沫支架，我们建议起始细胞浓度范围为 0.25 - 1 x 106 细胞/支架，采用在轨道摇床上进行动态接种以增强细胞浸润。对于微载体，建议初始接种密度为每毫克微载体25,000 - 50,000个细胞，在旋转培养瓶中动态条件下进行接种11底部所示的图像 图1 人源ASCs接种于DAT泡沫（左）或DAT微载体（右，预先用胺反应性染料标记，呈蓝色）的示意图13），通过共聚焦显微镜结合荧光细胞活力染色（活细胞 = 绿色，死细胞 = 红色；比例尺代表 100 µm共聚焦显微镜可用于观察接种在厚度达2 mm的泡沫材料表面的细胞，但由于支架不透光的性质，难以观察其内部中心区域。然而，可将泡沫材料和微载体作为组织进行处理，通过石蜡包埋或冷冻切片制备切片，用于组织学和免疫组织化学分析，以观察细胞分布及标志物表达。

组织特异性的细胞外基质（ECM）是调控细胞功能的关键介质。本文介绍了一种合成纯ECM来源的泡沫材料和微载体的方法，这些材料在培养中稳定，无需化学交联，可用于先进的三维体外细胞培养模型或作为促再生生物支架。

细胞功能由细胞与细胞外基质（ECM）的相互作用所介导，而细胞外基质具有复杂且组织特异性的成分和结构。本研究重点……

本方案的总体目标是辅助测定由组织特异性细胞外基质（ECM）制备的、未经化学交联的泡沫或多孔微载体的尺寸，用于三维体外细胞培养模型，或作为细胞递送系统中的促再生支架。该方法有助于回答应用细胞生物学和组织工程领域中的关键问题，例如三维细胞微环境如何介导细胞功能与组织再生。该技术的主要优势在于，能够制备出几何结构可调、模拟天然组织特异性ECM成分的支架，并且在长期培养中保持稳定，无需额外交联。根据文本方案将组织来源的细胞外基质（ECM）冻干后，使用锋利的手术剪将脱细胞组织精细剪碎。为进行冷冻研磨，取25毫升不锈钢研磨室（用于实验室球磨系统），装入剪碎的冻干ECM，并加入两个10毫升的不锈钢研磨球。将装好的研磨室封闭后完全浸入液氮中，持续三分钟。然后以30赫兹的频率研磨冷冻样品3分钟。重复将样品浸入液氮并进行研磨，直至细胞外基质（ECM）被研磨成细粉。称取250毫克切碎或冷冻研磨后的细胞外基质（ECM），转移至15毫升离心管中。向离心管中加入5毫升22摩尔的NaH2PO4缓冲液，并在管上标记液面位置。然后，通过将7.5毫克α-淀粉酶加入1毫升22摩尔的NaH2PO4缓冲液中，制备α-淀粉酶储备液。接着，向样品中加入100微升α-淀粉酶储备液。然后加入22摩尔的NaH2PO4，使最终体积达到10毫升。在300转/分钟和室温条件下持续振荡悬浮液72小时。在1500 × g下离心10分钟。小心收集并弃去上清液，注意不要扰动已消化的细胞外基质沉淀。然后加入10毫升用双蒸水稀释的5% NaCl溶液，重悬沉淀物，并在300 RPM条件下持续振荡10分钟。重复洗涤两次后，使用10毫升双蒸水重悬沉淀。然后在室温下以300 RPM持续振荡悬浮液10分钟。再次离心样品后，小心收集并弃去上清液，避免扰动已消化的ECM沉淀。加入2摩尔乙酸至5毫升刻度线。然后涡旋振荡。接着将悬浮液在37摄氏度、120转/分钟条件下持续振荡过夜。次日，使用配备10毫米宽锯齿探头的手持式匀浆器，在室温下以10秒为间隔反复匀浆细胞外基质（ECM）悬浮液，直至无可见碎片残留。在匀浆间隔期间，将悬液置于盛有冷水的烧杯中，以防止过热。将细胞外基质（ECM）悬液在37摄氏度下孵育，并以120转/分钟持续振荡，直至悬液变暖。然后使用2 mol/L乙酸将样品悬液稀释至所需浓度。使用3毫升注射器和18号针头，将ECM悬液注入所需模具中。根据模具的形状，可制备出多种几何形态的泡沫材料。盖好模具后，在-20或-80摄氏度下冷冻。然后将模具放入冻干机瓶中。将瓶子连接到实验室冷冻干燥系统，干燥24小时或直至完全干燥。将 cryomilled ECM 悬液在100 RPM条件下持续振荡孵育过夜。将三毫升 ECM 悬液加入三毫升鲁尔锁型注射器中，并将带翼输液装置连接到注射器的针筒口。将注射器固定在注射泵内。然后将针头固定在铁架台上，使针尖垂直朝下，距离低型杜瓦瓶顶部四至六厘米。接下来，将一个鳄鱼夹电极连接到针尖上，并确保该鳄鱼夹连接至高压电源的正极端。将一条铝箔折叠在真空烧瓶的边缘上，然后将第二个鳄鱼夹电极连接到铝箔的外缘。将其连接至电源的接地端。向杜瓦瓶中加入液氮，液面距瓶口约一厘米，使金属箔的四分之三浸入液氮中。然后将注射泵的输注速率设置为每小时30毫升，并按照文本协议对样品进行电喷雾处理。输注完成后，小心倒出杜瓦瓶中多余的液氮，留下约25毫升液氮悬浮微载体，以确保其保持冷冻状态。立即通过一次顺畅的倾倒动作，将微载体连同液氮转移至50毫升离心管中。然后使用刮勺收集杜瓦瓶中残留的冷冻微载体。将它们一同加入离心机。为准备冻干，用带有小孔的铝箔覆盖离心管。将盖好铝箔的离心管放入冻干机瓶中。然后立即将烧瓶连接至冻干机，过夜干燥样品。轻轻将冻干后的泡沫转移至含有过量无水乙醇的50毫升离心管中。同样，在用于收集的原始离心管中，用过量无水乙醇重新悬浮冻干的微载体。使用移液管，将微载体通过具有特定孔径的不锈钢筛网过滤至新的50毫升离心管中，以去除任何聚集体并筛选出所需尺寸范围的微载体。将样品在4摄氏度下孵育4小时，或直至泡沫或微载体沉降至离心管底部。随后，在超净工作台内采用无菌操作技术，使用移液管从支架中移除无水乙醇，并加入过量用无菌PBS稀释的95%乙醇。将支架置于 4°C 条件下孵育 4 小时，或直至支架完全沉降至再水化容器底部。通过梯度乙醇溶液逐步对支架进行再水化。每一步均需在 4°C 条件下孵育支架，直至其沉降至容器底部后，再更换下一种溶液。用无菌 PBS 替换以进行额外两次冲洗，以去除残留的乙醇。将样品储存在 100% 无菌 PBS 中，置于 4 摄氏度条件下，直至准备进行细胞培养。在重新水化后的一至两周内使用支架。图中展示了利用脱细胞脂肪组织、猪脱细胞真皮组织以及猪脱细胞左心室组织作为细胞外基质（ECM）来源所制备的ECM衍生泡沫材料和微载体的示例，表明该技术可应用于多种脱细胞组织，以生成具有组织特异性的生物支架。在进行冷冻研磨或切碎、酶消化和匀浆处理后，可将样品分装至容器中，再进行冷冻和冻干。该图展示了在48孔组织培养板模具中制备的再水化DAT、DDT和DLV研磨泡沫。这些DAT、DDT和DLV泡沫采用浓度为35毫克/毫升的冷冻研磨ECM制备，冷冻温度为-80摄氏度。为了利用电喷雾技术制备来源于细胞外基质（ECM）的微载体，针对每种ECM来源的悬浮液浓度，可通过调节针头规格、输注速率和电压，以生成直径在350至500微米范围内的离散球形微载体，随后进行可控再水化。最后，通过扫描电镜（SEM）显示的DAT、DDT和DLV微载体表明，其超微结构的尺寸可能因去细胞化ECM来源的不同而有所差异。本视频中介绍的方法可用于制备多种由纯的、未经化学交联的ECM构成的组织特异性微载体和泡沫材料，其基质来源为去细胞化组织。通过上述步骤，可在静态或动态条件下将细胞接种于泡沫材料和微载体上，并可将其作为细胞诱导性基质用于体外细胞培养及体内应用。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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细胞外基质，脱细胞组织，生物支架，冷冻干燥，组织工程，泡沫材料

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本方案的目标是制备适用于临床前评估的完整细胞外基质纤维，用于再生支架植入物中的伤口修复。这些纤维通过在中空纤维膜上培养成纤维细胞并随后溶解膜而获得。...

通过牺牲性中空纤维膜细胞培养生产细胞外基质纤维

该方法的目的是获得成纤维细胞来源的三维基质，作为后续细胞实验的天然支架。将成纤维细胞接种于预处理的培养板中，并用抗坏血酸刺激以生成基质。随后对基质进行脱细胞处理并阻断，以用于培养相关细胞（例如内皮细胞）。...

成纤维细胞来源的三维基质系统在内皮细胞成管形成实验中的应用

本文介绍了一种由交变粘性-惯性力驱动的温和3D打印技术，可用于构建水凝胶微载体。自制喷嘴具有灵活性，可方便地更换以适应不同材料和直径。可获得并收集直径为50-500...

3D打印 体外 通过交替黏性-惯性力喷射法制备水凝胶微载体

尽管细胞外基质（ECM）硬度是调控细胞行为的关键因素，但其潜在的感知与信号转导机制仍不明确。为解决这一问题，我们提供了可调节硬度的聚丙烯酰胺和硅胶基底的制备方案，以促进对细胞-ECM相互作用机制的理解。...

用于细胞生物学研究的具有确定刚度的聚丙烯酰胺和硅胶细胞外基质基底的制备

学习利用脱细胞组织通过冷冻研磨和电喷雾技术制备无化学交联的细胞外基质泡沫和微载体，用于三维细胞培养和组织工程研究。该方法可构建具有可调几何结构的仿生支架。

用于组织特异性细胞培养与递送的细胞外基质来源泡沫及微载体的制备

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