细胞外基质衍生的泡沫和微载体如组织特异性细胞培养和交付平台的制造

该方案的总体目标是协助确定来自组织特异性细胞外基质的非化学交联泡沫或微载体的尺寸，用于 3D 体外细胞培养模型，或作为细胞递送系统中的促再生支架。这种方法可以帮助回答应用细胞生物学和组织工程领域的关键问题，例如 3D 细胞微环境如何介导细胞功能和组织再生。该技术的主要优点是它能够制造具有可调几何形状的支架，这些支架模拟天然组织特异性 ECM 组成，并且在长期培养中保持稳定，无需额外的交联。

根据文本方案冻干组织来源的 ECM 后，使用锋利的手术剪刀将脱细胞的组织细碎。要冷冻研磨处理过的组织，请在实验室球磨系统的 25 毫升不锈钢研磨室中加入切碎的冻干 ECM，并添加两个 10 毫升不锈钢研磨球。关闭并完全浸入液氮中 3 分钟。

然后将冷冻样品以 30 赫兹的频率研磨 3 分钟。重复浸入液氮中并研磨，直到 ECM 研磨成细粉。称取 250 毫克切碎或冷冻研磨的 ECM，并将其转移到 15 毫升离心管中。

向离心管中加入 5 毫升 22 摩尔 NaH 2 PO 4 缓冲液，并在管上标记液位。然后，通过将 7.5 毫克 α 淀粉酶添加到 1 毫升 22 摩尔 NaH2PO4 缓冲液中来制备 α 淀粉酶储备液。接下来，向样品中加入 100 μL α 淀粉酶储备液。

然后加入 22 摩尔的 NaH2PO 4 ，获得 10 毫升的最终体积。以 300 RPM 和室温连续搅拌悬浮液 72 小时。将悬浮液以 1500 倍 G 离心 10 分钟。

小心收集并丢弃上清液，不要干扰消化的 ECM 沉淀。然后使用 10 毫升用双蒸水稀释的 5% NaCl 重新悬浮沉淀材料，并以 300 RPM 的速度连续搅拌 10 分钟。再重复洗涤两次，然后使用 10 毫升双蒸水重新悬浮沉淀。

然后在室温下以 300 RPM 的速度连续搅拌悬浮液 10 分钟。再次离心样品后，小心收集并丢弃上清液，不要干扰消化的 ECM 沉淀。加入 2 摩尔乙酸至 5 毫升标记处。

还有 Vortex。然后以 120 RPM 和 37 摄氏度连续搅拌悬浮液过夜。第二天，使用配备 10 毫米宽锯齿探针的手持式均质器，在室温下以 10 秒的间隔对 ECM 悬液进行均质化，直到没有可见的碎片残留。

在均质间隔之间将悬浮液放入装有冷水的烧杯中，以防止过热。在 37 摄氏度下孵育 ECM 悬浮液，并以 120 RPM 的速度连续搅拌，直到悬浮液变热。然后用 2 摩尔乙酸将样品悬浮液稀释至所需浓度。

使用 3 毫升注射器和 18 号针头，用 ECM 悬浮液填充所需的模具。泡沫可以制成各种几何形状，具体取决于模具的形状。盖上模具并在零下 20 或零下 80 摄氏度下冷冻。

然后将模具放入冻干瓶中。将培养瓶连接到实验室冷冻干燥系统，干燥模具 24 小时或直至完全干燥。将低温研磨的 ECM 悬浮液以 100 RPM 的转速连续搅拌孵育过夜。

将 3 毫升 ECM 混悬液装入 3 毫升鲁尔锁注射器中，并将带翼输液装置连接到注射器的孔上。将注射器固定在注射泵内。然后将针头固定在蒸馏架上，并将针尖垂直放置在距离低矮杜瓦瓶顶部 4 到 6 厘米的位置。

接下来，将鳄鱼夹电极连接到针尖，同时确保鳄鱼夹连接到高压电源的正极端子。将一条铝箔折叠在真空烧瓶的边缘。然后将第二个鳄鱼夹电极连接到箔的外边缘。

将其连接到电源的接地源端子。用液氮填充杜瓦瓶，使其距顶部约 1 厘米，以便浸没四分之三的箔纸。然后将注射泵设置为每小时 30 毫升的输注速率，并根据文本方案对样品进行电喷雾。

输注完成后，小心地从杜瓦瓶中倒出多余的液氮，将微载体悬浮在大约 25 毫升的液氮中，以确保它们保持冷冻状态。立即将含有液氮的微量载体以平稳方式倒入 50 mL离心管中。然后使用 Scoopula 收集杜瓦瓶中剩余的任何冰冻微型载体。

将它们也加入离心机中。为了准备冻干，用打孔有小孔的铝箔盖住离心管。将盖好的离心管放入冻干瓶中。

然后立即将培养瓶连接到冻干器上，并将样品干燥过夜。将冻干泡沫轻轻转移到含有过量无水乙醇的 50 毫升离心管中。同样，将冻干的微载体重新悬浮在用于收集的原始离心管内过量的无水乙醇中。

使用血清移液器，通过具有确定网孔尺寸的不锈钢筛将微量载体过滤到新的 50 毫升离心管中，以去除任何聚集体并选择所需的大小范围。将样品在 4 摄氏度下孵育 4 小时，或直到泡沫或微载体沉降到离心管底部。然后，在采用无菌技术的层流罩下，使用血清移液管从支架中去除无水乙醇，并加入用无菌 PBS 稀释的过量 95% 乙醇。

将支架在 4 摄氏度下孵育 4 小时，或直到支架沉到再水化容器的底部。通过乙醇系列逐渐再水化支架。在每个步骤中，在更换溶液之前，将支架在 4 摄氏度下孵育，直到它们沉到容器底部。

用额外的两次冲洗更换无菌 PBS，以去除残留的乙醇。将样品储存在 4 摄氏度的 100% 无菌 PBS 中，直到准备好进行细胞培养。在补液后一到两周内使用支架。

这里显示的是用脱细胞脂肪组织制造的 ECM 衍生泡沫和微载体类型的例子。猪脱细胞的真皮组织，猪脱细胞的左心室。证明这些技术可用于使用各种脱细胞组织作为 ECM 来源来生成组织特异性生物支架。

在冷冻研磨或切碎、酶消化和均质化后，样品可以在冷冻和冻干之前分配到碗中。该图表示在 48 孔组织培养板模具中合成的再水化 DAT、DDT 和 DLV 研磨泡沫。这些 DAT、DDT 和 DLV 泡沫是用浓度为每毫升 35 毫克、冰冻温度为零下 80 摄氏度的低温研磨的 ECM 制成的。

为了使用电喷雾技术制造 ECM 衍生的微载体，对于每个 ECM 源悬浮液浓度、针规输注速率和电压，可以调整在受控再水化后生成直径为 350 至 500 微米的离散球形微载体。最后，SEM 在此处显示的 DAT、DDT 和 DLV 微载体表明，超结构的大小可以根据去细胞化的 ECM 源而变化。本视频中介绍的方法可用于制造各种组织特异性微载体和泡沫，这些微载体和泡沫由纯的、非化学交联的 ECM 组成，使用去细胞化组织作为基质源。

遵循这些程序，泡沫和微载体可以在静态或动态条件下接种细胞，并可用作体外细胞培养和体内应用的细胞指导底物。