Name: 评估心肌亚型以下鼠标胚胎成纤维细胞的转录因子介导的重编程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 了解利用Gata4、Hand2、Mef2c和Tbx5转录因子将小鼠胚胎成纤维细胞直接重编程为诱导心肌样细胞的方法。该技术可生成并量化心房、心室和起搏器等多种心肌亚型，为心脏谱系转化和再生医学研究提供系统化的体外实验方案。

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A.F.-P. 获得了美国国家科学基金会研究生研究奖学金（资助号：2015165336）的支持。N.V.M. 获得了美国国立卫生研究院（NIH，HL094699）、伯勒斯威康基金（Burroughs Wellcome Fund，1009838）以及出生缺陷基金会（March of Dimes，#5-FY14-203）的资助。我们感谢 Young-Jae Nam、Christina Lubczyk 和 Minoti Bhakta 在实验方案开发和数据分析方面的重要贡献。我们还感谢 John Shelton 提供宝贵的技术建议，以及 Munshi 实验室成员参与科学讨论。

所有涉及动物实验的操作均经由德克萨斯大学西南医学中心机构动物护理与使用委员会批准。
1. Hcn4-GFP 胚胎小鼠成纤维细胞（MEFs）的分离（E12.5）
<ol>
	<li>将纯合 Hcn4-GFP 雄性小鼠与 CD-1 雌性小鼠进行定时交配。</li>
	<li>在 E12.5 时通过二氧化碳安乐死法处死怀孕雌鼠，随后行颈椎脱位。
	<ol>
		<li>用解剖镊取出子宫角，方法如前所述22,23，并将其置于含冰上 1× 磷酸盐缓冲液（PBS，不含 Ca2+ 或 Mg2+）的培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>所有后续操作均在组织培养罩内以无菌技术进行。
	<ol>
		<li>用剪刀和解剖镊从子宫和羊膜囊中取出胚胎，保留胎盘以利于操作。通常，怀孕的 CD-1 雌鼠每胎产仔 10 至 14 只。</li>
		<li>用解剖镊夹取分离的胚胎，并在 70%（v/v）乙醇中快速冲洗两次。 
		注意：冲洗应迅速，以尽量减少细胞死亡。</li>
		<li>去除胚胎的头部、四肢、尾部及包括心脏在内的内脏器官。</li>
		<li>将剩余组织置于含 1 mL 1× PBS 的 10 cm 培养皿中，用无菌剃刀片精细切割成约 1 mm3 大小的组织块。</li>
		<li>将切碎的组织转移至含 PBS 的 50 mL 圆锥形离心管中。</li>
		<li>以 300 × g 离心 3 分钟，小心吸除多余 PBS。</li>
		<li>每只胚胎加入 1 mL 无菌 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C 水浴中孵育 15 分钟，每 4 分钟轻柔混匀一次。组织过度消化将显著降低细胞得率。</li>
		<li>将细胞混合物在最大转速（3,200 rpm）下涡旋震荡 4 秒。</li>
		<li>每只胚胎加入 2 mL 成纤维细胞培养基并混匀，用移液器辅助将细胞悬液通过 100 µm 细胞滤网过滤。后续所有培养基的配方参见 表 1。</li>
		<li>以 300 × g 离心 4 分钟，小心吸除上清液。</li>
		<li>每 3 只胚胎加入 10 mL 新鲜成纤维细胞培养基，并吹打 6–10 次。</li>
		<li>每 3 只胚胎所获细胞接种于一个 15 cm 组织培养皿中，于 37 °C、5% CO2 培养箱中过夜培养。</li>
		<li>过夜孵育后，更换为每皿 30 mL 新鲜培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养过夜。 
		注意：在荧光显微镜下检查是否存在 Hcn4-GFP+ 细胞污染。培养物应为 GFP-，仅在重编程后才出现 GFP+ 细胞。</li>
		<li>次日，用 3 mL 预热的新鲜 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 收获细胞，计数并冻存。通常以每毫升 3 × 106 个细胞的密度进行冻存。预期得率为每只胚胎 3 × 106 个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 逆转录病毒的制备与重编程
注意：以下实验方案需要生产并操作具有感染性的逆转录病毒。请在生物安全二级（BSL-2）指南规定的二级生物安全柜内进行无菌操作。所有接触过逆转录病毒的材料均须使用10%漂白剂处理销毁。
<ol>
	<li>逆转录病毒制备与小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的准备 
	注意：以下方案适用于在6孔板中进行逆转录病毒的生产以及在24孔板中对MEF进行感染。如需其他规格的操作，请参考 表 2. MEF细胞在第-1天接种，因此每次实验需适当协调时间（参见第2.3节和 图2).
	<ol>
		<li>按照制造商的建议培养 Plat-E（PE）细胞。简言之，将 PE 细胞培养于添加了 10% 胎牛血清（FBS）、1 µg/mL 嘌呤霉素、10 µg/mL 杀稻瘟菌素、青霉素和链霉素的 DMEM 培养基中。当细胞融合度达到 70–90% 时，每两天以 1:4 的比例传代一次。</li>
		<li>第 -2 天转染前一天，将Plat-E细胞以1 × 10⁶个/皿接种于培养皿中6 6孔板中每孔接种细胞，加入转染培养基。转染时细胞汇合度应达到70%-80%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用商用转染试剂进行转染。 
	注意：转染前，商用试剂应恢复至室温（RT）。进行DNA转染时，将各逆转录病毒质粒DNA（G、H、M和T）分别加入，配制成GHMT混合物9.
	<ol>
		<li>第 -1 天： 在15 mL圆锥形聚苯乙烯管中，按每孔反应量加入60 µL低血清培养基和6 µL转染试剂，用于6孔板体系。室温孵育混合物5分钟。 
		注意：由于此处使用的转染试剂会与塑料结合，因此需直接加入低血清培养基中，以避免转染效率降低。</li>
		<li>每反应加入总共 2 µg GHMT 混合液，轻轻弹击混匀。切勿涡旋。室温孵育反应体系 15 分钟。</li>
		<li>将步骤 2.2.3 中的混合物逐滴加入 PE 细胞中。</li>
		<li>将转染后的 Plat-E 细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育过夜2 培养箱。记录转染时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hcn4-GFP 小鼠胚胎成纤维细胞的接种
	<ol>
		<li>铺板前1小时，准备用于免疫细胞化学的24孔板。
		<ol>
			<li>每孔加入一张12 mm的纤连蛋白盖玻片。</li>
			<li>用 300 µL 牛胶原蛋白溶液包被孔板例如，SureCoat）并在37 °C培养箱中孵育1小时。</li>
			<li>在MEF铺板前立即吸除包被液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>解冻一管冻存的Hcn4-GFP MEFs，用预热的成纤维细胞培养基以500 × g离心5分钟洗涤一次。</li>
		<li>使用台盼蓝排染法或类似的染料测定细胞活力。利用以下公式计算每毫升培养液中的活细胞数量： 
		存活细胞百分比 = [1.00 -（蓝色细胞数 / 总细胞数）] × 100
		<ol>
			<li>使用以下公式计算活细胞总数： 
			活细胞数 = 活率（%）× 稀释倍数 × 10,000 × 细胞悬液总体积</li>
		</ol>
		</li>
		<li>接种 3 × 104 每孔接种细胞至24孔板，孔内含预先制备的牛胶原溶液-纤连蛋白盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MEFs 的转导与重编程 
	注意：根据制造商的说明，妥善维护的Plat-E细胞可产生平均滴度为1 x 107 感染单位/mL。尽管每次实验并未直接测定滴度，但始终包含GFP对照，以间接反映感染效率。GFP表达水平高且荧光强度强（GFP+ &#62; 95%）通常与通过GHMT介导成功生成iCLMs相关。
	<ol>
		<li>第0天： 转染后24 h，将PE逆转录病毒培养基通过0.45 µm孔径的无表面活性剂醋酸纤维素滤器过滤，转移至15 mL锥形管中。加入polybrene，使其终浓度为8 µg/mL。小心地用2 mL新鲜转染培养基替换细胞培养液。 
		注意：若更换培养基的速度过快，细胞容易从培养板上脱落。</li>
		<li>吸弃培养的MEFs的培养基，加入新收集的逆转录病毒培养基；每孔6孔板应加入1.7 mL培养基，每孔24孔板加入约800 µL。将MEFs培养板放回培养箱中，过夜孵育。</li>
		<li>第1天： 重复步骤 2.4.1 和 2.4.2。在第 2 代之后弃去细胞nd 病毒收集。将感染的MEFs放回培养箱中，静置过夜。</li>
		<li>第2天： 诱导48小时后，吸除细胞培养上清液，用1×PBS洗涤一次。每孔加入500 µL预热的iCLM培养基（24孔板）。</li>
		<li>每2-3天更换一次iCLM培养基。在病毒诱导后14天进行免疫细胞化学（ICC）分析，以评估心肌重编程。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 重编程MEF的免疫染色
<ol>
	<li>诱导后第14天，小心吸除培养基。</li>
	<li>用300 µL预冷的1x PBS冲洗每个孔，吸除多余液体。</li>
	<li>每孔加入250 µL 4%多聚甲醛（PFA）溶液，对24孔板中的细胞进行固定，室温孵育15分钟。 
	注意：固定后的细胞可在4 °C的PBS中保存1–2周，之后再进行染色。</li>
	<li>用300 µL 0.1% PBS-TritonX 100（PBST）洗涤各孔3次，每次洗涤间室温孵育5分钟。最后一次洗涤后吸除多余液体。</li>
	<li>每孔加入300 µL 1x通用封闭缓冲液，室温封闭10分钟。</li>
	<li>配制免疫细胞化学（ICC）染色缓冲液：将1x PBS与1x通用封闭缓冲液按1:1混合。将一抗用ICC染色缓冲液稀释后，4 °C孵育过夜。推荐稀释比例参见材料部分。
	<ol>
		<li>使用小鼠α-肌动蛋白、鸡源αGFP和兔源Nppa抗体对一对载玻片进行染色，用于鉴定iPM和iAM。</li>
		<li>使用小鼠α-肌动蛋白、鸡源αGFP和兔源Myl2抗体对另一对载玻片进行染色，用于鉴定iPM和iVM。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>次日，用300 µL 0.1% PBST洗涤各孔3次，每次洗涤间室温孵育5分钟。最后一次洗涤后吸除多余液体。</li>
	<li>将二抗用ICC染色缓冲液稀释。推荐稀释比例参见材料部分。室温避光孵育1小时。
	<ol>
		<li>所有载玻片均使用以下二抗进行染色：小鼠Alexa-555、鸡源Alexa-488和兔源Alexa-647。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用300 µL 0.1% PBST洗涤各孔3次，每次洗涤间室温孵育5分钟。全程避光。</li>
	<li>取2.4 µL含1.5 µg/mL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂滴加至玻璃载玻片上。小心从24孔板的孔中取出盖玻片，去除多余液体后，转移至含封片剂的玻璃载玻片上。轻轻按压盖玻片以排除多余液体和气泡。</li>
	<li>使用合适的指甲油或塑料封片剂密封载玻片。将封片后的载玻片置于4 °C避光保存。</li>
</ol>
4. 使用共聚焦显微镜鉴定心脏亚型
注意：成像时需要配备至少两个荧光检测器的共聚焦显微镜，检测器需具备在405、488、555和639 nm波长下进行光谱检测的能力，以便识别iPMs、iAMs和iVMs。使用Plan-Apochromat 20X/0.75或更高性能的物镜对细胞进行成像。利用制造商提供的图像分析软件，通过扫描缩放可获得相当于40X油镜成像质量的图像。
<ol>
	<li>图像库：使用 DAPI、Alexa-488、Alexa-555 和 Alexa-647 通道（ch.）采集 8 位图像。像素驻留时间为 6 s，帧尺寸为 1024，线步进为 2，平均次数为 2，即可获得高分辨率图像。</li>
	<li>对于每张切片，从一侧边缘开始，在红色荧光通道（ch.）中上下扫描，寻找 α-actinin+ Sarcomere+ 细胞（示例见图 3 和图 5A）。在 555 nm 波长下，肌节条纹更易于肉眼识别。
	<ol>
		<li>一旦识别到 α-actinin+ Sarcomere+ 细胞，切换至绿色通道并记录其是否呈阳性（iPM）。再切换至计算机查看远红 647 通道（iAM 或 iVM）。 
		注意：α-actinin+/Sarcomere+/Hcn4-GFP+/Nppa-/Myl2- 的细胞被定义为 iPM。GFP 表达可见于整个细胞（图 4A）。</li>
		<li>使用 α-actinin（小鼠-Alexa555）、Hcn4-GFP（鸡-Alexa488）、Nppa（兔-Alexa647）和 DAPI 对切片进行染色。α-actinin+/Sarcomere+/Hcn4-GFP-/Nppa+ 的细胞为 iAM。Nppa 染色呈核周和点状分布（图 4B）。</li>
		<li>使用 α-actinin（小鼠-Alexa555）、Hcn4-GFP（鸡-Alexa488）、Myl2（兔-Alexa647）对切片进行染色。α-actinin+/Sarcomere+/Hcn4-GFP-/Myl2+ 的细胞为 iVM。Myl2 染色沿肌节丝呈现条纹状。由于染色质量和 Z 平面的差异，条纹结构并不总是容易观察到（图 4C）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 定量分析
注意：为了评估可能被重编程的MEF实际数量，需平行接种一个24孔板中的2个孔，与实验孔同时进行，并在接种后一天收集细胞。通过取这两个孔的平均值来确定接种的细胞总数，该数值即为实际接种的总细胞数（aTotal）。
<ol>
	<li>肌节+
	<ol>
		<li>在盖玻片上逐个目视检查每个细胞是否具有正常的α-肌动蛋白+/肌节+（右侧面板图3），并进行记录（图5B-i）。</li>
		<li>统计每张盖玻片上α-肌动蛋白+/肌节+细胞的总数，并除以实际接种的总细胞数（aTotal）（图5B-iii）。例如，若aTotal = 12,500个细胞，其中100个为α-肌动蛋白+/肌节+，则表明接种的MEF中有0.8%被重编程。一次典型的重编程实验可获得约1%的α-肌动蛋白+/肌节+细胞（图5C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>亚型+ 
	注意：以下步骤请参考图5B/C中所示的代表性iCLM定量工作流程。简而言之，对每个肌节+细胞，判断其是否属于某一特定亚型（图5B-i）。通过将亚型+细胞数量除以平均肌节+细胞数再乘以100，计算亚型百分比（图5B-iii）（图5B-i）。为计算绝对亚型效率百分比（图5B-iv），需将图5B-i中获得的亚型+细胞数除以接种的总细胞数再乘以100（图5B-ii）。
	<ol>
		<li>对每一个α-肌动蛋白+/肌节+细胞，判断其是否为GFP+、Nppa+或Myl2+。</li>
		<li>统计α-肌动蛋白+/肌节+/Hnc4-GFP+/Nppa-/Myl2-、α-肌动蛋白+/肌节+/Hnc4-GFP-/Nppa+、以及α-肌动蛋白+/肌节+/Hnc4-GFP-/Myl2+细胞的总数（图5B-i）。</li>
		<li>为计算每种亚型的百分比，将各亚型+细胞数量除以该孔中α-肌动蛋白+/肌节+细胞的总数，再乘以100。GHMT诱导生成的iPMs、iAMs和iVMs大致呈相等比例（图5B-iii）。</li>
		<li>为计算亚型+细胞的绝对数量，将实验条件下亚型+细胞总数除以aTotal再乘以100（图5B-ii）。平均而言，iPMs占总感染细胞群体的0.3%，iAMs占0.3%，iVMs占0.25%（图5B-iv）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein+pseudotyped+retroviral+vectors%3A+concentration+to+very+high+titer+and+efficient+gene+transfer+into+mammalian+and+nonmammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).</li>
<li>Ichim, C. V., Wells, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+high-titer+viral+preparations+by+concentration+using+successive+rounds+of+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation.</a> J Transl Med. 9, 137(2011).</li>
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<li>Muraoka, N., Ieda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+myocytes+to+reverse+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis.</a> Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).</li>
<li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoffin%2C+JM+%22Retroviruses%22">Retroviruses</a>. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. , (1997).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究提供了一种直接重编程策略，通过逆转录病毒介导的心脏转录因子Gata4、Mef2c、Tbx5和Hand2（GHMT）的表达，将小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）转化为多种心脏亚型。结合使用多重免疫染色方法与心肌特异性报告小鼠模型，我们能够在单细胞水平上鉴定出诱导性心房心肌细胞（iAM）、诱导性心室心肌细胞（iVMs）和诱导性起搏细胞（iPMs）。该实验方法为后续研究提供了可行的技术平台。 体外 能够分离单个转录因子在亚型多样性及肌节发育中的作用的系统。同时，该系统可为发现促使诱导型心肌样细胞（iCLMs）偏向特定谱系的新转录因子或小分子提供见解。然而，该检测的成功实施包含若干关键步骤。以下将针对一般iCLM实验中病毒滴度、成纤维细胞质量以及成像分析的影响进行阐述。
在本研究中，我们采用嗜小鼠逆转录病毒对E12.5代小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）进行重编程。我们注意到，逆转录病毒的滴度与细胞质量直接相关。高传代次数（&#62; 35）以及不良的培养技术会显著影响逆转录病毒颗粒的质量；因此，有若干注意事项需加以考虑。Plat-E细胞不产生VSV-G假型病毒，因而无法耐...

心脏是胚胎中第一个发育的功能性器官1,2。它与循环系统协同作用，在发育过程中提供氧气、营养物质，并实现废物清除。受精后三周，人类心脏首次跳动，其正常功能的维持依赖于心肌细胞（CMs）。因此，这些特化细胞的不可逆丢失是导致进行性心力衰竭的根本问题。尽管某些生物（如斑马鱼和非洲爪蟾）具有心脏再生的潜力，但成年哺乳动物的心脏再生能力较为有限3,5,6。鉴于心脏的重要功能，心脏病成为全球首要的死亡原因也就不足为奇，仅在美国每年就导致约60万例死亡7。因此，基于细胞的疗法在有效修复或替代受损心肌方面具有重要的临床研究价值。
山中伸弥及其同事的开创性研究8 研究表明，强制表达四种转录因子足以将完全分化的成纤维细胞转化为多能干细胞。然而，所有多能干细胞策略的致瘤性一直是其在治疗应用中的关键担忧。这促使科学界寻求替代方法，以实现细胞的直接转分化，同时避免经过多能性阶段。近期，多个研究团队已证实该策略的可行性，通过异位表达转录因子Gata4、Mef2c、Tbx5，以及后续加入的Hand2（分别称为GMT和GHMT），实现了小鼠成纤维细胞向诱导性心肌样细胞（iCLMs）的直接转化。9,10此外，可采用相同的策略进行操作 体内 以及人源组织9,11,12近期研究强调了可被调控以进一步提高心脏重编程效率的其他因子或信号通路13,14,15综上所述，这些研究展示了定向转分化在再生治疗中的潜力。然而，心肌细胞重编程的效率较低，其分子机制尚不明确，且由于方法学差异导致结果重复性不一致16，且iCLMs的异质性仍未得到解决。
为了直接评估iCLM的异质性，我们设计了一种离散且稳健的单细胞检测方法，用于鉴定肌节发育和心肌细胞谱系特化——这是功能性心肌细胞的两个必要特征。根据位置和独特的电生理特性，心脏中至少存在三种主要类型的心肌细胞（CM）：心房型（AM）、心室型（VM）和起搏器型（PM）17,18,19,20。这些细胞通过协调组合，实现血液的正常泵送。在心脏损伤过程中，一种或所有亚型均可能受到影响，因此细胞治疗的策略需要根据具体情况进行针对性设计。目前，大多数研究策略集中于心肌细胞的整体生成，而针对调控亚型特化分子机制的研究仍较为有限。
以下研究详细介绍了如何准确量化结构有序的肌节，并鉴定多种心肌细胞亚型。利用特异性表达起搏器（PM）报告基因的小鼠模型，我们可采用免疫细胞化学方法区分诱导型心房样心肌细胞（iAM）、诱导型心室样心肌细胞（iVM）和诱导型起搏器样心肌细胞（iPMs）21根据我们的观察，只有表现出肌节结构的细胞才具备自发搏动的能力。这一独特的重编程平台可用于评估相关作用 在单细胞分辨率下对肌节组织、亚型特化以及心肌细胞重编程效率的某些参数进行分析。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td>iCLM 培养基、Plat-E 培养基、成纤维细胞培养基和转染培养基的组分</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11150059</td><td>iCLM 培养基的组分</td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td>iCLM 培养基、Plat-E 培养基、成纤维细胞培养基和转染培养基的组分</td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒 G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400-045</td><td>iCLM 培养基的组分</td></tr><tr><td>MEM 维生素溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11120-052</td><td>iCLM 培养基的组分</td></tr><tr><td>MEM 氨基酸</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1601149</td><td>iCLM 培养基的组分</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td>iCLM 培养基的组分</td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>iCLM 培养基的组分</td></tr><tr><td>B-27 添加剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>iCLM 培养基的组分</td></tr><tr><td>热灭活马血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26050-088</td><td>iCLM 培养基的组分</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-70</td><td>iCLM 培养基的组分</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1514022</td><td>Plat-E 培养基和成纤维细胞培养基的组分</td></tr><tr><td>嘌呤霉素&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11139-03</td><td>Plat-E 培养基的组分</td></tr><tr><td>杀稻瘟菌素&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-128P</td><td>Plat-E 培养基的组分</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td>成纤维细胞培养基的组分</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜 LSM700</td><td>Zeiss</td><td></td><td>用于共聚焦分析</td></tr><tr><td>FuGENE 6 转染试剂</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>转染试剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Opti-MEM 低血清培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985-070</td><td>转染试剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>聚凝胺</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>诱导试剂。使用终浓度为 8 &amp;mu;M/mL</td></tr><tr><td>Platinium-E (PE) 逆转录病毒包装细胞系，嗜同种型</td><td>CellBiolabs</td><td>RV-101</td><td>逆转录病毒包装细胞系</td></tr><tr><td>0.25% EDTA 胰蛋白酶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>用于 MEFs 和 Plat-E 细胞的解离</td></tr><tr><td>小鼠抗 &amp;alpha;-肌动蛋白抗体（克隆 EA-53）</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td>用于共聚焦分析的抗体。使用稀释比例为 1:200</td></tr><tr><td>鸡抗 GFP IgY 抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10262</td><td>用于共聚焦分析的抗体。使用稀释比例为 1:200</td></tr><tr><td>兔多克隆抗 NPPA 抗体&amp;nbsp;</td><td>Abgent</td><td>AP8534A</td><td>用于共聚焦分析的抗体。使用稀释比例为 1:400</td></tr><tr><td>兔多克隆抗 Myl2 IgG 抗体&amp;nbsp;</td><td>ProteinTech</td><td>10906-1-AP</td><td>用于共聚焦分析的抗体。使用稀释比例为 1:200</td></tr><tr><td>含 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）的 Vectashield 溶液</td><td>Vector Labs</td><td>H-1500</td><td>用于共聚焦分析的染料</td></tr><tr><td>Superfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>25 x 75 x 1.0 mm</td></tr><tr><td>BioCoat 纤连蛋白 12 mm 盖玻片</td><td>NeuVitro Corp</td><td>GG-12-1.5</td><td>用于共聚焦分析的盖玻片</td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;m SFCA 25MM 注射器滤器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-740-106</td><td>用于病毒过滤</td></tr><tr><td>6 mL 注射器</td><td>Covidien</td><td>8881516937</td><td>用于病毒过滤</td></tr><tr><td>山羊抗鸡 IgY（H&amp;L）A488</td><td>Abcam</td><td>AB150169</td><td>用于共聚焦分析的二抗。使用稀释比例为 1:400</td></tr><tr><td>驴抗兔 A647 IgG(H+L)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31573</td><td>用于共聚焦分析的二抗。使用稀释比例为 1:400</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG(H+L) A555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21422</td><td>用于共聚焦分析的二抗。使用稀释比例为 1:400</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443-100ml</td><td>用于细胞通透化&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>不含 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 的杜氏磷酸盐缓冲液 (D-PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Power Block 10x 通用封闭试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9495720</td><td>用 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 稀释至 1x</td></tr><tr><td>16% 甲醛水溶液 (PFA)</td><td>Electro Microscopy Sciences&amp;nbsp;</td><td>15710</td><td>使用时用 dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 稀释至 4%</td></tr><tr><td>6 cm&amp;nbsp; 培养皿</td><td>Olympus</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 组织培养皿</td><td>Corning</td><td>4239</td><td></td></tr><tr><td>15 cm&amp;nbsp; 组织培养皿</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5442</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Corning</td><td>4308</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>Corning</td><td>4249</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>用于细胞活力检测</td></tr><tr><td>200 证明乙醇</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7005</td><td></td></tr><tr><td>漂白剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6009</td><td></td></tr></tbody></table>

通过转录因子介导的重编程评估小鼠胚胎成纤维细胞来源的心肌细胞亚型

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

一种细胞类型直接重编程为另一种细胞类型的技术近年来已成为再生医学、疾病建模和细胞谱系定向的重要研究范式。特别是利用Gata4、Hand2、Mef2c和Tbx5（GHMT）将成纤维细胞转化为诱导性心肌样细胞（iCLMs），为生成心肌样细胞提供了一条重要途径 从头合成 心肌细胞 体外 和 体内最近的证据表明，GHMT 诱导产生的心肌细胞亚型比以往所认知的更为多样，因此凸显了系统性开展进一步研究的必要性。然而，在直接重编程能够作为治疗策略应用之前，必须深入理解谱系转换的分子机制，以生成特定的心肌细胞亚型。本文中，我们提供了一种通过 GHMT 介导重编程小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）生成诱导性心肌样细胞（iCLMs）的详细实验方案。 
我们概述了小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的分离、逆转录病毒的制备以及MEF感染的方法，以实现高效的重编程。为了确定重编程细胞的亚型身份，我们详细描述了使用一组特定的兼容性抗体对诱导型心肌样细胞（iCLMs）进行免疫细胞化学染色的逐步操作流程。本文还介绍了共聚焦显微镜的使用方法，以及对iCLMs和各个心房亚型（iAM）、心室亚型（iVM）和起搏细胞亚型（iPM）进行识别与定量分析的技术。最后，我们展示了典型直接重编程实验的代表性结果，并强调了本实验方案中确保高效谱系转换的关键技术要点。综上所述，我们优化后的实验流程可为研究人员提供一个系统的分步指南，用于开展需要鉴定单个心肌细胞亚型的有意义的心脏重编程实验。

利用PM特异性报告小鼠，我们开发了一种多重免疫染色策略，用于鉴定多种内源性心肌细胞，如图1所示。按照图2所示的重编程步骤，可在第4天起检测到亚型特异性心肌细胞的诱导生成21，尽管效率较低。到第14天，可终止实验并评估肌节结构组织（图3）及细胞亚型特异性（图4）。图5总结了用于免疫细胞化学染色的载玻片制备流程（图5 面板A），以及iCLM亚型特异性细胞的定量分析方法（图5 面板B/C）。
<img alt="免疫荧光显微镜图像显示经DAPI染色的细胞，以及α-肌动蛋白、Hcn4-GFP、Nppa、Myl2标记物。" src="/files/ftp_upload/55456/...

本论文描述了一种利用逆转录病毒介导的Gata4、Hand2、Mef2c和Tbx5递送方法，逐步生成并定量多种重编程心脏亚型的实验方案。

一种细胞类型直接重编程为另一种细胞类型的技术近年来已成为再生医学、疾病建模和谱系研究的强大范式……

本实验的总体目标是生成并量化多种诱导型心肌细胞亚型。该方法有助于回答心脏重编程过程中有关亚型特异性谱系转化的关键基础科学问题，例如调控肌节组装和亚型特化的必要信号因素。该技术的主要优势在于，它提供了对心肌细胞亚型特化进行定量分析的方法，这对于开展机制性研究至关重要。首先，从 E12.5 期胚胎中分离小鼠胚胎成纤维细胞，并按照随附的文字实验方案所述，将其保存于液氮中。接着，收集 Plat-E 细胞，并以每孔一百万个细胞的密度接种至六孔板中，使细胞在 24 小时后达到 70% 至 80% 的融合度。用转染培养基覆盖细胞，并在标准培养条件下孵育。实验前一天，取一个15毫升锥形聚苯乙烯管，每反应加入60微升低血清培养基和6微升转染试剂，混匀。室温孵育混合物5分钟。由于转染试剂的使用，需将试剂直接加入低血清培养基中，以避免转染效率降低。接下来，每反应加入总共两微克的GHMT混合物，并轻轻敲击离心管以混匀。室温孵育15分钟后，以逐滴加入的方式将混合物添加至plat-E细胞中。记录转染的日期和时间。将转染后的plat-E细胞在培养箱中孵育过夜。在铺板小鼠胚胎成纤维细胞前一小时，通过向每个孔中加入12毫米的纤维连接蛋白包被的盖玻片，准备用于免疫细胞化学的24孔板。接着，向每个孔中加入 300 µL 牛胶原蛋白溶液，并将培养板孵育 1 小时。在孵育接近结束时，解冻一管冷冻保存的 HCN4GFP 小鼠胚胎成纤维细胞。快速解冻细胞，用预热的成纤维细胞培养基洗涤一次，并计数活细胞浓度。然后吸除24孔板中的包被液，并立即将每孔30,000个细胞接种到包被有胶原蛋白和纤连蛋白的盖玻片上。转染后24小时，用0.45微米孔径的无表面活性剂醋酸纤维素滤器过滤逆转录病毒培养基，转移至15毫升锥形管中。然后加入聚凝胺，使其终浓度为8微克/毫升。用两毫升新鲜转染培养基小心地补充 plat-E 细胞。更换培养基过快可能导致细胞脱落。正确维护的 plat-E 细胞每毫升可产生平均一千万个感染单位。超过95%的细胞中呈现高GFP表达与荧光强度，通常表明GHNT介导的诱导心肌细胞样肌细胞生成成功。接下来，吸弃培养的胚胎成纤维细胞培养基，加入新鲜收集的逆转录病毒培养基。随后将培养皿放回培养箱中，孵育过夜。第二天，再次将培养基从plat-E细胞转移至胚胎成纤维细胞。第二次收集病毒后，弃去plat-E细胞。诱导48小时后，吸除细胞条件培养基，并用PBS洗涤细胞一次。然后向24孔板的每孔中加入500 µL预热的诱导型心肌样细胞培养基。接下来的12天内，每两到三天更换一次培养基。诱导后第14天，小心吸除培养基，并用300 µL冰冷的PBS清洗每个孔。然后吸除 PBS，并向每孔加入 250 微升 4% 多聚甲醛溶液，在室温下孵育细胞 15 分钟。接着，用 300 微升含 0.1% Triton X-100 的 PBS 溶液洗涤各孔三次，每次五分钟，以对细胞进行通透处理。最后一次洗涤后，吸去多余的通透液，然后每孔加入 300 微升通用封闭缓冲液。室温封闭10分钟。将一对切片用小鼠抗alpha actenin抗体、鸡抗GFP抗体和兔抗NPPA抗体在4℃孵育过夜，以鉴定在诱导的类似心房肌细胞中生成的类似起搏细胞的心肌细胞。次日，洗涤孔板，并按照随附文本方案加入相应的二抗。经过额外的洗涤后，向玻璃显微镜载玻片上加入 2.4 µL 封片介质。从 24 孔板中取出一张盖玻片，并去除多余的溶液，然后将其转移至含有封片介质的玻璃载玻片上。对于每张玻片，从一端开始，在红色荧光通道中上下扫描，以识别α-肌动蛋白阳性且肌节阳性的细胞。肌节条纹在555纳米波长下最容易识别。一旦发现目标细胞，切换至绿色通道，并记录细胞是否呈阳性。然后切换到计算机，检测远红光 647 纳米波长，以观察 NPPA 或 MYL2 染色情况。若细胞呈 α-肌动蛋白阳性、肌节阳性、Hnc4-GFP 阴性且 Nppa 阳性，则为诱导生成的类心房样心肌细胞。Nppa 染色将呈现核周及点状分布。首先，按照随附文本方案中的描述，在接种后24小时对细胞数量进行计数。接着，对盖玻片上的每个细胞进行显微观察，检查α-辅肌动蛋白（alpha-actinin）和肌节（sarcomere）染色是否正确，并记录同时对这两种标记物呈阳性染色的细胞数量。然后，将该数值除以实际接种的总细胞数。一次典型的重编程实验将获得约百分之一的同时呈α-肌动蛋白和肌节阳性的细胞。到第14天，可终止实验并评估肌节的排列情况。此处以红色显示的α-肌动蛋白阳性染色即为鉴定依据。只有表现出肌节结构的细胞才具备自发搏动的能力，因此这是一个良好的初步检测指标。图中所示为来自Hcn4-GFP报告小鼠的诱导性起搏样心肌细胞。此视野中有三个细胞表现出肌节结构。图像中心可见三个 Hcn4-GFP 阳性的细胞簇，可鉴定为起搏细胞类型。左下角的一个细胞可见 α-肌动蛋白染色，但无肌节结构或可识别的亚型标志物。在此类诱导生成的类似心室的心肌细胞群体中，中央细胞表现出肌节结构，且该细胞对肌球蛋白轻链标志物 MYL-2 呈阳性染色，MYL-2 是心室心肌细胞的标志物。一旦掌握，plat-E细胞的铺板和转染可在一小时内完成。小鼠胚胎成纤维细胞的诱导需一至两小时，而对完整的24孔板进行有丝分裂计数约需八小时。在进行该实验操作时，需牢记健康的鼠胚胎成纤维细胞和高滴度病毒是成功重编程实验的关键。观看本视频后，您应能够充分理解如何生成并定量分析各种诱导型心肌细胞亚型。

assessing-cardiomyocyte-subtypes-following-transcription-factor

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

评估心肌亚型以下鼠标胚胎成纤维细胞的转录因子介导的重编程

单细胞表达谱分析可对单个细胞进行详细的基因表达分析。我们描述了心肌细胞的分离方法，以及对所得裂解液进行全转录组微阵列分析或特定靶标qPCR检测的制备步骤。...

成年小鼠心肌细胞的单细胞转录谱分析

本文详细描述了通过选择性调控Wnt信号通路，将人多能干细胞高效分化为心肌细胞的方法，并随后通过流式细胞术分析参考标志物，以评估细胞群体的均一性和身份特征。...

高效率诱导人多能干细胞分化为心肌细胞及通过流式细胞术进行表征

本文介绍了一种利用逆转录病毒介导的多顺反子载体递送Gata4、Tbx5和Mef2c来生成诱导心肌样细胞（iCMs）的实验方案。该方案可获得相对均一的重编程细胞群体，且重编程效率和细胞质量得到提升，对今后iCM重编程的研究具有重要价值。...

利用表达最佳比例Gata4、Mef2c和Tbx5的多顺反子载体改进诱导心肌细胞的生成

基因转录的精细调控是胚胎细胞命运决定的基础。本文描述了染色质免疫沉淀实验，用于研究干细胞向心肌细胞分化以及小鼠胚胎心脏发育过程中的表观遗传调控机制。...

胚胎干细胞和组织心肌分化的表观遗传调控

本方案描述了一种可重复地分离成年小鼠心肌细胞并进行长期培养的逐步操作方法，具有较高的得率、纯度和细胞活性。...

成年小鼠心肌细胞的分离、培养与转导

本文所述方案详细介绍了通过过表达少量转录因子，在小鼠胚胎成纤维细胞中诱导造血程序的方法。该技术可被拓展至人类体系，为未来研究造血过程、血液系统疾病以及造血干细胞移植提供平台。...

利用转录因子重编程小鼠胚胎成纤维细胞以诱导造血程序

为了区分心肌细胞的细胞分裂与细胞周期变化，我们提供了使用两种转基因小鼠品系的实验方案：Myh6-H2B-mCh 转基因小鼠，用于明确鉴定心肌细胞的细胞核；以及 CAG-eGFP-anillin...

出生后心肌细胞细胞周期变异的可视化及核形成确定

本文介绍了一种高效利用年轻来源的人类间充质干细胞的心脏分化潜能以生成具有功能且能够收缩的心肌样细胞的方法。...

体外 人源间充质干细胞向功能性类心肌细胞的分化

本文介绍一种通过过表达GATA4、Hand2、Mef2c、Tbx5、miR-1和miR-133（GHMT2m）并同时抑制TGF-β信号通路，将原代胚胎成纤维细胞重编程为功能性心肌细胞的稳健方法。本方案在转导后最早7天即可生成搏动的心肌细胞，重编程效率高达60%。...

抑制促纤维化信号通路增强因子介导的小鼠胚胎成纤维细胞向诱导型心肌细胞的重编程

本文描述了一种Tg(Myh6-cre)1Jmk/J...

利用GCaMP3报告系统体外评估心脏重编程过程中的心肌特异性钙流

了解利用Gata4、Hand2、Mef2c和Tbx5转录因子将小鼠胚胎成纤维细胞直接重编程为诱导心肌样细胞的方法。该技术可生成并量化心房、心室和起搏器等多种心肌亚型，为心脏谱系转化和再生医学研究提供系统化的体外实验方案。

通过转录因子介导的重编程评估小鼠胚胎成纤维细胞来源的心肌细胞亚型

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