使用SPHIRE的电子冷冻显微镜图像的高分辨率单粒子分析
2017年5月16日
本文介绍了使用软件套件SPHIRE处理低温EM图像的协议。目前的协议可以应用于几乎所有瞄准近原子分辨率的单粒子EM项目。
该程序的总体目标是通过使用图像处理软件 SPHIRE 对电子冷冻显微镜数据进行单颗粒分析来确定大分子复合物的结构。单粒子冷冻电镜正在成为以近原子分辨率研究大分子结构的主流技术。SPHIRE 是一种新颖的软件包，能够以用户友好的方式对冷冻电镜数据进行半自动处理。
SPHIRE 的主要优点是自动验证机制。大多数程序只需运行一次，结果客观且可重现。高分辨率冷冻电镜可用于放置单个残留物，从而为复杂微分子机器的组织和功能提供重要的见解。
刚接触这种方法的人应该记住，获得高分辨率结构在很大程度上取决于样品和输入数据的质量和。要开始使用 SPHIRE 应用程序，请从终端打开 GUI。打开 UTILITIES 以使用 e2display 显示冷冻显微镜图像。
使用内置测量工具测量每个像素的最长粒子轴（以埃为单位）。打开 Project Settings。将 CTF 窗口大小至少设置为粒子框大小。
将粒子框大小设置为偶数，至少为粒子直径的 1 1/2 倍。将粒子半径设置为至少测量长度的一半。输入点组对称性 （如果已知） 和近似分子量。
注册设置。接下来，在 MOVIE 菜单中，打开 Micrograph movie alignment。设置 unblur 和 summovie 可执行文件路径。
选择未对齐的原始显微照片影片，并将文件名变量替换为通配符以设置输入显微照片路径模式。为输出目录命名。填写影片帧数、显微镜电压和每帧曝光。
运行该过程以生成剂量加权和剂量未加权运动校正的平均显微照片。接下来，打开 CTER 菜单，然后选择 CTF 估计。将剂量未加权的显微照片设置为输入。
为输出目录命名，并填写数据收集参数。将最低频率设置为 0285 反埃，将最高频率设置为 0.285 反埃。运行该过程以生成 CTF 参数列表。
接下来，打开 WINDOW 菜单，然后选择 Particle Picking。将剂量加权显微照片设置为输入，然后启动 e2boxer 实用程序。手动或自动执行颗粒拾取。
将选取的粒子提取到图像堆栈中，并将这些堆栈组合成 BDB 数据库中的单个虚拟图像堆栈。拾取并堆叠粒子后，打开 ISAC 菜单并选择 ISAC 2D 聚类。将 BDB 数据库中的虚拟镜像堆栈设置为输入。
估计每个类的图像数量。填写其余参数，并生成 2D 类平均值。2D 分类完成后，使用 Display Data 实用程序查看经过验证的可重现类别平均值。
验证是否表示了多个粒子方向，以及类平均值的质量是否令人满意。生成一个新的虚拟图像堆栈，其中仅包含属于已验证类平均值的粒子。接下来，打开 VIPER 菜单，然后使用 Display Data 实用程序查看类平均值。
删除质量差或显示相同粒子视图的类平均值。将剩余的类平均值保存到新文件中。然后，选择 Initial 3D Model RVIPER，并使用一小部分类平均值作为输入。
运行命令以生成蛋白质的初始可重现 3D 模型。在分子图形程序 Chimera 中检查模型。将模型与目标蛋白质的同源蛋白质或结构域的已知结构进行比较。
返回到 SPHIRE 中的 VIPER 菜单，然后选择 Create 3D Reference。生成具有正确像素大小和 3D 遮罩的初始 3D 参考模型。打开 MERIDIEN 菜单，然后选择 3D Refinement。
填写输入图像堆栈和初始 3D 参考文件路径。为输出目录命名，并将参考模型的掩码设置为 3D 掩码。选择"应用硬 2D 蒙版"。
将起始分辨率设置为 20 到 25 埃之间，然后运行 3D 优化以生成未过滤的半体积。然后，在 Chimera 中以未过滤的半卷形式查看。确定一个二值化阈值，其中所有蛋白质密度都已连接，但噪声伪影未连接。
返回到 SPHIRE 的 MERIDIEN 菜单，然后打开 Adaptive 3D Mask。输入未过滤的半体积输入和二值化阈值。为输出蒙版命名，然后运行该过程以生成柔化边缘的 3D 蒙版。
然后，打开 锐化（Sharpening），并选择两个未过滤的半卷。将柔化边缘半体积 3D 蒙版设置为用户提供的蒙版。运行合并半卷，然后筛选和锐化合并卷的过程。
打开日志文件以查看最终分辨率估计值。生成 3D 细化期间生成的输入图像堆栈的粒子角度分布的 3D 贴图。在 Chimera 中打开锐化和过滤的 3D 模型。
检查密度图及其高分辨率特征。在 Chimera 中打开角度分布，并验证 Euler 角是否各向同性分布。打开 SORT3D 菜单，然后选择 3D Variability Estimation。
从属于经过验证的类平均值的粒子图像的虚拟堆栈中生成 3D 可变性图。从此可变性图生成二值化 3D 掩码，用于后续聚焦 3D 聚类。然后，打开 3D Clustering RSORT3D，并选择上一个 3D 细化的目录作为输入。
为输出目录命名，并设置全局和聚焦 3D 蒙版。对于大型数据集，每组至少使用 5， 000 到 10， 000 张图像。运行排序过程以生成每个同质 3D 组的体积。
使用 Chimera 识别具有最高表观分辨率的结构。返回到 SPHIRE 中的 SORT3D 菜单，然后打开 Local Subset Refinement。将子集文本文件路径设置为与最高分辨率结构相对应的粒子 ID 簇文件。
将 3D 优化目录设置为包含未过滤的半体积块的目录，并将重新启动的迭代设置为先前 3D 优化中的最高分辨率迭代。运行命令以生成本地未过滤的半卷。然后，从其中一个局部半体积块创建柔和边缘的 3D 蒙版。
合并本地半卷，并在不应用低通滤波器的情况下锐化合并的卷。接下来，打开 LOCALRES 菜单，然后单击 Local Resolution。选择本地半卷。
然后，选择局部柔化边缘蒙版。将 overall resolution （总分辨率） 设置为 锐化合并的local volume（合并的局部体积）时估计的绝对分辨率。计算体积的局部分辨率。
接下来，打开 3D Local Filter。将锐化的未过滤本地音量设置为输入。选择局部分辨率贴图和柔化边缘 3D 蒙版。
将局部分辨率过滤器应用于锐化的体积以生成最终的 3D 模型。在 Chimera 中打开生成的体积和局部分辨率贴图。启动 Surface Color （表面颜色） 工具，然后从菜单中选择体积和选项，以根据本地分辨率为表面着色。
毒素复合物 TcdA1 通过冷冻显微镜成像。所有图像都显示清晰可辨的单个粒子和 Thon 环，其分辨率在功率谱中优于 4 埃。使用 e2boxer 选择颗粒，然后将其提取到图像堆栈中。
二维类平均值是通过迭代稳定对齐和聚类 （ISAC） 生成的。这些类平均值用于使用 RVIPER 计算可重复的 3D 模型。该模型与先前求解的 TcdA1 晶体结构非常吻合。
使用 MERIDIEN 对该模型进行自动 3D 细化产生了近原子分辨率map. 3D变异性分析表明组氨酸标记的 N 末端区域、受体结合结构域和 TcB 结合结构域的局部灵活性。执行了局部分辨率计算。
锐化模型经过局部过滤，并应用与局部分辨率对应的色标，显示高可变性区域和低分辨率区域之间的拓扑一致性。TcdA1 的最终 3.5 埃分辨率冷冻电镜结构显示出大多数侧链的明显密度。具有这种细节层次的密度图可以进一步用于从头原子模型构建。
使用这种方法，可以在几小时或几天内获得近原子分辨率的结构，而无需先验的结构信息。尝试此过程时，请仅使用高质量数据并检查中间结果。冷冻电镜样品的成分和结构异质性可能是达到近原子分辨率的限制因素。
观看此视频后，您现在应该对如何使用 SPHIRE 进行冷冻电镜结构测定有了很好的了解。如您所见，SPHIRE 中包含的聚类例程不仅可以让您解析目标蛋白质的结构，还可以研究构象动力学，并为复杂的分子机制提供关键的机制见解。
概览
本文介绍了一种使用SPHIRE软件套件处理冷冻电子显微镜图像的协议。该方法适用于针对接近原子分辨率的单颗粒电子显微镜项目。
关键研究组成部分
科学领域
- 结构生物学
- 冷冻电子显微镜
- 图像处理
背景
- 单颗粒冷冻电子显微镜是研究大分子结构的关键技术。
- SPHIRE为冷冻电子显微镜数据处理提供了半自动化方法。
- 该协议强调了样品质量对高分辨率结果的重要性。
- SPHIRE包括一个自动验证机制以保证可重复性。
研究目的
- 提供一个详细的冷冻电子显微镜图像处理协议。
- 促进大分子复合物结构的确定。
- 提高研究人员对冷冻电子显微镜技术的可及性。
使用的方法
- 利用SPHIRE软件进行图像处理。
- 从冷冻电子显微镜图像中手动和自动选择颗粒。
- 2D分类和3D模型生成。
- 3D精细化和可变性估计以提高分辨率。
主要结果
- 成功生成了高分辨率的蛋白质3D模型。
- 验证了类别平均值和颗粒方向。
- 建立了一个可重复的冷冻电子显微镜数据处理协议。
- 识别了具有高表观分辨率的结构。
结论
- SPHIRE协议显著简化了冷冻电子显微镜图像处理。
- 高质量的输入数据对于获得可靠结果至关重要。
- 该方法增强了对复杂大分子结构的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Cryo-EM enables near-atomic resolution structural determination of macromolecular complexes, providing critical insights for target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. SPHIRE streamlines this process through semi-automated workflows and objective validation, reducing barriers for novice users and enhancing reproducibility across teams. This supports predictive confidence in structural biology inputs for lead identification and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving macromolecular structures at near-atomic resolution.
- Operational Value: Provides reproducible 3D models from as few as 9,500 particles, supporting rapid target validation cycles.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by visualizing side-chain densities and conformational dynamics in toxin complexes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated, noise-free atomic models suitable for structure-based assay design.
- Operational Value: Standardizes particle picking and classification through GUI-controlled, semi-automated pipelines.
- Reproducibility: Automatic validation ensures objective results across users and sites, enabling assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical by delivering high-resolution models for docking and mutagenesis studies.
- Mechanistic Insight: Reveals localized flexibility in domains such as receptor-binding regions, informing functional assays.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of structural heterogeneity that may impact developability.
Pipeline & Workflow Integration
SPHIRE integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization by delivering high-resolution structural data that informs compound design and mechanism of action studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via 3D variability analysis and local resolution mapping to assess conformational states.
- Screening: Delivers standardized, dose-weighted micrographs and class averages for reliable particle preparation.
- Analytics: Provides quantitative outputs including resolution estimates, angular distribution, and variability maps for data-driven decisions.
- Translational Research: Enables preclinical continuity by producing sharpened, locally filtered 3D models suitable for atomic model building.
- Enterprise Reuse: GUI-driven workflow allows reuse across projects with minimal retraining, promoting platform standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Near-atomic resolution models reduce mechanistic ambiguity in target engagement studies.
- Operational Value: Semi-automated processing minimizes user intervention and increases throughput.
- Strategic Value: Objective validation improves go/no-go decisions by reducing structural uncertainty.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of targets with validated structural models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in structural biology and cryo-EM sample preparation.
- Depends on GPU-accelerated workstations for 3D refinement and variability analysis.
- Necessitates standardized data collection parameters (voltage, exposure, defocus) across teams.
- Performance limited by sample heterogeneity and preferential orientation.
- Relies on external tools like Chimera for visualization and validation.
