病毒衍生肽修饰抗体结合物对增强细胞积累和改善肿瘤靶向性的初步评价
2018年3月8日
病毒衍生肽与抗体结合 (ACs) 是一种获得动力的方法, 由于可能提供的分子负载增加肿瘤细胞积累。利用常用的方法来评估肽共轭、AC 和有效载荷的胞内积累和肿瘤靶向, 这项协议帮助研究人员在关键的初步发展阶段。
这些程序的总体目标是评估抗体偶联物在初始开发阶段在靶细胞和肿瘤内积累的特异性和有效性，以便它们最终可用于临床。该方法可以帮助回答共轭场的关键问题，例如核定位的效率和整体细胞间积累。该技术的一个优点是，研究人员可以通过 PET 成像评估候选抗体偶联物的有效性和选择性。
这些技术的影响延伸到癌症的治疗和诊断，因为无效的肿瘤细胞积累是抗体偶联物的这些应用的主要限制。根据文本方案合成大肠杆菌酸核定位序列抗体偶联物后，用 200 纳摩尔 7G3 大肠香酸 MLS 抗体偶联物处理靶 TF1A 细胞。包括用修饰的对照单克隆抗体处理的细胞。
将 6 个抗原阳性细胞与 37 摄氏度共孵育 10 次 10 次，持续 1 小时。然后去除上清液，用 1 毫升冰冷的 PBS 洗涤细胞 3 次。加入新鲜培养基，并在 37 摄氏度下再孵育细胞一小时。
接下来，加入 0.5 毫升含有 0.25% 胰蛋白酶和 EDTA 的 PBS，并将细胞在 37 摄氏度下孵育长达 30 分钟。然后使用 1.5 毫升含 10% FBS 的 RPMI1640 培养基中和胰蛋白酶。将细胞以 500 倍 G 离心 5 分钟，去除上清液，并使用 0.5 毫升冰冷的 PBS 再次洗涤细胞 3 次。
向细胞中加入 0.5 毫升 1% PFA 和 1% 蔗糖和 PBS，将它们置于冰上 30 分钟以固定。然后使用 0.5 毫升冰冷的 PBS 洗涤细胞 3 次，并以 250 倍 G 离心样品 5 分钟。接下来，向细胞中加入 0.15%Triton X-100 和 PBS，并在冰上透化 5 分钟。
然后，用冰冷的 PBS 洗涤细胞，并重复离心。将细胞悬浮在 0.1 mL PBS 中，每毫升含有 2 μg 与 Alexa Fluor 647 偶联的抗镜像 FC 二抗，并将样品在室温下避光孵育 1 小时。将细胞以 250 倍 G 离心 5 分钟，并使用 0.5 毫升冰冷的 PBS 洗涤细胞 3 次。
然后将细胞悬浮在 0.5 毫升 PBS 中。向细胞中加入每毫升 10 微克碘化丙啶。然后使用封固剂将第五个细胞的 10 次安装到载玻片上，然后用玻璃盖玻片覆盖样品。
在倒置激光扫描共聚焦显微镜上使用 Plan APO 60X 油浸物镜（数值孔径 1.42）检查细胞。使用 488 纳米氩激光器和 600 至 650 纳米光谱扫描棱镜组检测 PI 荧光。对于 AF 647 荧光，请使用 633 纳米氦氖激光器和设置为 650 至 700 纳米的光谱扫描棱镜。
按顺序从 PI 和 AF 647 收集图像，1024 x 1024 像素，以 2 倍线平均法，以 0.5 微米的间隔在整个单元厚度上拍摄。将图像显示为 Z 投影。为了分析细胞，评估和记录细胞质中的细胞内荧光是成组的并靠近细胞表面，还是弥漫且均匀的。
还要评估每个细胞的相对荧光强度。根据文本方案制备和浓缩放射性标记的胆汁酸 NLS 抗体偶联物后，通过将 0.5 微升 0.1 摩尔 PH5.5 柠檬酸钠或 ITLC 洗脱液施加到 ITLC 试纸条上来确定放射性标记效率。形成试纸的放射自显影，并获得数字图像。
进行光密度测定以获得结合和游离铜 64 的比例。如果游离铜 64 含量大于 5%，则进一步浓缩样品。对于 Copper-64 细胞积累研究，如前所述，在 37 摄氏度下用 100 纳摩尔的 Copper-64 标记的 A14 偶联物处理细胞 1 小时、6 小时和 24 小时。
用未修饰的 A14 处理细胞以阻断 IL5R αcytes，并在 4 摄氏度下阻断受体介导的内化。洗涤细胞并与新鲜培养基孵育后，如本视频前面所示，加入 0.5 毫升含有 0.25% 胰蛋白酶和 EDTA 的 PBS，并在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。然后，像以前一样中和和洗涤细胞后，向细胞中加入血浆膜裂解缓冲液，并在冰上孵育 10 分钟。
将血浆膜裂解的细胞以 90 倍 G 离心 5 分钟。去除上清液，并将其转移到新试管中。这代表细胞质部分。
然后使用冰冷的 PBS 洗涤细胞核 3 次，并将洗涤液添加到细胞质组分中。确保含有细胞核和细胞质组分的小瓶密封，然后将它们放入针对铜 64 校准的伽马计数器中，以便将原始计数转换为兆贝卡利。通过对 lamin AC（一种限制性核蛋白）进行 Western-Blot 分析来确定细胞核分离的质量;Rab-7 是一种丰富的细胞质蛋白，用于批发裂解物、细胞核和细胞质组分。
用 500 微升放射降氨测定法或 RIPA 缓冲液和含有 1%2% 和 4%NP-40 的血浆膜裂解缓冲液处理 6 个细胞的 5 乘以 10。此外，用 500 微升 RIPA 缓冲液处理分离的细胞核以获得分离的细胞核蛋白。向分离的细胞核蛋白、细胞质蛋白和批发蛋白中加入四倍样品体积的冷丙酮，并在零下 20 摄氏度下孵育 60 分钟。
将样品以 13， 000 倍 G 离心 10 分钟。倒出上清液，注意不要使蛋白质沉淀脱落。然后加入 100 微升 PBS 以溶解蛋白质。
如前所述进行 Western Blotting 后，在 40 道尔顿分子量标记处将膜切成两半。使用 lamin-AC 特异性抗体探测含有较高分子量蛋白质的印迹，并使用 Rab-7 特异性抗体探测膜的下半部分。在包含四只 nodskit 小鼠的组中，向尾静脉注射 20 至 30 微克放射性标记的 A14 绞痛酸 NLS 抗体偶联物、放射性标记的 A14 NLS 和放射性标记的 A14。
同一天，将含有 5 兆倍铜 64 的圆柱形模型放入 PET 扫描仪中，以将每秒放射性计数转换为每克组织的注射剂量。48 小时后，根据文本方案麻醉小鼠后，用异氟醚鼻锥将小鼠快速转移到头先俯卧位的 PET 扫描仪台上。使用常规采样模式设置和 250 至 650 千电子伏特的能量窗口启动 PET 数据采集。
扫描后，从扫描仪中取出鼠标，然后将其放回笼子中。如图所示，箭头显示了评估有胰蛋白酶消化和没有胰蛋白酶消化的抗体偶联物积累时的差异。在未胰蛋白酶消化的细胞中，由于靶细胞表面受体的过度表达，细胞内积累和分布难以评估。
箭头显示了当细胞正确胰蛋白酶消化时，两种抗体偶联候选物的细胞内积累和分布的差异。放射性标记的 A14 大肠杆菌酸 NLS 抗体偶联物对 IL5R α 具有纳摩尔亲和力。随着放射性标记的 A14 绞痛酸 NLS 抗体偶联物浓度的增加，A14 绞痛酸 NLS 抗体偶联物的特异性结合在 HT-1376 和 HT-B9 细胞中均接近饱和，浓度为 3.5 纳摩尔。
γ 计数显示，放射性标记的 A14 绞痛酸 NLS 抗体偶联物在细胞核和细胞质中的放射性增加是特异性的，并且随着时间的推移而增加。HT-1376 和 HT-B9 细胞与含有 1%2% 或 4%NP-40 的血浆膜裂解缓冲液一起孵育。对于 HT-1376 和 HT-B9 细胞，在细胞核组分中未检测到含有 1 或 2% NP-40 Rap-7 的裂解缓冲液，在细胞质组分中未检测到核纤层蛋白 AC。
PET 成像可以评估候选抗体偶联物靶向抗原阳性肿瘤的能力、红色和蓝色箭头，以及与亲本非肽修饰抗体相比，它们相关的生物分布特性。人们可以看到肿瘤中信号的积累，以帮助选择已开发的抗体偶联物的潜力。PET 成像还允许评估候选抗体偶联物在健康组织（如肝脏）中的摄取。
掌握这些技术后，分子有效载荷靶向肿瘤递送领域的研究人员将能够探索由于内体包埋而阻碍肿瘤细胞积累的其他药物。
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概述
该协议概述了评估抗体偶联物在靶向肿瘤细胞方面的特异性和有效性的方法。它强调了评估细胞内积累和核定位对于增强临床应用的重要性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 生物化学
背景
- 抗体偶联物可以直接将治疗剂输送到肿瘤细胞。
- 有效的肿瘤细胞积累对这些疗法的成功至关重要。
- 目前用于评估偶联物有效性的方法有限。
- PET等成像技术可以提供有关偶联物行为的洞察。
研究目的
- 评估抗体偶联物在靶向肿瘤细胞方面的有效性。
- 评估偶联物的核定位效率。
- 提高基于抗体的治疗的临床适用性。
使用的方法
- 合成胆酸核定位序列抗体偶联物。
- 用特定抗体偶联物处理目标TF1A细胞。
- 与修改的对照单克隆抗体进行比较。
- 利用PET成像评估偶联物的有效性。
主要结果
- 证明了抗体偶联物在靶细胞中积累的能力。
- 提供了有关核定位效率的见解。
- 强调了PET成像在评估偶联物选择性方面的潜力。
- 指出了当前肿瘤细胞积累技术的局限性。
结论
- 抗体偶联物在靶向癌症治疗方面显示出前景。
- 需要进一步优化以增强肿瘤细胞积累。
- 成像技术可以显著帮助开发有效的偶联物。
常见问题
Executive Industry Relevance
Early-stage evaluation of antibody-conjugates modified with viral-derived peptides addresses a critical bottleneck in targeted oncology therapeutics by enabling precise measurement of intracellular accumulation and tumor targeting. Improved quantification and compartmentalization of payload delivery inform predictive confidence at the target validation and lead selection inflection points. These methods support risk-adjusted advancement of candidates with superior tumor cell uptake and specificity, directly impacting portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous assessment of intracellular and nuclear accumulation for candidate de-risking.
- Supports functional validation of antibody-conjugate modifications for enhanced tumor cell delivery.
- Facilitates comparative evaluation of multiple constructs to inform go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Standardizes cell preparation and surface-clearing steps to improve assay reproducibility.
- Delivers quantitative readouts of intracellular localization using confocal microscopy and radioimmunoassays.
- Enables robust screening of candidate conjugates for cellular uptake and specificity.
Translational & Preclinical Research
- Integrates PET imaging for in vivo assessment of tumor targeting and biodistribution.
- Aligns in vitro accumulation data with in vivo delivery outcomes for translational continuity.
- Supports early identification of candidates with favorable tumor-to-normal tissue uptake profiles.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical validation by providing standardized, quantitative methods for evaluating antibody-conjugate performance in both cellular and animal models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on payload delivery efficiency and subcellular localization.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for candidate triage and optimization.
- Analytics: Delivers compartment-specific measurements and statistical comparisons across constructs.
- Translational Research: Connects in vitro accumulation with in vivo tumor targeting via PET imaging.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular evaluation platform adaptable to diverse antibody-conjugate formats.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in candidate selection by clarifying mechanistic delivery barriers.
- Operational Value: Improves standardization and reproducibility across R&D teams and studies.
- Strategic Value: Enables data-driven go/no-go decisions, reducing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antibody-conjugates with superior tumor targeting properties.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, radioimmunoassays, and PET imaging.
- Demands access to radiolabeling infrastructure and animal imaging facilities.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of cell processing and fractionation protocols.
- Adaptable to various antibody-conjugate and cell line systems with protocol optimization.
- Potential limitations include variability in cell lysis and compartment isolation affecting data interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:07
Confocal Microscopy for Intracellular Accumulation Evaluation
11:30
Conclusion
9:22
Results: Evaluation of Intracellular Accumulation of Antibody Conjugates
4:49
Radiolabeled AC Construction and Cellular Fractionation for the Evaluation of 64Cu Intracellular Delivery Efficiency
8:23
PET Imaging Evaluation of Tumor Targeting
