Name: 使用SPHIRE的电子冷冻显微镜图像的高分辨率单粒子分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: 学习使用SPHIRE软件进行单颗粒冷冻电镜图像处理，实现生物大分子复合物的高分辨率结构解析。该方法包含自动验证机制，可获得近原子级分辨率的三维模型。

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我们感谢D. Roderer提供了TcdA1的显微照片。我们感谢Steve Ludtke对EMAN2基础设施的持续支持。本工作获得了马克斯·普朗克学会（资助对象：S.R.）的资金支持，以及欧洲研究理事会根据欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）提供的资助（项目编号：615984，资助对象：S.R.），同时获得了美国国立卫生研究院R01 GM60635项目对P.A.P.的资助。

<ol><li>Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+cryo-EM+into+a+mainstream+structural+biology+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique.</a> Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).</li>
<li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li>
<li>Bai, X. -C., Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atomic+structure+of+human+%CE%B3-secretase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An atomic structure of human γ-secretase.</a> Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).</li>
<li>Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+a+human+cytoplasmic+actomyosin+complex+at+near-atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution.</a> Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).</li>
<li>von der Ecken, J., Müller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+F-actin-tropomyosin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the F-actin-tropomyosin complex.</a> Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).</li>
<li>Tang, G., Peng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li>
<li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li>
<li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FREALIGN%3A+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).</li>
<li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELION%3A+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>Shaikh, T. R., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li>
<li>Hohn, M., Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPARX%2C+a+new+environment+for+Cryo-EM+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).</li>
<li>Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appion%3A+an+integrated%2C+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li>
<li>de la Rosa-Trevìn, J. M., Quintana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scipion%3A+A+software+framework+toward+integration%2C+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li>
<li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+%C3%85+reconstruction+of+rotavirus+VP6%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980(2015).</li>
<li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera%3FA+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li>
<li>Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTER-rapid+estimation+of+CTF+parameters+with+error+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment.</a> Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).</li>
<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrank%2C+J+%22Three-Dimensional+Electron+Microscopy+of+Macromolecular+Assemblies%22">Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies</a>. , Oxford University Press. (2006).</li>
<li>Woolford, D., Ericksson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SwarmPS%3A+rapid%2C+semi-automated+single+particle+selection+software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).</li>
<li>Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+Stable+Alignment+and+Clustering+of+2D+Transmission+Electron+Microscope+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%2FFolding+and+Design%22%5BJournal%5D)">Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images.</a> Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).</li>
<li>Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+insertion+of+a+Tc+toxin+in+near-atomic+detail%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Publishing+Group%22%5BJournal%5D)">Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail.</a> Nature Publishing Group. , (2016).</li>
<li>Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+syringe-like+injection+mechanism+in+Photorhabdus+luminescens+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins.</a> Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).</li>
<li>Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Tc+toxin+action+revealed+in+molecular+detail%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail.</a> Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).</li>
<li>Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+focused+classification%2C+based+on+the+bootstrap+3D+variance+analysis%2C+and+its+application+to+EF-G-dependent+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation.</a> Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).</li>
<li>Callaway, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+revolution+will+not+be+crystallized%3A+a+new+method+sweeps+through+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology.</a> Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

近年来，单颗粒冷冻电镜技术发展迅速，已解析出大量具有重要生物学意义的大分子复合物的原子分辨率结构25。为了支持当前大量进入该领域的初学者用户，我们开发了单颗粒图像分析平台 SPHIRE，并在此提供涵盖整个工作流程的详细操作方案，包括电影图像校正、颗粒挑选、CTF 估计、初始模型计算、二维和三维异质性分析、高分辨率三维重构以及局部分辨率估计与过滤。
本文所述方案旨在提供一份简明指南，用于利用目标蛋白的冷冻电镜显微图像，结合SPHIRE独立图形用户界面提供的计算工具，进行三维结构的测定。
该工作流程的主要特点是，由于其基于可重复性验证的概念19，且无需调整参数，大多数步骤仅需运行一次。这种自动验证机制是SPHIRE相较于其他软件包的主要优势，因为其结果不仅客观且可重复，更重要的是能够在可接受的计算成本下获得。此外，该流程还为有经验的用户提供大量诊断信息，以便使用自己的方法进行进一步的独立验证和评估。尽管如此，只要具备结构生物学和电子显微镜基本理论背景的新手用户，也应能够利用自己的数据和自动化验证流程获得接近原子分辨率的结构。
然而，获得接近原子分辨率的结构并不总是容易的，结果在很大程度上取决于样品质量和输入数据的质量。本文所述方法假设已具备足够数量的高质量未对齐原始电镜电影数据，其平均图像应能清晰显示均一且随机取向的单颗粒。通常情况下，分子的对称性、大小或整体形状并无限制，但低分子量可能成为限制因素，特别是当蛋白质呈无特征的球状结构时。一般而言，对具有高点群对称性的较大、有序颗粒进行分析的要求较低。因此，强烈建议初学者首先使用一个特征明确的冷冻电镜数据集运行本方案。SPHIRE 教程数据（http:/sphire.mpg.de）或 EMPIAR 提交的带有原始电影数据的数据集（https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/）都是良好的起点。
在处理自身数据时，某些数据集或某些图像很可能不满足特定的质量标准。因此，除了程序对工作流程主要步骤进行的自动化稳定性与可重复性检查外，仍建议用户在实验方案的某些&#34;检查点&#34;对结果进行目视检查，特别是当最终重建结果不理想时。
在完成影片对齐（实验步骤 2）和CTF估计（实验步骤 3）后，可首先在显微照片水平进行初步视觉检查。所得的运动校正平均图像应能清晰分辨出独立且分离良好的单颗粒，其功率谱应显示出清晰可辨、各向同性的萨恩环（Thon rings）。这些环可见的空间频率通常决定了该结构原则上最终可达到的最高分辨率。足够质量的运动校正平均图像及其功率谱示例见“&#34;代表性结果&#34;”部分。可借助SPHIRE提供的漂移与CTF评估图形界面工具（http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php）剔除可能对最终结果产生负面影响的异常图像。
在颗粒筛选方面，SPHIRE 流程中的关键步骤是使用 ISAC 进行二维分类（实验步骤 5.2）。在此步骤中，用户应确认程序自动识别出的可重复二维类别平均图是否涵盖了足够范围的取向，从而近似均匀地覆盖角度空间。如果类别平均图的质量不理想（图像噪声大和/或模糊）和/或可重复的类别平均图数量过少，则应考虑改进自动颗粒挑选的质量、优化数据集成像条件或样品制备。在大多数情况下，若无法获得良好的二维类别平均图，则无法从该数据集中计算出可靠的三维重构结果。高质量二维类别平均图的示例如“&#34;代表性结果&#34;”部分所示。
使用 RVIPER 自动化方式获得可靠的初始三维模型至少需要 100 个类别平均图像（实验步骤 6.1）。在此步骤中，用户应选择质量最高的平均图像，并尽可能包含颗粒的多种不同取向。初始模型的质量对于后续高分辨率三维精修的成功至关重要。
在其他软件包中，有时会进行三维分类以去除&#34;不良&#34;颗粒8,9。然而，在 SPHIRE 中，这些颗粒中的大多数已在使用 ISAC 进行二维分类时被自动剔除。因此，仅当重构结果和三维变异性分析表明数据集存在异质性时，才建议执行计算量较大的三维分类步骤。
最重要的是，用户应始终仔细检查生成的三维结构（实验步骤 9.3），并确认相应密度特征与标称分辨率相符。在约 &#60;9 Å 的分辨率下，对应于 α-螺旋的棒状密度开始可见；在约 &#60;4.5 Å 的分辨率下，对应于 β-折叠中β链的密度通常能清晰分离，且体积较大的氨基酸变得可见。高分辨率图谱（约 &#60;3 Å）应能清楚分辨侧链，从而可构建精确的原子模型。
迄今为止获得的结果表明，在 SPHIRE 的自动化可重复性测试和最少视觉检查的帮助下，本方案通常适用于任何类型的单颗粒冷冻电镜项目。各处理步骤的代表性结果以 TcdA1 毒素的重构为例展示 Photorhabdus luminescens 21，该结构已解析至接近原子级分辨率。类似质量的密度图可用于构建可靠的原子模型 从头合成 骨架追踪以及互易空间或实空间精修，从而为理解复杂的分子机制提供坚实的结构框架。
登录号：
EM结构的坐标以及未处理的电影数据已分别存入电子显微镜数据银行和电子显微镜试点图像档案库，登录编号分别为EMD-3645和EMPIAR-10089。

在直接电子探测器技术发展之后，单颗粒冷冻电镜技术的显著进步目前正在重塑结构生物学领域 1与X射线晶体学相比，该技术仅需少量蛋白质样品，无需结晶步骤，同时对样品纯度的要求较低，仍可实现近原子分辨率的结构解析。重要的是，现在可通过计算方法将不同组分或状态分离，并以前所未有的细节水平对不同构象进行结构解析。近期，一些难以处理的分子已获得密度图，其分辨率足以 从头合成 模型构建，从而深入理解其作用机制 2,3,4,5.
在三维电子显微镜（3DEM）领域，有多种图像处理软件包可供使用（https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy），其中大多数软件包正处于持续开发中。利用包括 EMAN2 6、IMAGIC7、FREALIGN 8、RELION 9、SPIDER 10 和 SPARX 11 在内的多个不同软件包，已对具有不同分子量和对称性的蛋白质实现了接近原子分辨率的结构解析。每个软件包对用户专业知识的要求不同，并在用户引导、自动化程度和可扩展性方面提供不同程度的支持。此外，一些程序提供了完整的分析环境，以支持图像分析的全部步骤，而另一些程序则专注于优化特定任务，例如从已知参考结构出发优化取向参数的精修。近年来，已开发出多个整合性平台，如 APPION 12 和 SCIPION 13，它们构建了统一的处理流程，整合了上述各类软件包中的方法与操作协议。
为了推动冷冻电镜（cryo-EM）技术的当前发展，SPARX 被重新开发为一个全新的独立且完整的单颗粒分析平台，称为 SPHIRE（用于高分辨率电子显微镜的 SPARX）。为了提高该技术对领域内新研究人员的可及性，并应对现代全自动高端电子显微镜产生的大量数据，处理流程经过重新设计和简化，引入了易于使用的图形用户界面（GUI），并对工作流程中的主要步骤实现了自动化。此外，新增了多种算法，以实现从冷冻电镜图像中快速、可重复且自动地进行结构解析。同时，引入了基于可重复性的验证方法，以避免在精细结构优化和异质性分析过程中常见的伪影。
尽管该程序经过了大量修改，但其备受认可的核心特性得以保留：简洁的开源代码、现代的面向对象设计，以及所有基本功能的 Python 接口。因此，该程序并未被改造成一个黑箱程序，用户仍可研究并轻松修改 Python 代码，以创建附加应用或调整整体工作流程。这对于非标准的冷冻电镜项目尤为有用。
本文介绍了一种利用SPHIRE图形用户界面（GUI）从冷冻电镜（cryo-EM）图像中获得近原子分辨率密度图的实验方案。该方案详细描述了从原始的冷冻电镜直接电子探测器电影数据生成密度图所需的全部步骤，且不限定于任何特定类型的生物大分子。本方案主要旨在为该领域的新手提供工作流程指导，并对数据处理中的关键步骤以及可能遇到的陷阱和障碍提供重要信息。SPHIRE的更高级功能及其理论基础将在其他文献中另行阐述。

<table><tbody><tr><td>SPHIRE</td><td>马克斯·普朗克分子生理学研究所-德国多特蒙德&amp;nbsp; 和德克萨斯州休斯顿医学院&amp;nbsp;</td><td></td><td>http://sphire.mpg.de</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>加利福尼亚大学旧金山分校</td><td></td><td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td></tr><tr><td>Unblur</td><td>珍利亚农场研究园区，阿什本</td><td></td><td>http://grigoriefflab.janelia.org/unblur</td></tr><tr><td>Coot</td><td>英国剑桥分子生物学MRC实验室&amp;nbsp;</td><td></td><td>http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td></tr><tr><td>EMAN2</td><td>贝勒医学院，休斯顿</td><td></td><td>http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td></tr><tr><td>含1824个核心的计算集群</td><td>马克斯·普朗克分子生理学研究所</td><td></td><td>由76&amp;nbsp;个节点组成的Linux集群，每个节点配备2个Xeon E5-2670v3 12核2.30 GHz处理器和128 Gb内存</td></tr><tr><td>TITAN KRIOS电子显微镜&amp;nbsp;</td><td>FEI</td><td></td><td>300 kV，球差校正，XFEG</td></tr><tr><td>Falcon II直接电子探测器</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EPU（自动化数据采集软件）</td><td>FEI</td><td></td><td>https://www.fei.com/software/epu/</td></tr></tbody></table>

使用 sphire 从电子冷冻显微镜图像进行高分辨率单颗粒分析

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE（用于高分辨率电子显微镜的SPARX）是一款新颖的开源、用户友好的软件套件，用于单颗粒电子冷冻显微镜（cryo-EM）数据的半自动化处理。本文所述方案详细介绍了如何从cryo-EM显微图像电影出发，通过引导用户完成单颗粒结构解析流程的各个步骤，最终获得接近原子分辨率的结构。这些步骤均由全新的SPHIRE图形用户界面进行控制，所需用户干预极少。利用本方案，可获得TcdA1（一种Tc毒素复合物）的3.5 Å分辨率结构 Photorhabdus luminescens，仅由9500个单颗粒衍生而来。这种简化的流程将有助于缺乏丰富处理经验的新手用户 先验的 结构信息，以获得其纯化的大分子复合物在天然状态下的无噪声、无偏倚的原子模型。

上述方案从A组分的112个直接检测器电影文件开始执行 Photorhabdus luminescens Tc复合物（TcdA1） 20,21,22该数据集是在一台配备高亮度场发射枪（XFEG）的Cs校正电子冷冻显微镜上采集的，加速电压为300 kV。图像采用自动采集模式获取，总剂量为60 e⁻-/Å-2 在样品尺度上像素大小为1.14 Å。对电影帧进行对齐后（步骤 2），所得运动校正后的平均图像显示出各向同性的Thon环，可延伸至高分辨率（图2a）。单个颗粒清晰可见且彼此分离良好（图 2b）。随后使用 e2boxer 的 swarm 工具选取颗粒 18 (步骤 4.1）。在这种情况下，使用更具选择性的选项设置了适当的阈值（图 2c）。这112张数字显微照片共获得9,652个颗粒。大多数提取的图像（步骤 4.2) 包含轮廓清晰的颗粒，其盒尺寸约为颗粒尺寸的1.5倍，符合推荐要求（图 2d）。接下来，使用ISAC进行二维异质性分析（实验步骤 5）。共获得 98 个类别平均值（图3a）。利用这些二维分类平均图像，一个 从头算 模型使用 VIPER 计算得出步骤 6）在中等分辨率下（图 3b该模型与先前解析的TcdA1晶体结构（分辨率为3.9 Å）高度吻合。 22 (图 3c）。这 从头算 模型被用作三维精修（MERIDIEN）的初始模板，得到分辨率为3.5 Å（0.143标准）的重构结构（步骤 7仅来自约 40,000 个非对称单元（图4）。该近原子分辨率图谱在 24 小时内获得，流程中受益于多核并行计算的步骤最多使用了 96 个 CPU。
用于三维变异性分析 （实验步骤 8） 每组仅使用 2,000 张粒子图像进行步骤 8.3.3 的分析（即 该过程从5个初始3D分类组开始，在步骤8.3.4中，由于粒子数量较少（约10,000个），最小分组的图像数量为200张。分析结果显示，复合物的N端区域存在局部柔性，该区域包含用于纯化的His标签（图 5a）。事实上，在先前发表的TcdA1晶体结构中，N端的十二个残基和His标签均未解析。 22 而这一极可能无序的区域在当前的冷冻电镜密度图中仍未解析，可能因其具有较高的柔性所致。在受体结合域和BC结合域也检测到了额外的变异性。图 5a）。由于整体结构的分辨率令人满意，且数据集相对较小，这种异质性被认为可以接受，因此进行了聚焦的三维分类 23 未进行。最后，计算了最终密度图的局部分辨率（实验步骤 9.1，图 5b）以及锐化后的3D图谱进行了局部滤波（步骤 9.2）. 此质量的体积可用于 从头合成 使用 Coot 进行模型构建 24 或任何其他优化工具（图6).
<img alt="SPHIRE 工作流程图；图像处理步骤：比对、CTF 估计、颗粒提取。" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：使用 SPHIRE 进行图像处理。（a）SPHIRE 软件包的图形用户界面（GUI）。通过选择 GUI 左侧相应的图标（“工作流程步骤”），可激活特定的工作流程步骤。与该步骤相关的命令和工具将显示在 GUI 的中央区域。选择其中一个命令后，相应的参数将显示在 GUI 右侧区域。高级参数通常无需修改预设的默认值。（b）使用 SPHIRE 图形界面进行单颗粒图像处理的工作流程各阶段。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="冷冻电镜成像过程；傅里叶变换、颗粒筛选、二维分类平均用于结构分析。" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：运动校正与颗粒提取。 (a, b典型的高质量、低剂量、漂移校正的数字显微照片，记录于欠焦状态下 1.7 µm注意功率谱（a）中各向同性的Thon环延伸至2.7 Å的分辨率，以及二维图像中清晰可辨的颗粒b). (c使用 e2boxer 进行颗粒筛选。绿色圆圈表示已选中的颗粒。d) 从剂量加权显微照片中提取的典型原始颗粒。标尺 = 20 nm。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="冷冻电镜分析；三维结构重建；蛋白质复合物可视化；电子显微镜。" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：二维聚类与初始模型生成。（a）二维分类平均图像集，其中大多数代表颗粒的侧视图。比例尺 = 20 nm。（b）基于无参考分类平均图像，使用RVIPER获得的TcdA1的从头计算（ab initio）三维图谱。（c）将TcdA1晶体结构（带状图，PDB编号 1VW1）刚体拟合至初始冷冻电镜密度图（透明灰色）中。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="冷冻电镜结构分析、蛋白质复合物、三维密度图、分子构型、结构生物学。" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：TcdA1 的冷冻电镜三维结构。（a，b）基于约 9,500 张颗粒图像计算得到的 TcdA1 最终 3.5 Å 密度图：（a）侧视图和（b）顶视图。（c）α-螺旋和 β-折叠的冷冻电镜密度图代表性区域。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="蛋白质结构分析、受体结合域、结构示意图、分子可视化" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：变异性分析与局部分辨率。（a）经锐化的 TcdA1 冷冻电镜图谱表面（灰色）与变异性图谱（绿色）。为更清晰显示，变异性图谱已进行 30 Å 低通滤波处理。（b）根据局部分辨率（Å）着色的 TcdA1 锐化冷冻电镜图谱表面渲染图。注意高变异性区域与低局部分辨率区域之间的拓扑一致性。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质结构可视化；线框模型图；分子建模软件界面" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：使用Coot构建TcdA1的3D模型 展示了α-螺旋的代表性冷冻电镜密度图与原子模型。原子模型已构建完成 从头合成 使用 Coot。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种使用软件套件SPHIRE处理冷冻电镜图像的实验方案。该方案几乎适用于所有以接近原子级分辨率为目标的单颗粒电镜研究项目。

使用 SPHIRE 从电子冷冻显微镜图像进行高分辨率单颗粒分析

SPHIRE（用于高分辨率电子显微镜的SPARX）是一种新型开源、用户友好的软件套件，用于单颗粒...的半自动化处理

本实验的总体目标是利用图像处理软件SPHIRE，通过电子冷冻显微镜数据的单颗粒分析来确定大分子复合物的结构。单颗粒冷冻电镜技术正成为在近原子分辨率下研究大分子结构的主流技术。SPHIRE是一种新型软件包，能够以用户友好的方式实现冷冻电镜数据的半自动化处理。SPHIRE 的主要优势在于其自动验证机制。大多数操作只需运行一次，结果客观且可重复。高分辨率冷冻电镜可用于定位单个残基，从而为复杂大分子机器的结构与功能提供关键见解。初次使用该方法的研究人员应牢记，获得高分辨率结构在很大程度上取决于样品质量和输入数据的质量。要开始使用 SPHIRE 软件，请从终端打开其图形用户界面。打开“UTILITIES”模块，使用 e2display 显示冷冻电镜图像。使用内置测量工具以埃/像素为单位测量粒子的最长轴。打开项目设置，将CTF窗口大小设置为至少等于粒子盒的尺寸。将颗粒盒尺寸设置为偶数，至少为颗粒直径的1.5倍。将颗粒半径设置为至少等于测量长度的一半。如已知，输入点群对称性及分子质量的近似值。注册设置。接下来，在 MOVIE 菜单中，打开显微照片电影对齐功能。设置 unblur 和 summovie 可执行文件的路径。选择一个原始的未对齐的显微图像电影文件，并将文件名变量替换为通配符以设置输入显微图像的路径模式。命名输出目录。填写电影帧数、显微镜电压以及每帧曝光量。运行该流程以生成加权剂量和未加权剂量的运动校正后平均显微图像。接着，打开 CTER 菜单并选择 CTF 估计。将未加权剂量的显微图像设置为输入。命名输出目录，并填写数据采集参数。将最低频率设置为 0285 埃的负一次方，最高频率设置为 0.285 埃的负一次方。运行该过程以生成CTF参数列表。接下来，打开 WINDOW 菜单，选择颗粒挑选。将剂量加权的显微照片设置为输入，启动 e2boxer 工具。手动或自动进行颗粒挑选。将挑选出的颗粒提取为图像堆栈，并将这些堆栈合并为 BDB 数据库中的单个虚拟图像堆栈。颗粒完成挑选并堆叠后，打开 ISAC 菜单并选择 ISAC 二维聚类。将 BDB 数据库中的虚拟图像堆栈设置为输入。估算每个类别的图像数量。填写其余参数，并生成二维类别平均图像。二维分类完成后，使用显示数据工具查看已验证的可重复类别平均图像。确认已包含多种颗粒取向，且分类平均图像质量达到满意水平。生成一个新的虚拟图像堆栈，仅包含属于已验证分类平均图像的颗粒。接着，打开 VIPER 菜单，使用“显示数据”（Display Data）工具查看分类平均图像。删除质量较差或显示颗粒相同视角的类别平均图像。将剩余的类别平均图像保存至新文件。然后，选择初始三维模型 RVIPER，并以少量筛选后的类别平均图像作为输入。运行命令以生成该蛋白质的初始可重复三维模型。在分子图形程序 Chimera 中检查该模型。将该模型与目标蛋白质或其同源结构域的已知结构进行比较。返回 SPHIRE 中的 VIPER 菜单，选择“创建 3D 参考”。使用正确的像素尺寸和 3D 掩模生成初始 3D 参考模型。打开 MERIDIEN 菜单，选择 3D 精修。填写输入图像堆栈和初始3D参考文件的路径。为输出目录命名，并将参考模型的掩膜设置为3D掩膜。选择应用硬2D掩膜。将起始分辨率设置为 20 至 25 埃之间，运行 3D 精修以生成未过滤的半体积数据。随后在 Chimera 中查看未过滤的半体积数据。确定一个二值化阈值，使得所有蛋白质密度相互连接，但噪声伪影不被包含。返回 SPHIRE 的 MERIDIEN 菜单，打开自适应 3D 掩模（Adaptive 3D Mask）。输入未滤波的半体积数据和二值化阈值，命名输出掩模，运行程序以生成一个边缘平滑的 3D 掩模。然后，打开锐化功能，选择两个未滤波的半体积数据。将软边缘半体积三维掩膜设置为用户提供的掩膜。运行该流程，以合并半体积数据，随后对合并后的体积进行滤波和锐化处理。打开日志文件以查看最终分辨率估计值。生成输入图像堆栈在3D精细化过程中产生的粒子角分布的3D图。在Chimera中打开经过锐化和滤波的3D模型。检查密度图及其高分辨率特征。在 Chimera 中打开角分布，验证欧拉角是否呈各向同性分布。打开 SORT3D 菜单，选择 3D 变异性估计。从属于已验证类别平均值的粒子图像虚拟堆栈生成三维变异性图。根据该变异性图生成二值化的三维掩膜，用于后续的聚焦三维聚类。然后，打开3D Clustering RSORT3D，选择上一轮三维精修的目录作为输入。命名输出目录，并设置全局和聚焦的三维掩膜。对于大型数据集，每组至少使用 5,000 至 10,000 张图像。运行分类过程，以生成每个均质三维组的体积结构。使用 Chimera 鉴定出表观分辨率最高的结构。返回 SPHIRE 中的 SORT3D 菜单，打开局部子集优化。将子集文本文件路径设置为对应于最高分辨率结构的粒子 ID 聚类文件。将3D精修目录设置为包含未过滤半体积数据的目录，并将重启迭代设置为上一次3D精修中最高分辨率的迭代。运行命令以生成局部未过滤的半体积数据。然后，从其中一个局部半体积数据创建一个边缘平滑的3D掩膜。合并局部半体积数据，并在不应用低通滤波的情况下对合并后的体积进行锐化。接着，打开 LOCALRES 菜单，点击局部分辨率，然后选择局部半体积数据。然后，选择局部软边缘掩膜。将整体分辨率设置为合并局部体积图时估计的绝对分辨率。计算该体积图的局部分辨率。接下来，打开 3D 局部滤波器。将锐化后的未滤波局部体积作为输入，选择局部分辨率图和软边缘 3D 掩模。对已锐化的体积数据应用局部分辨率滤波，以生成最终的三维模型。在 Chimera 中打开生成的体积数据和局部分辨率图。启动 Surface Color 工具，从菜单中选择该体积数据，并选择根据局部分辨率对表面进行着色的选项。通过冷冻电镜对毒素复合物TcdA1进行成像。所有图像均清晰显示出单颗粒及功率谱中延伸至优于四埃分辨率的萨恩环。使用e2boxer选取颗粒，随后将其提取至图像堆栈中。通过迭代稳定对齐与聚类（ISAC）生成二维分类平均图像。这些分类平均图像被用于通过RVIPER计算出一个可重复的三维模型。该模型与先前解析的TcdA1晶体结构高度一致。使用MERIDIEN对该模型进行自动3D精修，获得了接近原子分辨率的图谱。3D变异性分析表明，组氨酸标签标记的N端区域、受体结合域以及TcB结合域具有局部柔性。同时进行了局部分辨率计算。对优化后的模型进行了局部滤波，并应用了对应局部分辨率的彩色标尺，显示出高变异性区域与低分辨率区域之间的拓扑一致性。TcdA1 的最终 3.5 埃分辨率冷冻电镜结构显示了大多数侧链的清晰密度。具有此类细节水平的密度图可进一步用于从头原子模型构建。采用这种方法，可在数小时或数天内获得接近原子分辨率的结构，且无需事先的结构信息。在尝试该操作流程时，应仅使用高质量的数据，并检查中间结果。冷冻电镜样品的组成和结构异质性可能是达到接近原子分辨率的限制因素。观看本视频后，您应该已经对如何使用 SPHIRE 进行冷冻电镜结构解析有了深入的理解。正如您所见，SPHIRE 中包含的聚类分析程序不仅能够帮助您解析目标蛋白的结构，还能用于研究构象动态变化，从而为复杂分子机制提供关键的机理洞察。

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科研

JoVE Journal

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生物化学

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使用 SPHIRE 从电子冷冻显微镜图像进行高分辨率单颗粒分析

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