通过轻型显微镜对小鼠急性心肌炎模型中白细胞浸润的定量可视化

该方案的总体目标是化学清除小鼠的心脏，通过荧光光片显微镜诱导心律失常，以实现白细胞心脏浸润的整个器官可视化。这种方法可以帮助回答全器官研究领域中关于细胞分辨率水平的假体和结构的关键问题。这种技术的主要优点是它允许量化和定位整个器官中的炎症。

为神经假体提供详细的内部信息。当我们迫切需要一种可视化工具来识别耗竭模块中心律失常的细胞解释时，我们第一次想到了这种方法。在 8 至 10 周龄小鼠的心脏暴露后，使用 21 号导管并穿透右心室。

切开主动脉以允许血液引流，然后以缓慢恒定的压力灌注 5 毫升 PBS 加 EDTA。在 PBS EDTA 之后加入 5 毫升 4% 多聚甲醛。在灌注结束时，使用锯齿镊子轻轻抓住固定的心脏，并稍微向上拉动器官以切断所有组织连接。

包括进出的动脉和静脉。然后，将心脏在新鲜的 4% PFA 中储存 4 小时以进一步固定。为了使组织脱水，将心脏在上升的乙醇系列中孵育，在黑色 5 毫升聚丙烯反应管中，在黑暗中，在管旋转器上不断缓慢旋转，以防止气泡形成。

然后，用 98% 二苄基醚孵育并持续旋转过夜，清除组织。要进行光片荧光显微镜检查，首先将脱水的琼脂糖块放入标准样品架中，以将样品固定到位。然后，将样品转移到样品架上。

接下来，将样品架转移到适当大小的填充二苄醚的比色皿中。使用适当的激发和发射滤光片设置来检测感兴趣的荧光信号。因此，样品的正确定位和固定是最大限度地减少成像过程中的阴影效应的基础。

此外，松散的标本会导致移动伪影，在后处理过程中很难照亮。需要所有图像后，打开相应的 3D 和 4D 图像处理分析软件，然后选择 surpass。选择 file and open，然后选择包含第一个采集通道中数据的文件夹以打开图像堆栈。

选择 edit and add channels（编辑并添加通道），以添加相应的采集的荧光通道数据。接下来，单击编辑并选择图像属性，以校正 x、y 和 z 体素尺寸。在新打开的窗口中调整参数。

要调整荧光信号，首先打开编辑菜单并选择 show display adjustment。一个新窗口非常显示所有打开的频道。要将自发荧光通道更改为灰度，请选择自发荧光通道，选择白色显示样式，然后单击确定。

然后，通过删除网格来调整视图。然后，放大并取消选择一个通道。然后，调整黑电平值以排除任何不代表样品结构、信号强度和对比度的不需要的背景信号。

根据修正的自发荧光通道信号调整抗体驻留通道。设置通道模式，触发将抗体信号的可视化设置为热图颜色查找表。然后，选择混合模式，以详细可视化组织结构。

要以虚拟方式剪切打开风琴，请在导出 3D 场景之前，在对象列表中选择剪切平面图标。图像视图中将出现一个黄色框和一个白色主轴纵器。使用鼠标旋转较细端的主轴，以更改剪切平面的方向，并移动主轴较厚的中间部分以选择所需的剪切深度。

然后，取消选中相应的复选框以隐藏帧和纵器并创建所需的快照。采集由两个荧光通道信号组成的整个图像堆栈会引发人工 3D 渲染，其中白细胞分布显示在热图视图中。经过白喉毒素处理的动物心脏的强烈发炎区域可以通过它们淡红色、白色的外观来感知。

特别是在心脏传导系统的区域，例如心室束和浦肯野纤维。相反，受控 PBS 处理的动物的心脏不表现出这种炎症模式。一旦掌握，该技术就可以在 4 到 5 天内对目标器官进行数字化分析，从收获到计算机辅助测定。

开发后，这项技术为menology领域的研究人员探索整个小鼠器官中的细胞分布模式铺平了道路。这可能会在分析和治疗各种病理生理疾病假体时效。观看此视频后，您应该对如何为荧光光片显微镜准备整个小鼠器官以及如何生成和处理 3D 数据堆栈有很好的了解。