Name: 病毒衍生肽修饰抗体结合物对增强细胞积累和改善肿瘤靶向性的初步评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 了解抗体偶联物在肿瘤细胞中的特异性积累与核定位效率评估方法。本方案利用PET成像技术实时监测候选偶联物的靶向性与选择性，为癌症靶向治疗开发提供关键实验依据。

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本工作由癌症研究学会（加拿大）和CIMS资助。作者感谢Samia Ait-Mohand博士和Jean-Francois Beaudoin提供的协助，以及南澳大利亚大学Angel Lopez博士提供的单克隆抗体A14。

所述的体内动物实验均根据批准的方案进行，并遵循舍布鲁克大学医疗中心动物实验伦理委员会的伦理准则。
1. 抗体-多肽偶联
注意：ChAcNLS 可在任何商业多肽合成公司或大学附属的多肽合成服务平台进行合成。ChAcNLS 的合成方法见参考文献34。在步骤 1 和步骤 2 中使用单克隆抗体 7G3，该抗体特异性识别白血病抗原 IL-3Rα39。
<ol>
	<li>在1.7 mL微量离心管中，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.6）配制浓度为10 mg/mL（总抗体约1 mg）的7G3溶液。</li>
	<li>将磺基-SMCC溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，终浓度为5–10 mM。为确保完全溶解，建议充分涡旋混匀。</li>
	<li>向含有7G3的离心管中加入已溶解的磺基-SMCC溶液（通常为5–20 μL，具体体积取决于所需的磺基-SMCC与7G3的摩尔比）。建议测试磺基-SMCC与7G3的摩尔比分别为10:1、25:1和50:1的条件。室温孵育1小时。</li>
	<li>使用超滤装置对马来酰亚胺修饰的7G3进行纯化和浓缩，并在PBS（pH 7.0）中进行缓冲液置换。以8,000 × g离心约5分钟。弃去滤过液，重新加入PBS（pH 7.0）后再次离心。
	<ol>
		<li>重复上述操作7–8次，以彻底完成缓冲液置换。将滤膜装置倒置放入洁净的微量离心管中，以1,000 × g离心2分钟，回收浓缩后的7G3蛋白。回收体积约为0.3 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在含有马来酰亚胺活化7G3的离心管中，加入相对于前一步所用磺基-SMCC与7G3摩尔比两倍摩尔过量的ChAcNLS，并于4 °C孵育过夜。例如，若前一步使用了10:1的磺基-SMCC与7G3摩尔比，则此处应使用20:1的ChAcNLS与7G3摩尔比。总体积不应发生显著变化。 
	注意：尽管ChAcNLS在偶联过程中通常不会引起沉淀，但其他肽类可能发生此类情况。反应过程中应观察离心管内是否有沉淀产生，沉淀最可能由疏水性肽引起。在此类情况下，可重新评估目标肽的序列设计，以引入提高亲水性的修饰。</li>
	<li>使用超滤装置将7G3-ChAcNLS浓缩至所需浓度，并在PBS（pH 7.4）中进行缓冲液置换（参见步骤1.4）。总蛋白的回收率应不低于原始起始材料的75%。</li>
	<li>采用12%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，以评估构建的7G3-ChAcNLS候选产物（该凝胶可有效分离ChAcNLS偶联的重链与轻链与未偶联链）。取10 μg 7G3-ChAcNLS样品，与含2 μL β-巯基乙醇的上样缓冲液混合后上样。</li>
	<li>设定适当电压（12%凝胶建议120 V，运行1小时），开始电泳。当考马斯亮蓝染料前沿迁移至凝胶底部时停止电泳。 
	注意：切勿使考马斯亮蓝染料前沿跑出凝胶。</li>
	<li>从电泳装置中取出凝胶，用含10%（v/v）冰乙酸和20%（v/v）甲醇的脱色液冲洗。</li>
	<li>拍摄凝胶图像，使用尺子测量标准蛋白和7G3偶联物的迁移距离（cm），计算相对迁移率（Rf值），即迁移距离除以凝胶长度（从上样位置至考马斯亮蓝染料前沿）。以各标准蛋白的分子量（log值）对Rf值作图，并外推估算7G3偶联物的分子大小。</li>
	<li>通过将7G3偶联物与未修饰7G3之间的分子量差除以1768.5 g/mol（ChAcNLS的分子量），计算每个抗体分子偶联的肽数量。</li>
	<li>对考马斯亮蓝染色的凝胶进行数字成像，并进行密度分析。此时可根据抗体-肽偶联物（AC）中ChAcNLS分子数最多且无明显聚集物的条件，选择最优候选产物。</li>
</ol>
2. 共聚焦显微镜用于评估细胞内累积
注意：在开发携带特定有效载荷的制剂之前，必须测试经肽修饰的单克隆抗体（mAbs）在细胞内累积的细胞选择性。由于 Tat 也被证明容易发生非特异性细胞穿透，因此在使用昂贵的有效载荷进行成本较高的开发步骤之前，首先分析细胞内累积情况和细胞选择性是十分必要的。基于此原因，程序 1 也应对同型特异性的无关对照单克隆抗体进行修饰。在本实验方案的后续部分中，我们将使用每抗体分子连接 10 个 ChAcNLS 分子的抗体偶联物（ACs）。程序 2 和程序 3 的关键步骤示意图见图 2。
警告：本实验步骤涉及对多聚甲醛的处理和操作。操作时请遵循制造商提供的说明。
<ol>
	<li>用 200 nM 的 7G3-ChAcNLS（包括修饰的对照单克隆抗体）处理靶标 TF-1a 细胞。将 5 × 106 个抗原阳性细胞与偶联物在 37 °C 下孵育 1 小时。</li>
	<li>孵育 1 小时后，弃去上清液，并用 1 mL 冰冷的 PBS 洗涤 3 次。加入新鲜培养基，在 37 °C 下继续孵育 1 小时。</li>
	<li>额外孵育 1 小时后，弃去上清液，用 1 mL 冰冷的 PBS 洗涤 3 次。加入 0.5 mL 含 0.25% 胰蛋白酶和乙二胺四乙酸（EDTA）的 PBS，于 37 °C 孵育 3 至 30 分钟。 
	注意：在初始预实验中，建议不进行胰蛋白酶消化，以确定不同抗体-药物偶联物（AC）在细胞内累积的差异。本方案推荐使用胰蛋白酶处理，并展示其如何改善对不同 AC 候选物细胞内累积效率的评估。
	<ol>
		<li>通过显微观察细胞是否全部脱落，测试不同的孵育时间。此外，将细胞等分试样与活率染色液孵育，并如前所述进行流式细胞术分析 40。</li>
		<li>用 1.5 mL 含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 细胞培养基中和胰蛋白酶。在 500 × g 下离心 5 分钟，弃去上清液，并用 0.5 mL 冰冷的 PBS 洗涤 3 次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞重悬于含 1% 多聚甲醛和 1% 蔗糖的 0.5 mL PBS 中，冰上固定 30 分钟。用 0.5 mL 冰冷的 PBS 洗涤细胞 3 次，在 250 × g 下离心 5 分钟。在冰上用含 0.15% Triton X-100 的 0.5 mL PBS 对细胞进行透化处理 5 分钟。用冰冷的 PBS 洗涤细胞，并重复离心步骤。</li>
	<li>将细胞重悬于 0.1 mL PBS 中，加入终浓度为 2 μg/mL（或按生产商推荐浓度）的 AlexaFluor 647 标记的抗小鼠（同种型特异性）Fc 多克隆二抗，在室温避光条件下孵育 1 小时。
	<ol>
		<li>在 250 × g 下离心 5 分钟，用 0.5 mL 冰冷的 PBS 洗涤细胞 3 次，最后将细胞重悬于 0.5 mL PBS 中。 
		暂停：细胞可短期储存于冰箱中。 
		注意：必须选择能够识别目标单克隆抗体正确同种型的二抗。选用 AF647 是因其远红外发射光谱，不会干扰细胞核的碘化丙啶（PI）染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向细胞悬液中加入碘化丙啶（PI），使其终浓度为 10 μg/mL。随后，使用封片剂将 1 × 106 个细胞滴加至载玻片上，并加盖盖玻片。</li>
	<li>使用倒置激光共聚焦显微镜，配备 Plan Apo 60X 油镜（数值孔径 NA 1.42）观察细胞。使用 488 nm 氩激光激发 PI 荧光，光谱扫描棱镜设定为 600–650 nm 范围；AF647 荧光则使用 633 nm 氦氖激光激发，光谱扫描棱镜设定为 650–700 nm 范围。依次采集 PI 与 AF647 的荧光发射信号。 
	注意：在整个细胞评估与比较过程中应保持相同的仪器设置。但需根据胰蛋白酶处理组与未处理组细胞的荧光强度差异适当调整参数。</li>
	<li>使用显微镜配套软件采集图像。以 0.5 μm 为步长，对整个细胞厚度进行连续水平光学切片扫描，采集分辨率为 1,024 × 1,024 像素、2 次线平均的图像。将连续四层光学切片的最大荧光强度投影叠加后呈现图像。</li>
	<li>使用显微镜软件分析细胞。记录偶联物在细胞内的分布模式。具体评估细胞质中胞内荧光是呈聚集状且靠近细胞膜，还是呈弥散均匀分布。同时评估单个细胞的相对荧光强度。</li>
</ol>
3. 用于评估64Cu细胞内递送效率的放射性标记AC构建及细胞组分分离
警告：步骤 3 和步骤 4 涉及放射性物质的操作与处理。在执行这些步骤之前，研究人员必须已获得所在机构辐射安全管理部门批准的安全培训和操作规程。
注意：在步骤3和步骤4中，我们使用单克隆抗体A14，该抗体特异性针对侵袭性膀胱癌抗原IL-5Rα41此外，由于半衰期较短，所有实验均具有时间敏感性 64铜。通常，最好不要超过1周再进行 体外 实验，且最长不超过72小时 体内 研究。
<ol>
	<li>在1.7 mL离心管中，将2,2'-(7-(2-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-2-氧代乙基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二基)二乙酸（NOTA-NHS）溶于DMSO中，配制成10 mM的溶液。</li>
	<li>将过量50倍摩尔量的NOTA-NHS与A14（起始物料2 mg）在pH 8.6的0.1 M碳酸氢钠缓冲液中，于室温反应1小时，总体积不超过0.5 mL（最终NOTA-NHS的体积不应超过总体积的2% v/v）。</li>
	<li>使用超滤装置在pH 7.6的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中对NOTA-A14进行纯化并置换缓冲液（参见步骤1.4）。</li>
	<li>为后续连接ChAcNLS，请继续执行步骤1.2–1.6。</li>
	<li>将NOTA-A14-ChAcNLS（每批250 μg）与100兆贝可（MBq）的64CuCl2在pH 5.5的0.1 M碳酸氢钠缓冲液中，于37 °C反应1小时，总体积不超过0.1 mL。64Cu由CIMS的TR-PET回旋加速器生产42。</li>
	<li>使用超滤装置将64Cu-A14-ChAcNLS浓缩至所需浓度，缓冲液为pH 7.4的PBS（参见步骤1.4）。</li>
	<li>通过薄层色谱法（ITLC）测定64Cu-A14-ChAcNLS的放射标记效率：使用色谱条和pH 5.5的0.1 M柠檬酸钠溶液（ITLC洗脱液）作为展开剂。取0.5 μL反应液点样于ITLC条上，进行放射自显影并获取数字图像。
	<ol>
		<li>进行光密度分析，计算结合态与游离态64Cu的比例。若游离64Cu含量&#62; 5%，则返回前一步骤并进行额外纯化。</li>
		<li>此外，进行考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE以评估聚集情况。再进行一次SDS-PAGE，随后对凝胶进行放射自显影，以判断是否存在放射标记的聚集物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>亲和结合质量检测点：将64Cu-A14偶联物以递增浓度（0–100 nM）与每毫升1 × 106个靶细胞共同孵育，每个浓度设复孔。为评估非特异性结合，将64Cu-A14偶联物与细胞在过量100倍摩尔量的未标记A14存在下共同孵育，同样设复孔。
	<ol>
		<li>冰上孵育1小时后，洗涤细胞，并用γ计数器测定总结合抗体样本和非特异性结合抗体样本的放射性。绘制特异性结合量（总结合量减去非特异性结合量）相对于反应中使用的游离64Cu-A14浓度（nM）的曲线。使用绘图软件通过非线性回归分析确定解离常数（Kd）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行64Cu细胞摄取研究时：将细胞在37 °C下分别用100 nM的64Cu标记A14偶联物处理1小时、6小时和24小时，方法如前所述33。额外设置实验条件，包括在未修饰A14存在下处理以阻断IL-5Rα位点，以及在4 °C下处理以抑制受体介导的内吞作用。</li>
	<li>在预定时间点，按照步骤2.3–2.3.2所述方法，加入0.5 mL含0.25%胰蛋白酶和EDTA的PBS（37 °C），随后进行中和和洗涤。</li>
	<li>将细胞在含1% NP-40、10 mM Tris（pH 7.5）、10 mM NaCl和3 mM MgCl2的细胞膜裂解缓冲液中冰上孵育10分钟。将裂解后的细胞以90 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液并转移至新离心管中，此为细胞质组分。将细胞核用预冷的PBS洗涤3次，并将洗涤液加入细胞质组分中。</li>
	<li>确保盛有细胞核和细胞质组分的样品瓶密封，随后将其放入已校准用于64Cu检测的γ计数器中，将原始计数转换为MBq。</li>
	<li>通过Western blot分析Lamin A/C（一种核特异性蛋白）和Rab7（一种丰富的细胞质蛋白）在全细胞裂解液、细胞核和细胞质组分中的表达，以评估细胞核分离的质量。
	<ol>
		<li>使用500 μL RIPA裂解缓冲液以及步骤3.12中的细胞膜裂解缓冲液（分别含1%、2%和4% NP-40）处理5 × 106个细胞。此外，将分离的细胞核用500 μL RIPA缓冲液处理，以获得分离的核蛋白。</li>
		<li>向分离的核蛋白、细胞质蛋白和全细胞蛋白中加入4倍体积的冷丙酮，于-20 °C沉淀60分钟。13,000 × g离心10分钟，小心倾去上清液，避免扰动蛋白沉淀。加入100 μL PBS溶解蛋白。</li>
		<li>每孔上样10 μg蛋白至10% SDS-PAGE凝胶中。电泳操作按步骤1.7–1.9所述进行。Western blot转膜操作参照文献43所述方法。</li>
		<li>确定与约40 kDa分子量最匹配的蛋白Marker条带，并在此处将膜切开。用Lamin A/C特异性抗体孵育高分子量部分的膜，用Rab7特异性抗体孵育低分子量部分的膜。Western blot为常规技术，本方案中不再详述。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 肿瘤靶向的PET成像评估
注意：将肿瘤细胞植入小鼠以建立异位移植瘤模型的技术已较为成熟，大多数实验室均针对其特定肿瘤体系建立了内部操作流程。因此，本方案未涵盖该部分内容。异种移植模型将采用携带 IL-5Rα 阳性侵袭性膀胱肿瘤 HT-1376 和 HT-B9 的非肥胖型糖尿病/重度联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠。在异种移植瘤中，IL-5Rα 阳性侵袭性膀胱肿瘤细胞占总细胞数的 &#62; 66%。相比之下，已形成的异种移植瘤中仅含有约 11% 的 IL-5Rα 阳性 HT-B9 细胞41。因此，该模型为评估在两种具有可预见患者肿瘤异质性的肿瘤中 AC 肿瘤靶向性提供了极佳范例。
<ol>
	<li>在包含 ≥ 4 只（NOD/SCID）小鼠的组中，通过尾静脉注射 20–30 μg（6–9 MBq）的 64Cu-A14-ChAcNLS、64Cu-A14-NLS 和 64Cu-A14。</li>
	<li>同一天，将含有 5 MBq 64Cu 的圆柱形模体（24.8 mL）放置于设备中，用于将每秒放射性计数转换为每克组织的注入剂量（%ID/g）。</li>
	<li>等待 48 小时后，将小鼠置于诱导室中，以 1.5 L/min 的氧气流速和 2% 异氟烷进行麻醉。诱导后、放入 PET 扫描仪前，向小鼠眼部涂抹无菌眼膏。</li>
	<li>迅速将小鼠以头先进俯卧位转移至 PET 扫描仪台面，并连接异氟烷鼻罩。安放呼吸和直肠探头，监测体温和呼吸频率，以确保实验期间维持生理状态，具体操作如前所述44。</li>
	<li>使用常规采样模式设置和 250–650 keV 的能量窗启动 PET 数据采集。通常每只小鼠进行 45 分钟的静态扫描，即可获得足够的符合事件，用于重建并生成高质量的 PET 图像。</li>
	<li>完成 64Cu-AC 扫描后，将小鼠从扫描仪中取出并放回笼中。待小鼠充分恢复后，再送回动物饲养设施。</li>
	<li>采用三维最大似然期望最大化算法，进行 20 次迭代，获得重建图像。</li>
	<li>使用 AMIDE 软件对肿瘤及可视器官进行感兴趣区域（ROI）分析。
	<ol>
		<li>手动使用 3D 自由手绘工具设置并仔细勾画肿瘤或邻近大腿肌肉区域，以获取定量的 %ID/g 数据。ROI 中每像素的计数将根据前一步骤 4.2 转换为 %ID/g。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>比较 64Cu-A14、64Cu-A14-ChAcNLS 和 64Cu-A14-NLS 的图像在肿瘤对比度、定量 ROI %ID/g 值以及肿瘤与背景比值方面的差异。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

全身递送抗癌药物的主要目标是增加药物在肿瘤部位的富集以及癌细胞内的摄取，同时减少对健康组织的不良副作用。利用抗体偶联物（AC）将分子载荷靶向递送至肿瘤细胞，是一种极具前景的肿瘤治疗与检测方法。然而，由于内体滞留及后续溶酶体降解所导致的疗效降低，仍然是一个重要的挑战。尽管本实验方案以ChAcNLS肽为例说明下一代AC的构建过程，但所描述的操作步骤可适用于任何正在开发的肽修饰AC，旨在提高靶向癌细胞内递送载荷的量。
该方案中最关键的步骤包括：1）识别并限制高分子量聚集体物种；2）在分析前对细胞进行胰蛋白酶消化以测定细胞内蓄积；3）对细胞分馏程序进行质量保证；4）进行PET成像以评估肿瘤靶向性 体内.
病毒源性肽段与单克隆抗体（mAb）偶联时，必须避免形成高分子量的聚集物，此类聚集物极有可能由mAb之间的分子内交联引起。这是首要关注的问题，在进一步实验前应予以解决。若继续使用含有非预期聚集物的肽修饰抗体偶联物（AC），可能导致在细胞内及体内载荷递送特征等方面获得误导性结果。mAb上存在的活性马来酰...

抗体偶联物（ACs）是一类正在发展成为变革性药物的生物制药产品，可用于改善癌症治疗和肿瘤检测。抗体偶联物由单克隆抗体（mAb）与分子载荷（如放射性同位素、小分子和生物毒素）共价连接而成，能够以极高的靶抗原亲和力和特异性将这些载荷递送至癌细胞。因此，抗体偶联物有望显著降低非特异性毒性，并增强载荷在肿瘤部位的活性。在治疗方面，携带细胞毒性小分子的抗体偶联物（通常称为抗体-药物偶联物）已获批用于治疗接受常规疗法失败的乳腺癌和霍奇金淋巴瘤患者1,2。此外，携带放射性同位素的抗体偶联物（通常称为放射免疫偶联物）也正处于研发阶段。一种用于成像的携带放射性同位素的抗体偶联物已获批用于识别前列腺癌转移灶3。随着更多治疗性抗体偶联物提交审批4，人们对抗体偶联物在未来改善癌症诊疗的前景充满期待5。
然而，在递送化疗药物或放射性同位素时，抗体偶联物（ACs）难以有效地将这些载荷在靶细胞内富集。这一局限性在许多情况下显著导致了ACs无法实现持久的无病生存或高对比度的肿瘤成像6,7。通常情况下，一旦ACs结合其靶抗原，便会通过一种称为受体介导的内吞作用的过程被内化。随后，ACs被包裹在内体中，并被转运至溶酶体进行降解和载荷释放8。这种细胞内转运过程给ACs实现对靶向癌细胞的高载荷特异性和高效性带来了挑战。例如，许多抗原（如Her2，治疗性AC曲妥珠单抗-美坦新（Trastuzumab-emtansine）的靶点）在最初30分钟内可将高达85%的结合抗体循环回收9。此外，一旦发生降解，释放出的化疗药物和放射性同位素可能因膜相关转运蛋白的表达增加和/或活性增强而被主动外排10,11。溶酶体降解还阻碍了新型生物载荷（如治疗性酶和寡核苷酸）的递送，这些分子可能在降解过程中失活12,13。本质上，癌细胞能够高效阻断ACs所递送载荷在细胞内的必要积累。
本方案描述了如何实现将ACs与病毒来源的肽偶联，特别是用于逃逸内体捕获并定位于细胞核的方法。由于病毒具有操纵宿主细胞系统的复杂能力，因此将病毒来源的蛋白质和肽开发为潜在生物药物的研究早已深入于治疗领域14。数百万年来，病毒进化出一系列卓越的蛋白质，能够利用哺乳动物细胞正常的生理系统，从而高效进入宿主细胞。对于通过受体介导的内吞作用被摄入的病毒而言，它们还面临逃逸溶酶体转运的挑战，因为溶酶体内局部高浓度的蛋白酶对病毒存活极为不利。在药物递送中，一种已被充分表征、用于逃逸内体捕获的病毒来源肽是人免疫缺陷病毒转录反式激活因子（Tat）蛋白15。Tat能够感知低pH环境，从而引发蛋白构象变化，使其插入并破坏内体膜16，进而使Tat-载荷偶联物得以进入细胞质。与本方案相关的第二个病毒操纵元件是将治疗性基因和药物递送至细胞核的策略17。病毒已进化出可成功操控宿主细胞机制的能力，使其能够通过核孔复合体（NPC）穿越核膜。细胞大分子含有（或结合含有）核定位信号（NLSs），这些信号对于结合核转运蛋白（例如核输入蛋白α和β）至关重要，从而实现通过NPC的必要转运。病毒已进化出含有NLS序列的蛋白质，使其能够利用宿主细胞的转运蛋白将自身穿梭至细胞核内18。
许多抗体-偶联物（AC）此前已被 Tat 和核定位信号（NLS）衍生的多肽功能化，并测试其在癌细胞内蓄积及靶向肿瘤的能力 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30（表1）。在递送细胞毒性载荷的研究中表明，经病毒衍生多肽修饰的 AC 与未修饰的 AC 相比，能够显著增强细胞内蓄积、细胞毒性和肿瘤杀伤能力 22,26。这类新型 AC 的一个共同特征是其构建方式。通常，多肽包含一个末端半胱氨酸，提供一个游离的巯基。单克隆抗体（mAb）首先与一种不可裂解的双功能交联剂反应，该交联剂两端分别含有 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和马来酰亚胺基团。NHS 酯与 mAb 上的伯胺反应形成酰胺键。反应后带有游离马来酰亚胺基团的 mAb 再与多肽上的巯基反应，形成硫酯键，从而将多肽与 mAb 连接起来。尽管已有使用同型双功能交联剂的报道 28，但在构建病毒衍生多肽-AC 时，更常用的是异型双功能交联剂 22,23,26,31,32。本方案特别采用交联剂磺基琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯（sulfo-SMCC），因其使用简便，且已被用于获批的抗体-药物偶联物曲妥珠单抗-美坦新（Trastuzumab-emtansine）以及多种病毒衍生多肽-AC 中 8,22,23,26,31,32。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是初步测定偶联效率以及半定量每分子 mAb 所偶联多肽数量的主要方法。通常使用针对 mAb 的荧光标记二抗进行共聚焦显微镜观察，以初步评估病毒衍生多肽修饰 AC 的细胞内分布特性。迄今为止，病毒衍生多肽修饰 AC 递送的主要载荷为放射性同位素。放射性同位素具有优势，因为细胞中的放射性可通过γ计数轻松定量。此外，将此类 AC 应用于人癌小鼠模型，可使研究人员利用单光子发射计算机断层扫描和正电子发射断层扫描（PET）等分子成像技术评估其肿瘤靶向能力 23,32,33。总体而言，研究人员主要采用的构建与验证测试方法可在早期研发阶段对经病毒衍生多肽修饰的 AC 进行良好评估，以判断其是否能够有效进入靶细胞并递送载荷，以及是否具备肿瘤靶向能力。
经 Tat 和 NLS 修饰的抗体-载荷偶联物（AC）已揭示了进一步改善癌细胞内及肿瘤中载荷递送效果的关键方向。就 NLS 修饰的 AC 而言，其在细胞内累积的效率可能较为有限23,31,34。细胞内累积效率低下的主要原因是持续性的内体滞留。体内肿瘤靶向能力在 Tat 和 NLS 修饰的 AC 中均可能减弱。Tat 和 NLS 的活性序列包含多个带正电荷的残基。当这些序列连接至单克隆抗体（mAb）时，整体阳离子电荷可显著增加35。因此，Tat 和 NLS 修饰的 AC 在健康组织中的摄取增加，并导致血液清除速度加快。
本课题组开发了一种由胆酸与核定位信号（NLS）连接而成的复合化合物（ChAcNLS；图1）。与NLS修饰的传统抗体偶联物（ACs）相比，经ChAcNLS修饰的ACs能够增强递送的放射性同位素在细胞内的积累，并改善对肿瘤的靶向性33,34。胆酸的作用机制灵感来源于某些无包膜病毒——这些病毒无法依赖膜融合，而是利用胆酸通过生成神经酰胺来触发内体逃逸。例如，猪肠道病毒可募集胆酸，激活鞘磷脂酶，后者催化鞘磷脂水解生成神经酰胺36,37,38。这一过程可破坏内体膜的稳定性，从而实现病毒的逃逸。因此，胆酸是另一种可与核定位信号（NLS）协同作用的病毒来源组分。
随着该领域的发展以及病毒衍生肽修饰的抗体偶联物（ACs）在有效载荷递送方面的未来进步，在初始研发阶段提供其生物化学和功能特性的可视化演示显得尤为及时。本文中，我们描述了一套用于初步评估病毒衍生肽修饰ACs的实验方案，以在早期研发阶段简便高效地确定其细胞内累积和肿瘤靶向能力。我们以 commercially available 单克隆抗体 7G3 和 A14 作为示例模型系统。方案1介绍了采用SDS-PAGE作为判断所构建ACs是否进入后续研究的“通过/不通过”决策方法。方案2描述了一种利用胰蛋白酶消化的方法，以更清晰地观察AC在细胞内的分布与累积情况。方案3介绍了一种改进的细胞内组分分离方法，用于准确测定AC的核定位。在本方案中，我们使用了有效载荷 64Cu (t1/2 = 12.7 小时），因为它易受细胞外排作用影响，且为正电子发射体 10因此，步骤4描述了 体内 通过PET成像进行肿瘤靶向性表征，以可视化肿瘤摄取相对于背景的水平即 非靶向健康组织），并确定示例性抗体偶联物（AC）是否能够特异性且有效地靶向肿瘤。这些方法足以帮助研究人员在开发经病毒衍生肽修饰的抗体偶联物时，筛选出值得进一步推进的候选分子。

<table><tbody><tr><td>磺基-SMCC</td><td>Thermo Scientific</td><td>22122</td><td>可选择多种同双功能或异双功能马来酰亚胺交联剂。</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 mL 离心过滤器</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC505096</td><td>提供 8、24 和 96 的包装规格，可根据需求选择。</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Kaleidoscope 标准蛋白</td><td>BioRad</td><td>1610375EDU</td><td>分子量范围为 10 - 250 kDa 的多色重组蛋白。</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200056</td><td>可选择 100 mL 或 500 mL 规格。</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 647 标记</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-21235</td><td>推荐使用浓度为 1 - 10 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>NOTA-NHS</td><td>CheMatech</td><td>C100</td><td></td></tr><tr><td>核纤层蛋白 A/C 抗体（N-18）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-6215</td><td></td></tr><tr><td>Rab7 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-376362</td><td></td></tr><tr><td>A14 单克隆抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>555902</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS 样品缓冲液（4×）</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>TF-1a 细胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-2003</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>ATCC</td><td>ATCC 30-2001</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 裂解与提取缓冲液</td><td>Thermo Scientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>AMIDE 医学影像软件</td><td>可在 amide.sourceforge.net 获取</td><td></td><td>完全免费下载</td></tr><tr><td>FluoView FV1000 共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoview 软件</td><td>Olympus</td><td></td><td>www.olympus-lifescience.com</td></tr><tr><td>ITLC 层析条</td><td>Biodex</td><td>150-771</td><td></td></tr></tbody></table>

利用病毒衍生肽修饰抗体偶联物的初步评估：提高细胞摄取与增强肿瘤靶向性

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

经病毒衍生肽修饰的抗体偶联物（ACs）是一类具有潜在强大功效的肿瘤细胞递送载体，可用于癌症治疗和成像中的分子载荷递送，其细胞内累积程度较现有的ACs有所提高。在早期AC开发过程中 体外 发育、荧光技术以及放射免疫分析足以确定细胞内定位、蓄积效率和靶细胞特异性。目前，对于评估抗体偶联物（AC）细胞内蓄积和定位的细胞制备方法，尚无标准化的共识。对于经病毒来源肽段修饰的抗体偶联物，若已构建多个候选分子，初始测试尤为关键。通过荧光法测定细胞内蓄积时，细胞表面残留的抗体偶联物可能产生背景信号，干扰对蓄积程度的准确解读。在放射免疫分析中，通常需对处理后的细胞进行分馏，并测量不同细胞组分中的放射活性。然而，细胞裂解效果在不同细胞间存在差异，且细胞核与细胞质组分常无法充分分离，可能导致关于载荷递送特性的数据产生误导。在荷瘤小鼠中静脉注射放射性标记的病毒来源肽段修饰抗体偶联物，随后进行放射性核素成像，是评估肿瘤靶向性和载荷递送特性的有力方法 体内 发育阶段。然而，这一进展相对较新，采用此类方法评估病毒衍生肽修饰的AC的研究团队仍然较少。本文描述了对处理后的细胞进行加工的方法，以便在使用共聚焦显微镜和放射免疫分析时更准确地评估病毒衍生肽修饰的AC的积累情况。具体而言，提供了一种使用胰蛋白酶消化细胞以去除细胞表面结合的AC的方法。同时，本文还提供了一种改进细胞分馏效果的方法。最后，本方案提供了 体内 使用正电子发射断层扫描（PET）评估荷瘤小鼠中肿瘤初始靶向特性的方法。我们采用放射性同位素 64Cu (t1/2 = 12.7 h）作为本方案中的示例载荷。

对于方案1，使用磺基-SMCC作为交联剂对7G3进行ChAcNLS修饰的构建过程非常可靠。通常在加载至12%凝胶并进行SDS-PAGE分析时，可观察到分子量（MW）随所用磺基-SMCC与7G3比例的增加而呈现可区分的逐步升高，从而能够分别评估重链和轻链上的ChAcNLS偶联情况（图3）。7G3 在 10:1、20:1、25:1 和 50:1 的 sulfo-SMCC 与 7G3 摩尔比下反应，随后通过 Rf 测量和分子量外推，结果显示每个 7G3 分子分别偶联了 3、7、10 和 20 个 ChAcNLS 分子。经密度测定法分析，单体物种的百分比为 &#62; 7G3修饰3-10个ChAcNLS时为90%。对于7G3-ChAcNLS20 聚集体物种占45%。这表明SDS-PAGE是筛选可用于进一步开发的7G3-ChAcNLS偶联物的一种简单而有效的方法。尽管由于抗体糖基化可能导致抗体链出现轻微拖尾，但这并不影响对聚集体物种的鉴定。
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病毒来源的肽段与抗体偶联物（ACs）相结合是一种日益受到关注的方法，因其具有增强分子载荷在肿瘤细胞内蓄积的潜力。本实验方案利用常规方法评估肽段偶联效率、抗体偶联物及其载荷在细胞内的积累情况以及肿瘤靶向性，可为研究人员在关键的早期研发阶段提供支持。

经病毒衍生肽修饰的抗体偶联物（ACs）是一类具有潜力的肿瘤细胞递送载体，可用于分子有效载荷的递送……

这些实验步骤的总体目标是在抗体偶联物开发的初期阶段，评估其在靶细胞和肿瘤内聚集的特异性和有效性，以便最终应用于临床。该方法有助于回答偶联物研究领域的一些关键问题，例如细胞核定位的效率以及细胞内总体聚集情况。该技术的一个优势在于，研究人员可以通过PET成像来评估候选抗体偶联物的有效性和选择性。这些技术的应用前景涉及癌症的治疗与诊断，因为肿瘤细胞摄取效率低下是抗体偶联物在这些应用中的主要限制因素。根据文本方案合成叶酸-核定位序列抗体偶联物后，用200纳米浓度的7G3叶酸-MLS抗体偶联物处理靶向TF1A细胞。同时设置经修饰的对照单克隆抗体处理的细胞作为对照。将5 × 10⁶个抗原阳性细胞与偶联物在37°C下孵育1小时。然后去除上清液，用1 mL预冷的PBS洗涤细胞3次。加入新鲜培养基，在37°C下继续孵育细胞1小时。接下来，加入含有0.25%胰蛋白酶和EDTA的0.5毫升PBS，将细胞在37摄氏度下孵育最多30分钟。然后使用含10%FBS的1.5毫升RPMI1640培养基中和胰蛋白酶。在500 × g下离心5分钟，弃去上清液，并用0.5毫升预冷的PBS再次洗涤细胞三次。向细胞中加入 0.5 毫升含 1% PFA 和 1% 蔗糖的 PBS 溶液，冰上放置 30 分钟以固定细胞。随后用 0.5 毫升预冷的 PBS 洗涤细胞三次，250 × g 离心 5 分钟。接着向细胞中加入含 0.15% Triton X-100 的 PBS 溶液，冰上透化处理 5 分钟。然后用预冷的PBS洗涤细胞，并重复离心步骤。将细胞重悬于0.1毫升含有2微克/毫升Alexa Fluor 647标记的抗小鼠IgG多克隆二抗的PBS中，在室温避光孵育1小时。在250 × g下离心5分钟，用0.5毫升预冷的PBS洗涤细胞三次。然后将细胞重悬于 0.5 毫升 PBS 中。向细胞中加入终浓度为 10 微克/毫升的碘化丙啶。随后取 1 × 10⁵ 个细胞，用封片剂将其滴加至玻片上，再用盖玻片封片。使用倒置激光扫描共聚焦显微镜，配备 Plan APO 60X 油浸物镜（数值孔径 1.42）观察细胞。采用 488 纳米氩离子激光器，并将光谱扫描棱镜设置为 600 至 650 纳米，以检测 PI 荧光。对于 AF 647 荧光，使用 633 纳米氦氖激光器，并将光谱扫描棱镜设置为 650 至 700 纳米。依次采集PI和AF 647的图像，图像大小为1024 × 1024像素，采用2倍线平均，以0.5微米的间隔贯穿整个细胞厚度进行采集。图像以Z投影形式呈现。分析细胞时，评估并记录细胞质内荧光是成簇且靠近细胞表面，还是弥散且均匀分布。同时评估每个细胞的相对荧光强度。根据文本方案制备并浓缩放射性标记的结肠酸NLS抗体偶联物后，通过在ITLC试纸上点加0.5微升0.1摩尔pH 5.5柠檬酸钠溶液（即ITLC洗脱液）来测定放射标记效率。对试纸进行放射自显影，并获取数字图像。进行密度测定以确定结合态与游离态铜-64的比例。若游离铜-64含量大于5%，则需进一步浓缩样品。对于铜-64细胞蓄积研究，按照先前所述方法，在37摄氏度条件下，分别用100纳米摩尔的铜-64标记A14偶联物处理细胞1小时、6小时和24小时。用未修饰的 A14 处理细胞以阻断 IL5R alpha 细胞，并在 4 摄氏度条件下孵育以抑制受体介导的内吞作用。按照本视频前面演示的步骤，洗涤细胞并用新鲜培养基孵育后，加入含有 0.25% 胰蛋白酶和 EDTA 的 0.5 毫升 PBS，于 37 摄氏度孵育 15 分钟。随后，如前所述中和并洗涤细胞，向细胞中加入质膜裂解缓冲液，在冰上孵育 10 分钟。将质膜裂解的细胞在90 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，并将其转移至新的离心管中。此上清液即为胞质组分。然后用预冷的PBS洗涤细胞核三次，并将洗涤液加入细胞质组分中。确保含有细胞核和细胞质组分的样品管已密封，随后将其放入针对铜-64校准的γ计数器中，以将原始计数转换为兆贝可（megabecquerel）。通过Western印迹法检测核内蛋白lamin AC和细胞质中丰富的蛋白Rab-7，对全裂解液、细胞核组分及细胞质组分进行分析，以评估细胞核分离的质量。用500微升放射性免疫沉淀分析缓冲液（RIPA缓冲液）以及含有1%、2%和4% NP-40的质膜裂解缓冲液分别处理五次10的6次方个细胞。此外，用500微升RIPA缓冲液处理分离的细胞核，以获得分离的核蛋白。向分离的核蛋白、胞质蛋白和全细胞蛋白中加入四倍样品体积的冷丙酮，在-20摄氏度下孵育60分钟。将样品在13,000 × g条件下离心10分钟。小心倾去上清液，避免扰动蛋白质沉淀。然后加入100 µL PBS以溶解蛋白质。按照先前所述方法进行蛋白质印迹后，在40千道尔顿的分子量标记处将膜切成两半。使用针对lamin-AC的特异性抗体检测含有较高分子量蛋白质的印迹部分，使用Rab-7特异性抗体检测膜的下半部分。在包含四只nodskit小鼠的组别中，经尾静脉注射20至30微克放射性标记的A14胆酸-NLS抗体偶联物、放射性标记的A14 NLS以及放射性标记的A14。同一天，将含有5兆贝可铜-64的圆柱形模体放入PET扫描仪中，以将每秒放射性计数转换为每克组织的注射剂量。48小时后，按照文本所述方案麻醉小鼠，迅速将小鼠以头部朝前俯卧位转移至PET扫描仪载物台上，并连接异氟烷鼻罩。采用常规采样模式设置和250至650千电子伏的能量窗，开始PET数据采集。扫描完成后，将小鼠从扫描仪中取出，并放回笼中。如图所示，箭头指示了在有无胰蛋白酶消化情况下评估抗体偶联物积累的差异。在未进行胰蛋白酶消化的细胞中，由于靶细胞表面受体的过表达，难以评估细胞内积累和分布情况。箭头显示了在细胞经过适当胰蛋白酶消化后，两种抗体偶联候选物在细胞内积累和分布的差异。放射性标记的 A14 胆酸-NLS 抗体偶联物对 IL5R α 具有纳摩尔级亲和力。随着放射性标记的 A14 胆酸-NLS 抗体偶联物浓度增加，该偶联物在 HT-1376 和 HT-B9 细胞中的特异性结合在浓度达到 3.5 纳摩尔时接近饱和。伽马计数显示，放射性标记的 A14 结肠酸 NLS 抗体偶联物在细胞核和细胞质中放射性增加具有特异性，并随时间延长而升高。HT-1376 和 HT-B9 细胞用含 1%、2% 或 4% NP-40 的质膜裂解缓冲液进行孵育。对于 HT-1376 和 HT-B9 细胞，含 1% 或 2% NP-40 的裂解缓冲液中，Rap-7 在核组分中未被检测到，而核纤层蛋白 AC 在胞质组分中未被检测到。PET成像可用于评估候选抗体偶联物靶向抗原阳性肿瘤（红蓝箭头所示）的能力，以及与未经肽段修饰的母体抗体相比的生物分布特性。通过观察肿瘤中信号的累积情况，有助于筛选具有开发潜力的抗体偶联物。PET成像还可用于评估候选抗体偶联物在肝脏等健康组织中的摄取情况。掌握这些技术后，从事分子载荷靶向肿瘤递送领域的研究人员将能够探索其他因内体滞留而阻碍肿瘤细胞蓄积的药物。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

病毒衍生肽修饰抗体结合物对增强细胞积累和改善肿瘤靶向性的初步评价

本视频展示了利用共聚焦显微镜评估病毒来源的肽段修饰抗体偶联物在细胞内分布的过程。病毒来源的核定位序列可引导抗体偶联物进入细胞质，该过程通过免疫染色和荧光检测得以证实。...

评估病毒衍生肽修饰抗体偶联物的细胞内分布

在此，作者介绍了一种利用纯化的单克隆抗体，通过点印迹杂交结合肽段扫描来确定线性抗原表位的简单且高效的方法。所鉴定出的表位可进一步用于治疗和诊断应用。...

借助肽扫描技术鉴定单克隆抗体识别的线性B细胞表位

我们已将戊型肝炎病毒的衣壳蛋白设计为一种诊疗一体化的纳米颗粒（HEVNP）。HEVNP 在黏膜递送过程中可自组装成稳定的二十面体笼状结构。本文描述了通过将表面暴露的残基突变为半胱氨酸，从而对 HEVNP...

利用化学偶联方法对戊型肝炎病毒纳米颗粒进行表面功能化

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本方案详细描述了用于表达免疫调节剂的溶瘤病毒的生成及其体外表征的工作流程，以编码双特异性T细胞衔接器的麻疹病毒为例。该方法可应用于其他载体平台和转基因，从而加速新型免疫病毒治疗药物的临床转化开发。...

用于肿瘤靶向免疫调节的副粘病毒：体外设计与评估

在本实验方案中，我们将描述PODS的合成方法。PODS是一种基于苯并恶二唑基甲基砜的试剂，可用于将载荷分子位点选择性地连接到生物分子（尤其是抗体）的巯基上。此外，我们还将描述含PODS的双功能螯合剂的合成与表征，以及其与一种模型抗体的偶联过程。...

合成用于制备位点选择性修饰免疫偶联物的巯基反应性试剂及其生物偶联方法

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体内免疫荧光定位法评估治疗性和诊断性抗体在癌症研究中的生物分布

本文介绍了一种在小鼠肿瘤异种移植模型中研究抗体体内定位的实验方案。...

分析靶抗原特异性治疗性抗体在肿瘤及组织中的分布

我们描述了一种将模型抗原卵清蛋白化学偶联至内吞作用受体特异性抗体的方案，用于体内树突状细胞靶向。该方案包括抗体的纯化、抗原的化学偶联、偶联物的纯化以及偶联效率的验证。...

化学偶联靶向DEC-205的纯化抗体与全长蛋白以靶向小鼠树突状细胞 体外 和 在体 内

本文介绍一种用于鉴定可调节ADCC机制化合物的方法，ADCC是抗肿瘤抗体杀伤癌细胞的重要机制。通过该方法，在存在曲妥珠单抗（Trastuzumab）的条件下，检测自然杀伤（NK）细胞对乳腺癌细胞球状体的细胞毒性作用。图像分析可识别球状体中存活和死亡的效应细胞及靶细胞。...

在肿瘤类球体模型中定量抗体依赖性细胞介导的细胞毒性：用于药物发现的应用

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