使用BrUTP链特异性转录运行的（TRO）方法终止转录分析
2017年3月12日
我们描述了一种基本的实验方法，用于通过出芽酵母中的链特异性转录运行（TRO）方法在体内使用BrUTP分析RNA聚合酶II的转录终止。该方案可以扩展到研究酵母和高等真核生物中其他 RNA 聚合酶的转录终止。
该程序的总体目标是研究在体内条件下通过链特异性转录运行方法终止 RNA 聚合酶对出芽酵母的转录。这种方法有助于回答关键问题，即在基因的三个主要末端之外检测到的转录活性聚合酶是否是从启动子区域启动的聚合酶。这种方法的主要优点是它可以区分 mRNA 转录聚合酶和普遍转录聚合酶，后者启动转录并将位于基因的三个主要端。
由于不同聚合酶终止的保守性质，该技术可以扩展到研究其他 RNA 聚合酶和酵母的转录终止。虽然这种方法可以深入了解终止因子在酵母转录周期中的确切作用，但它也可以扩展到研究高等真核生物的终止。通常，刚接触这种方法的个体将难以进行细胞透化和转录，因为它们需要仔细执行，并且新生转录本也可能难以纯化。
我们首先从 GRO seek 方法中想到了这种方法，该方法以链特异性方式给出了转录活性聚合酶位置的全基因组快照。该方法的视觉演示至关重要，因为由于新生转录本的含量低且不稳定，转录运行和 RNA 纯化难以进行。在开始转录反应运行之前，生长、收获和透化指数增长的酵母细胞，以获得透化的细胞调色板。
要开始反应，请将 150 μL 在缓冲液上运行的转录添加到透化的细胞调色板中。使用截短的 P-200 吸头上下移液轻轻混合。将样品放在冰上。
在缓冲液上运行转录后，将所有样品重悬后，将样品在 30 摄氏度下在水浴中孵育 5 分钟。向每个样品中加入 500 μL 冷即用型 RNA 分离试剂，终止反应。在室温下孵育 5 分钟。
开始 RNA 提取程序时，向每个细胞悬液中加入 200 μL 酸洗玻璃珠，并在涡旋混合器中以 4 摄氏度剧烈摇晃 20 分钟。20 分钟后，用 22 号热针刺穿每个微量离心管的底部，并将管放在 15 毫升无菌锥形管的顶部。在 4 摄氏度下以 300 倍 G 离心 1 分钟，然后将细胞裂解物转移至 1.5 mL 微量离心管中。
向细胞裂解物中加入 500 μL 冷 RNA 分离试剂和 200 μL 氯仿。在涡旋混合器上混合内容物，然后在 4 摄氏度下以 16， 168 倍 G 离心 20 分钟。将上层水相转移到新的微量离心管中。
加入等体积的冷酚氯仿异戊醇。在涡旋混合器上剧烈摇晃，然后在 4 摄氏度下以 16、168 倍 G 离心 15 分钟。将含有 RNA 的上层水相转移到新的微量离心管中。
加入等体积的冷酚氯仿异戊醇，涡旋并再次离心。向含有水相的最终 RNA 中加入适当体积的 5 摩尔氯化钠原液，使最终浓度为 0.3 摩尔。加入三倍体积的冷乙醇以沉淀 RNA。
在 20 摄氏度下孵育 1 小时或过夜。RNA 沉淀完成后，在 4 摄氏度下以 16， 168 倍 G 离心 20 分钟。去除上清液，将 RNA 调色板重悬于 100 μL DEPC 水中。
使用 RNA 分离试剂盒将 RNA 从未掺入的溴尿苷三磷酸核苷酸中分离，并用 100 μL 不含 RNAse 的水从柱中洗脱 RNA。将 RNA 在 65 摄氏度的水浴中孵育 5 分钟。然后转移到冰上至少两分钟。
通过在沉淀 RNA 时制备抗溴 DU 珠子来开始此过程。对于每个样品，将 500 微升 0.25 X 盐水磷酸钠 EDTA 结合缓冲液添加到 25 微升沉淀的微珠中。在 4 摄氏度下以 200 倍 G 离心 30 秒，然后去除上清液。
用结合缓冲液洗涤珠子 3 次。从第三次洗涤中取出上清液后，向珠子中加入 500 μL 封闭缓冲液，并在平台摇床上以 4 摄氏度轻轻摇晃 1 至 2 小时。用 500 μL 结合缓冲液再洗涤珠子两次。
从第二次洗涤中取出上清液，并向珠子中加入 400 μL 结合缓冲液。将 100 μL RNA 直接转移到磁珠上。在 4 摄氏度下在平台摇床上轻轻摇动孵育 1 到 2 小时。
在 4 摄氏度下以 200 倍 G 旋转 30 秒，然后去除上清液。接下来，向珠子中加入 500 μL 结合缓冲液。在 4 摄氏度下以 200 倍 G 离心 30 秒，然后去除上清液。
以这种方式，用结合缓冲液、低盐缓冲液、高盐缓冲液依次洗涤珠子，并用 TET 缓冲液洗涤两次。要从磁珠中洗脱溴尿苷三磷酸标记的 RNA，加入 150 μL 洗脱缓冲液，并在 42 摄氏度下在水浴中孵育 4 分钟。短暂旋转并收集上清液。
以这种方式，依次用 150 μL 洗脱缓冲液洗脱 2 次，用 200 μL 洗脱缓冲液洗脱 1 次。应从每个样品中获得约 500 μL 亲和纯化的溴尿苷三磷酸标记 RNA。为了沉淀亲和纯化的三磷酸溴尿苷标记的 RNA，向每个样品中加入 500 μL 冷苯酚氯仿异戊醇。
涡旋并在 4 摄氏度下以 16、168 倍 G 离心 15 分钟。将上层水相转移到新的微量离心管中。加入适当体积的 5 摩尔氯化钠原液，使最终浓度为 0.3 摩尔。
然后加入三倍体积的冷乙醇。在 20 摄氏度下孵育过夜以沉淀 RNA。第二天，在 4 摄氏度下以 16 倍 G 离心 16 倍 G 30 分钟，收集沉淀的 RNA。
取出上清液，让调色板风干 10 分钟。将 RNA 调色板重悬于 26 μL DEPC 水中。通过使用分光光度计测量 260 纳米处的吸光度来确定最终的 RNA 浓度。
将 RNA 样品和等分试样储存在 80 摄氏度，直到需要合成 cDNA。溴尿苷三磷酸链特异性转录运行方法用于测试 RNA 14 终止出芽酵母中 ASC1 基因转录的要求。纯化来自 RNA 14-1 突变体及其同基因野生型细胞的溴尿苷三磷酸标记的 RNA，并用引物 C、D、E、F 和 G 逆转录，使用引物对 B 和 C、B 和 D、B 和 E、B 和 F、B 和 G 对相应的 cDNA 进行 PCR 扩增，并在琼脂糖凝胶上分级分离。
突变体中存在来自引物对 B 和 E、B 和 F 以及 B 和 G 的 PCR 扩增产物，反映了终止通读表型。然而，在野生型细胞中，转录运行信号仅限于终止子元件，并且在终止子区域之外没有可检测的转录运行信号。该图显示了以 5 个 S RNA 作为归一化对照的凝胶的定量。
检测启动子启动的新生转录本，这些转录本在突变体中读取终止信号，但在野生型细胞中不读取，证实 RNA 14 是终止因子。一旦掌握，这项技术可以在三天内完成。在尝试此过程时，重要的是要记住，反应上运行的转录对于获得成功的结果至关重要。
按照这个程序，可以执行其他方法，例如 GRO seek，以回答其他问题，例如因子在终止中的基因组范围作用。开发后，这项技术为转录领域的研究人员探索酵母和高等真核系统中其他 RNA 聚合酶的终止铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何对反应进行转录运行和纯化新生标记的转录本有很好的了解。
不要忘记 RNA 可能非常不稳定，在执行此过程时应始终采取预防措施，例如戴手套、保持温度在 4 摄氏度左右以及使用无 RNAse 试剂。
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概述
本文描述了一种使用BrUTP和链特异性转录延伸（TRO）方法在芽殖酵母中分析RNA聚合酶II体内转录终止的方法。该协议还可以适用于研究酵母和高等真核生物中其他RNA聚合酶的转录终止。
关键研究组成部分
科学领域
- 转录调控
- RNA聚合酶活性
- 酵母分子生物学
背景
- 转录终止是基因表达中的关键过程。
- 链特异性转录延伸方法允许分析转录动力学。
- 该方法可以区分不同类型的RNA聚合酶。
- 了解终止因子对于阐明酵母中的转录循环至关重要。
研究目的
- 调查RNA聚合酶II体内转录终止。
- 确定转录活跃的聚合酶是否从启动子区域开始。
- 将发现推广到不同生物体中的其他RNA聚合酶。
使用的方法
- 链特异性转录延伸（TRO）方法。
- 使用BrUTP标记新生RNA转录物。
- 用于有效转录分析的细胞透化技术。
- 新生转录物的纯化方法。
主要结果
- 该方法成功区分了mRNA转录聚合酶和广泛转录聚合酶。
- 获得了关于转录终止因子在转录循环中的作用的见解。
- 该方法可以适用于高等真核生物。
- 为新用户识别了执行中的挑战，如细胞透化。
结论
- 链特异性TRO方法对于研究转录终止有效。
- 了解转录终止可以提供基因调控的见解。
- 该方法在不同物种中有广泛的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables precise detection of transcription termination defects in vivo, addressing a key challenge in target validation where distinguishing true promoter-initiated readthrough from pervasive transcription is essential for mechanistic de-risking. By providing strand-specific, quantitative readouts of polymerase activity beyond terminator regions, it supports predictive confidence in early discovery stages focused on RNA polymerase II and termination factor biology. The approach offers translational continuity from yeast models to higher eukaryotes, facilitating cross-species target validation and preclinical pathway analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by determining whether observed transcription readthrough stems from promoter-initiated polymerase activity rather than non-specific initiation.
- Operational Value: Enables functional validation of termination factors as drug targets by isolating their specific role in the transcription cycle.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing mechanistic evidence that reduces ambiguity in target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces strand-specific nascent RNA signals that serve as quantitative readouts for screening compounds or genetic perturbations affecting termination.
- Operational Value: Generates reproducible, affinity-purified BrUTP-labeled RNA suitable for downstream qPCR or sequencing applications in assay development pipelines.
- Scalability: The protocol’s reliance on standardized permeabilization and purification steps enables adaptation to multi-well formats for medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects termination mechanism studies in yeast to conserved pathways in higher eukaryotes, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Enables risk-adjusted advancement decisions by validating target function across model systems before moving to mammalian validation.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes are due to specific termination factor loss versus pervasive transcriptional noise, improving target confidence.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification, particularly when termination mechanisms are under investigation, and supports handoff to preclinical teams via standardized, quantifiable outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by distinguishing promoter-driven transcription from background noise, aiding in pathway clarification and target de-risking.
- Screening: Delivers assay-ready, strand-specific nascent RNA that enables reliable comparison of genetic or pharmacological conditions affecting termination efficiency.
- Analytics: Provides amplifiable cDNA from purified BrUTP-labeled RNA, enabling quantitative PCR or sequencing readouts that help teams compare termination proficiency across conditions.
- Translational Research: Connects yeast-based termination findings to higher eukaryotes through conserved polymerase mechanisms, supporting preclinical continuity only when cross-species conservation is demonstrated.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for termination analysis that can be applied across multiple targets and projects within nucleic acid-targeted discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in transcription termination studies through strand-specific discrimination.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via defined permeabilization, labeling, and purification steps that minimize user-dependent variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering target-specific mechanistic data, reducing late-stage biological risk in RNA-focused therapeutic programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of termination factor targets based on validated, quantitative evidence of functional relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast molecular biology, RNA handling, and nucleic acid purification techniques to manage unstable nascent transcripts.
- Dependent on access to BrUTP, RNA isolation reagents, phenol-chloroform workflows, and specialized beads for affinity purification of bromouridine-labeled RNA.
- Necessitates cross-team standardization between discovery biology and analytics groups to ensure consistent RNA yield, labeling efficiency, and cDNA synthesis quality.
- Adaptation to mammalian or higher eukaryotic systems may require optimization of permeabilization conditions and validation of BrUTP incorporation efficiency.
- Practical limitations include low yield of nascent transcripts and technical difficulty in RNA purification, which may affect scalability for high-throughput applications without automation support.
