为了应对抑菌活性的实时成像人力初级中性粒细胞和单核细胞一种。曲霉

在这里，我们描述了一种协议与活细胞视频显微结合使用荧光曲霉分生孢子记者评估初级人类免疫细胞的抗真菌活性在实时和流式细胞术。所生成的数据提供深入了解宿主细胞曲霉相互作用如杀真菌活性，吞噬作用，细胞迁移和真菌生长的抑制。

该程序的总体目标是使用荧光曲霉报告分生孢子和活细胞视频显微镜实时评估原代人类免疫细胞的抗真菌活性。这种方法可以帮助回答有关特定患者群体对真菌感染的免疫反应的关键问题，特别是暴露于真菌早期发生的先天免疫反应。该技术的主要优点是可用于识别先天免疫和抗真菌免疫的特定缺陷，例如吞噬细胞迁移、杀死真菌生长的抑制。

首先，在两个 T75 培养瓶中制备的琼脂上划线携带荧光 dsRed 报告基因的烟曲霉菌株 AF293。将培养物在 37 摄氏度、5% CO2 下孵育 7 天，以获得大约 10 到第 9 个分生孢子。孵育后，将培养物浸入 20 毫升含 0.05% 吐温 80 的 PBS 中，并收集烟曲霉分生孢子。

然后使用 40 微米的细胞过滤器，将所得悬浮液过滤到 50 毫升试管中，以去除菌丝碎片。悬浮液过滤后，以 805 倍 G 离心 10 分钟。然后弃去上清液，将沉淀重悬于 20 毫升无菌 PBS 中。

最后，合并样品并再次离心所得悬浮液。将沉淀重悬于 5 ml PBS 中，并将 1 mL等分试样获得的分生孢子悬浮液转移到微量离心管中。将等分试样在室温下以 9， 300 倍 G 离心 10 分钟。

然后小心吸出上清液，并将分生孢子沉淀重悬于一毫升 0.05 摩尔碳酸氢钠中，PH 值为 8.3。为了标记分生孢子，向微量离心管中加入 10 μL 生物素储备液，用铝箔覆盖样品，并在 4 摄氏度的摇床上孵育 2 小时。将生物素标记的样品以 9， 300 倍 G 离心 10 分钟后，小心去除上清液。

然后将分生孢子沉淀重悬于 1 毫升 100 微摩尔 Tris-HCL 溶液中，PH 值为 8.0。并将此悬浮液在 4 摄氏度下孵育 1 小时，轻轻搅拌以灭活未结合的生物素。将样品以 9， 300 倍 G 离心 10 分钟。

小心地去除所得的上清液，用 1 毫升无菌 PBS 洗涤沉淀，然后将沉淀重悬于 1 毫升 PBS 中。然后将 10 微升链霉亲和素-AF633 储备液添加到 1 毫升分生孢子悬浮液中。将覆盖有铝箔的悬浮液在室温下在摇杆上孵育 40 分钟。

样品以 9， 300 倍 G 离心 10 分钟。然后小心地去除上清液，并将分生孢子沉淀重悬于 1 毫升 PBS 中。使用血细胞计数器，以 1 比 1， 000 稀释度计数分生孢子，然后用 CO 2 非依赖性培养基将分生孢子浓度调节为每毫升 10 至第 6 个分生孢子的 3.6 倍。

最后，用箔纸包裹悬浮液并在 4 摄氏度下储存。收集并用 PBS 稀释人血样品。然后使用带有铁针的注射器在血液样本中加入 15 毫升用于分离单核细胞的培养基。

样品以 630 倍 G 离心 20 分钟，无中断且加速度较低。用巴斯德移液器收集位于黄色血清和透明淋巴细胞分离溶液层之间的中心 PBMC 层。然后将收集的悬浮液转移到新的 50 毫升试管中。

用 PBS 稀释 PBMC 以获得 50 毫升的悬浮液并洗涤细胞。洗涤后，将 20 微升细胞悬液与 160 微升 PBS 和 20 微升台盼蓝混合，并用血细胞计数器计数细胞。计数后，在 15 毫升试管中稀释至适当浓度，以 515 倍 G 离心细胞 10 分钟，然后使用每 1 倍 10 至 7 个细胞的 40 微升缓冲溶液重悬细胞。

将 10 微升 CD14 MicroBeads 每 1 乘以 10 添加到第 7 个细胞中并充分混合。将样品在 4 摄氏度下孵育 15 分钟，确保每 5 分钟混合一次试管。偶联后，用每 1 次 10 次 1 毫升缓冲溶液洗涤细胞至第 7 个细胞，并以 515 次 G 离心悬浮液 10 分钟。

然后在 500 μL 缓冲溶液中重悬至第 8 个细胞的 1 倍。按照制造商的说明，将一根与单个样品一起使用的色谱柱安装在磁力分离器上，并用 500 μL 缓冲溶液清洗色谱柱一次。将 500 μL 细胞悬液加载到色谱柱上。

干燥后，使用缓冲溶液洗涤色谱柱 3 次。在色谱柱下方放置一根新的 15 ml 试管，然后将色谱柱从磁性分离器上拆下。然后使用 1 mL 缓冲溶液，将细胞从色谱柱洗脱到试管中。

在 RPMI 培养基中洗涤并重悬洗脱的细胞。将细胞密度调整到每毫升第 5 个细胞的 6 倍 10 到 5 后，将 200 微升悬浮液接种在 35 毫米玻璃成像皿上。将培养物在 37 摄氏度和 5% CO2 中孵育过夜。

为了分离中性粒细胞，从 PBMC 收获后剩余的血液样本中去除所有血清和大部分淋巴细胞分离液。确保不要去除红色颗粒顶部的白色细条带。将细胞保持在冰上，然后裂解红细胞并以 394 倍 G 离心剩余的中性粒细胞，然后用冷 PBS 洗涤细胞两次，然后重悬于一毫升 CO2 非依赖性培养基中。

对于流式细胞术，将细胞密度调整为每毫升第 5 个细胞的 6 乘以 10，并将 400 微升细胞悬液添加到 24 孔板中。将 200 微升相同的细胞悬液添加到 35 毫米玻璃成像皿中进行显微镜检查。要在显微镜检查期间可视化 dsRed 和 Alexa Fluor 633，请预热显微镜加热器并打开显微镜和计算机。

接下来，将 100 微升 3 乘以 10 的剂量添加到每毫升第 6 个 FLARE 分生孢子悬浮液中，添加到成像皿的相应孔中。记录 FLARE 分生孢子的添加时间。将成像皿安装在显微镜载物台上，然后在采集设置中，将激光功率设置为 10%，将曝光时间设置为 1 秒。

调整相机灵敏度以获得清晰但不过度曝光的 dsRed 和 AF633 图像，并设置舞台点列表。当所有点都聚焦、优化荧光通道并设置周期时间和持续时间时初始化成像。这里展示的是中性粒细胞和 FLARE 分生孢子同时培养期间拍摄的图像。

对应于 AF633 染色的绿色荧光信号在活分生孢子和死分生孢子中均可见。而 dsRed 荧光只能在活的分生孢子中观察到。因此，在所有检测到的分生孢子中，只有那些同时被两种染料染色并显示为洋红色斑点的分生孢子是活的。

使用流式细胞术定量与小鼠肺泡巨噬细胞共培养的烟曲霉分生孢子的吞噬作用和杀伤。在分析中，旁观者巨噬细胞用橙色门标记，而与死亡分生孢子相关且仅 AF633 染色阳性的巨噬细胞显示在蓝色门内。此外，死亡的分生孢子不显示钙荧光白色染色，表明它们在细胞内定位。

用 dsRed 和 AF633 染色的活分生孢子标有红色门，这些分生孢子也被内化在巨噬细胞内化，钙荧光白染色减少证明了这一点。最后，评估了烟曲霉对人中性粒细胞迁移的影响，揭示了与静止分生孢子相比，免疫细胞对肿胀的分生孢子的运动和速度增加。一旦掌握，该技术可以在 8 小时内对单个细胞群完成。

在执行此程序时，重要的是要记住将细胞保持在冰上。在此程序之后，可以执行其他方法，如活性氧或胞质分裂的测量，以提供有关同一细胞群中先天性抗真菌免疫反应的更多信息。开发后，这项技术为真菌免疫学领域的研究人员探索利用原代免疫细胞中的真菌病原体进行吞噬作用和抗真菌杀伤铺平了道路。

观看本视频后，您应该对如何使用荧光曲霉报告分生孢子和活细胞视频显微镜实时评估原代人免疫细胞的先天性抗真菌免疫反应有很好的了解。不要忘记，与人体血液打交道可能很危险，应始终采取适当的个人防护装备预防措施来防止感染传播。