Name: 人工程心脏组织的收缩自动分析心脏药物安全筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 了解利用人诱导多能干细胞构建三维工程心脏组织的方法，用于体外收缩分析和药物筛选。该技术可测量收缩力并评估药物对心脏功能的影响，为心脏疾病建模和安全药理学研究提供可靠平台。

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作者感谢Alessandra Moretti和Dennis Schade对材料的慷慨贡献。我们感谢UKE实验药理学与毒理学系iPS和EHT工作组提供的大力支持。本研究工作得到了德国心血管研究中心（DZHK）、德国联邦教育与研究部（BMBF）、德国研究基金会（DFG Es 88/12-1，HA 3423/5-1）、英国国家实验动物替代、优化与减少研究中心（NC3Rs CRACK-IT 资助项目 35911-259146）、英国心脏基金会（RM/13/30157）、欧洲研究理事会（高级资助项目IndivuHeart）、德国心脏基金会以及汉堡自由汉萨市的资助支持。

注意：以下步骤描述了一种细胞培养方案。请在无菌条件下操作，并使用预热的培养基。
1. hiPSC 的心脏分化
<ol>
	<li>培养人诱导多能干细胞
	<ol>
		<li>用生长因子减少型基底膜基质包被6孔板（每孔1 mL）或T75培养瓶（每瓶7 mL）例如 Geltrex，按1:200比例用DMEM稀释；参见材料表），在37 °C孵育30分钟。配制FTDA培养基12 通过将基础DMEM/F-12培养基与2 mM L-谷氨酰胺、0.5%青霉素/链霉素、5 mg/L转铁蛋白、5 µg/L硒、0.1%人血清白蛋白、1×脂质混合物、5 mg/L胰岛素、50 nM dorsomorphin、2.5 ng/mL activin A、0.5 ng/mL人TGFß1和30 ng/mL FGF2混合制备。</li>
		<li>种子 hiPSC（约 3 x 105/ 10 cm²）的FTDA培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下培养2，21% O₂2 每日更换培养基（图1A）。当细胞融合度达到80%时，使用乙二胺四乙酸（EDTA；0.5 mM；孵育时间约4分钟）进行传代（1:2–1:6）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎样体（EB）的形成
	<ol>
		<li>在T75培养瓶中将hiPSC培养至高密度。
		<ol>
			<li>用不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗贴壁细胞培养瓶两次，然后在0.5 mM EDTA中孵育约10分钟。注意确保细胞不从瓶底脱落。</li>
			<li>用玻璃移液管移除EDTA，加入10 mL PBS冲洗细胞，并轻轻敲击培养瓶底部以使细胞脱落。 
			注意：必要时使用细胞刮刀。</li>
			<li>将细胞收集至50 mL锥形管中，加入¼体积的例如 10 mL RPMI 加入至 40 mL 细胞悬液中，使用 RPMI 1640 培养基（或其他含 1.8 mM 钙的标准化培养基），250 × g 离心 5 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在含4 mg/mL聚乙烯醇（PVA）和10 µM Y27632的FTDA培养基中重悬细胞沉淀，使用Neubauer计数板进行细胞计数。</li>
		<li>将细胞悬液加入旋转烧瓶中（30 x 106 细胞/100 mL 含PVA和Y-27632的FTDA培养基；见步骤1.2.2），在细胞培养孵育箱中（37 °C，5% CO₂）于旋转烧瓶中启动拟胚体形成（调节磁力搅拌器转子转速至40 rpm）2，5% O₂2过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>中胚层分化
	<ol>
		<li>在拟胚体形成过程中，使用适合悬浮培养的细胞培养瓶，加入非离子型表面活性剂（14 mL/T175），于37 °C孵育过夜。</li>
		<li>次日早晨，用 PBS（30 mL/T175）将表面活性剂包被的培养瓶洗涤两次。再次加入 PBS，并置于培养箱中保存，待用时取出。</li>
		<li>从培养箱中取出旋转烧瓶。 
		注意：细胞悬液应澄清，并含有肉眼可见的小型拟胚体（EBs）图1B).</li>
		<li>将50 mL悬浮液转移至50 mL锥形管中，静置EBs 5–20分钟。</li>
		<li>移去上清液，用 7 mL 添加了 2% PVA 和 10 µM Y-27632 的 RPMI 1640 培养基重悬沉淀。将悬液转移至带刻度的 15 mL 锥形管中，估测拟胚体体积（约 50–100 µL）。</li>
		<li>将旋转培养瓶中的内容物转移至未包被的T175培养瓶中，置于V型架上静置沉降，时间不超过20分钟。移除上清液，并按上述方法洗涤拟胚体。T175培养瓶中液体体积不得超过200 mL，否则沉降时间将过长。若初始旋转培养瓶体积超过200 mL，应将拟胚体悬液分装至多个T175培养瓶中进行洗涤，洗涤后再合并拟胚体。</li>
		<li>去除洗涤培养基，重悬于中胚层分化培养基中，即在RPMI中添加4 mg/mL PVA、0.5%青霉素/链霉素、10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、0.05%人血清白蛋白、5 µg/mL转铁蛋白、5 ng/mL亚硒酸钠、0.1%脂质混合物、250 µM磷酸抗坏血酸、10 µM Y-27632、10 ng/mL骨形态发生蛋白-4（BMP-4）、3 ng/mL激活素A（activin A）和5 ng/mL稳定型FGF2。</li>
		<li>从表面活性剂包被的T175培养瓶中移除PBS，并加入细胞悬液（40 mL中含200 µL EBs）。EB体积较小时使用较小的培养瓶。</li>
		<li>将拟胚体（EBs）在悬浮条件下培养三天（37 °C，5% CO₂）2，5% O₂2每天更换50%的培养基（成分与步骤1.3.7中相同）（使用V型沉降架）。每次换液前需新鲜配制培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>心脏分化
	<ol>
		<li>前一天准备新的表面活性剂包被容器，并按照上述说明（1.3.2）进行操作。</li>
		<li>经过三天的中胚层诱导后，将拟胚体置于沉降架上静置最多5分钟。吸除大部分培养基，用添加了0.5%青霉素/链霉素和10 mM HEPES的RPMI 1640培养基洗涤。</li>
		<li>将10 mL EB悬浮液转移至带刻度的15 mL离心管中，沉降后估算EB体积。</li>
		<li>小心地将EBs重悬于心肌分化培养基中，该培养基由RPMI 1640添加0.5%青霉素/链霉素、10 mM HEPES、0.05%人血清白蛋白、5 µg/mL转铁蛋白、5 ng/mL亚硒酸钠、0.1%脂质混合物、250 µM磷酸抗坏血酸、1 µM Y-27632和100 nM Wnt抑制剂DS-I-7组成13.</li>
		<li>将拟胚体转移至新的表面活性剂包被的细胞培养瓶中（约200 µL拟胚体加入46 mL/T175）。</li>
		<li>37 °C、5% CO₂条件下孵育三天2，21% O₂2第2天和第3天更换50%培养基（培养基成分见步骤1.4.4），最初48小时内不更换培养基。</li>
		<li>在含有500 µM 1-巯基甘油、10 mM HEPES、0.5% 青霉素/链霉素、1 µM Y-27632 和 2% 无血清神经细胞培养添加剂的RPMI 1640培养基中孵育例如 B27)、胰岛素和100 nM Wnt抑制剂DS-I-7，此后四天内每天更换50%培养基。在此期间，拟胚体应开始出现搏动。</li>
		<li>心肌分化一周后，更换为不含Wnt抑制剂但添加无血清神经细胞培养补充剂的相同培养基。除第一天外，每天更换50%培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人心肌细胞的分离 
	注意：经过两周的分化程序后，拟胚体应出现自发性收缩（图1C）。如果确认无误，开始解离并配制胶原酶溶液。
	<ol>
		<li>在无钙/镁的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中配制胶原酶溶液，称量并溶解至终浓度为200 U/mL，加入1 mM HEPES、10 µM Y-27632、30 µM N-苄基-对甲苯磺酰胺（BTS）。通过0.2 µm滤器过滤除菌，分装后于-20 °C保存。使用前于4 °C过夜解冻。</li>
		<li>将EBs置于沉降架上，吸除培养基，加入20–25 mL预热的HBSS。重复洗涤步骤一次。</li>
		<li>吸弃 HBSS，加入预热的胶原酶溶液（15 mL/T175）。在细胞培养箱中孵育 4 小时（37 °C，5% CO₂）2，21% O₂2).</li>
		<li>用添加了1%青霉素/链霉素和DNase（12 µg/mL）的DMEM制备封闭缓冲液。</li>
		<li>轻敲细胞培养瓶底部，使解离的拟胚体分散并脱落（若未充分解离，可延长孵育时间）。轻柔吹打细胞悬液，并转移至50 mL锥形管中。用封闭缓冲液（每T175培养瓶15 mL）清洗培养瓶，随后将洗液一并转移至锥形管中。</li>
		<li>以 100 × g 离心 10 分钟。用预热的 DMEM 重悬细胞，吹打混匀并计数细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 工程化心脏组织（EHT）的制备
<ol>
	<li>对市售的PDMS支架和聚四氟乙烯（PTFE）垫片进行高压灭菌（见 材料与设备 电子表格 图2）并在生成EHT前一天，在无菌条件下配制以下溶液。
	<ol>
		<li>称取适量琼脂糖，溶于适当体积的PBS中，配制成2%琼脂糖溶液，经高压灭菌后立即置于60 °C保存。</li>
		<li>称取抑肽酶并溶于适量注射用水中，配制成33 mg/mL溶液，经0.22 µm滤膜无菌过滤后分装，于-20 °C保存。</li>
		<li>将无菌纤维蛋白原溶于适量无菌0.9% NaCl（微温）中，配制成200 mg/mL的纤维蛋白原溶液，分装后于-20 °C保存。</li>
		<li>将无菌凝血酶溶于3份无菌PBS和2份注射用水中，配制成100 U/mL的凝血酶溶液，分装为每管3 µL，于-20 °C保存。</li>
		<li>将670 mg 10x DMEM粉末溶解于5 mL注射用水中，配制10x DMEM，经无菌滤膜过滤后，4 °C保存。</li>
		<li>通过将2 mL 10倍浓缩DMEM与2 mL热灭活马血清、0.2 mL青霉素/链霉素及5.8 mL注射用水混合，配制2倍浓缩DMEM，经无菌过滤后于4 °C保存。</li>
		<li>通过将DMEM与10%热灭活胎牛血清、1%青霉素/链霉素和1% L-谷氨酰胺（200 mM）混合制备EHT成胶培养基（ECM），4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在24孔板中制备浇铸模具，加入1.6 mL温热琼脂糖（2%，PBS），并放置聚四氟乙烯（PTFE）间隔片图 2A) 加入孔板中。 
	注意：将琼脂糖加入最多8个孔后，应立即插入间隔器——琼脂糖凝固速度非常快。琼脂糖在室温下放置时间不得超过5分钟。</li>
	<li>琼脂糖凝固后（约10分钟，琼脂糖变为不透明），移除聚四氟乙烯（PTFE）垫片（图2C）并将PDMS支架（图2B) 注入铸造模具中，使成对的PDMS柱伸入每个模具内 (图 2D).</li>
	<li>将心肌细胞重悬于细胞外基质（ECM）中，浓度至少为 15 x 106 cells/mL</li>
	<li>在冰上，于圆底15 mL离心管中配制所需重建混合液预估体积的110%。对于24个EHT，分别用移液器加入表1中列出的人、大鼠或小鼠心肌细胞对应的重建混合液（已包含10%额外量）。 
	注意：人源与小鼠样本的重建混合物中细胞浓度不同（人源为10 × 10⁶，小鼠为5 × 10⁶）。6 细胞/mL），大鼠（4.1 × 106 细胞/mL）和小鼠（6.8 × 106 细胞/mL）EHT。根据细胞悬液的浓度，加入额外的细胞外基质（ECM），使最终体积达到2,640 µL。纤维蛋白原在移液前需恢复至室温。吸取纤维蛋白原时，应缓慢充满枪头，且在将其加入重构混合物时，避免含有纤维蛋白原的枪头接触冷的重构混合物表面——否则枪头内纤维蛋白原的黏度会立即升高。</li>
	<li>用血清移液管将重悬混合液吹打10至15次，直至纤维蛋白原凝块完全溶解。通过移液管检查重悬混合液的均匀性。</li>
	<li>对于每个EHT，在一个凝血酶分装液（200 µL管中含3 µL）中加入100 µL重悬混合液，混匀后尽快将混合液移入琼脂糖孔槽中（图 2E）。每处理一个EHT均需使用新的带滤芯吸头。每处理8个EHT后，用移液管吹打重悬重悬混合物5–10次。</li>
	<li>所有加样槽中加入重悬混合液后，盖上细胞培养皿盖子，于 37 °C、7% CO₂ 条件下孵育2 2小时。</li>
	<li>从培养箱中取出培养板，置于无菌操作台中。向每孔加入少量培养基（例如 DMEM（约200–500 µL），轻轻摇动培养板，再次于37 °C孵育至少10分钟。加入DMEM有助于将纤维蛋白凝胶从琼脂糖制模中更易取出。</li>
	<li>在新的24孔板中每孔加入1.5 mL EHT培养基，培养基成分为添加了10%热灭活马血清、1%青霉素/链霉素、10 µg/mL胰岛素和33 µg/mL抑肽酶的DMEM。</li>
	<li>小心地将PDMS支架从琼脂糖制模中取出，并转移至含有培养基的24孔板中（图2F）。将培养皿放回培养箱（37 °C，7% CO₂）中。2，40% O2 对于人和大鼠的EHTs，21% O₂2 对于小鼠EHTs，应在周一、周三和周五使用新配制的EHT培养基进行换液。EHTs在制备后7–10天应出现自发性收缩，并使PDMS支架的支柱发生偏转（图1D、2G）。
	<ol>
		<li>对于小鼠EHTs，在培养基中加入25 µg/mL的5-胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷，持续48小时，以抑制成纤维细胞增殖。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 收缩分析
注意：收缩分析基于商用EHT分析仪器中的视频光学记录（见材料表）。该仪器的核心部件为一个培养室（图3A）。仪器配套软件通过已知弹性模量和几何结构的PDMS微柱的偏转程度来计算收缩力11（补充图1）。
<ol>
	<li>在测量前2小时打开仪器的加热装置。在进行收缩分析前立即打开轴系统气体供应和电源。</li>
	<li>为获得基线记录（分析中的参考点），将含有工程化心脏组织（EHTs）的24孔板置于EHT分析仪内的EHT培养基中，按照供应商手册启动收缩分析软件。
	<ol>
		<li>点击 &#34;实验方案&#34; 在右侧面板的标签中输入有关研究名称、用户、物种、细胞类型、年龄、记录时长以及附加备注的相关信息。</li>
		<li>点击 &#34;相机视图&#34; 单击左侧面板上的选项卡，启动摄像头实时模式并启用自动图形检测功能。点击 &#34;设置&#34; 在右侧面板中点击标签，使用 xyz 坐标为 24 孔板中的每个孔调整相机位置。确保 EHT 位于窗口中央，并且处于相机的聚焦范围内。
		<ol>
			<li>确保细胞培养皿的盖子没有雾气，否则会影响图像识别和收缩分析。 
			注意：图像识别算法基于检测高对比度区域，并监测这些区域位置的变化。在软件中，图像识别区域将用蓝色十字标记，该标记会随着工程化心脏组织（EHT）的收缩而移动。</li>
			<li>确保蓝色十字标记位于EHTs的顶端和底端，并仅沿垂直方向移动，以匹配EHTs的收缩运动。图3B). 通过按下按钮保存每个孔的设置位置 &#34;位置正确&#34;.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>接下来，单击 &#34;参数&#34; 左侧面板上的选项卡。此处显示的参数用于定义软件识别收缩峰并以绿色方块标记的标准。这些数值对于准确识别收缩峰至关重要（图3C）且无虚假数据点（图3E-F). 
		注意：依赖于物种的参数列表及示例见下文 图3H有关更多详细信息，请参阅软件手册。</li>
		<li>点击 &#34;自动&#34; 在右侧面板上点击标签，然后通过激活来启动分析 &#34;开始&#34; 按钮。软件将依次从一个孔移动到下一个孔，记录EHT收缩并在记录期间计算力（显示在 &#34;实时&#34; 左侧面板上的标签）。分析结束后，系统将自动生成一份汇总结果的 PDF 报告。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>保存并分析系统生成的PDF报告，以总结结果。</li>
	<li>通过连续数天的重复测量来监测收缩参数。工程化心肌组织的收缩力将逐渐增强，直至达到平台期（通常在培养的第15天左右）。</li>
	<li>药物筛选
	<ol>
		<li>提前一天配制无蛋白Tyrode溶液，并将2 mL/孔的溶液加入24孔板中，于细胞培养孵箱（37 °C，7% CO₂）内平衡。2，40% O2过夜：120 mM NaCl，5.4 mM KCl，1 mM MgCl₂2，0.1-5 mM CaCl2，0.4 mM NaH2PO4，22.6 mM NaHCO₃3，5 mM 葡萄糖，0.05 mM Na2EDTA，25 mM HEPES。加入钙至终浓度1.8 mM或先前确定的[EC50] 以研究正性肌力作用。</li>
		<li>称取药物并溶于DMSO中，必要时进行无菌过滤。配制6种不同浓度的1000倍工作液（溶于DMSO）例如 0.3、1、3、10、30、100 µM（分别对应纳摩尔浓度范围）。</li>
		<li>在Tyrode板中稀释相应的储备液（每孔2 mL加入2 µL），并充分混匀。将板放回培养箱中，待用时取出。</li>
		<li>在超净台内取第一个装有Tyrode液的24孔板，将碳电极插入各孔中。将带有EHTs的PDMS支架转移至碳电极上方，盖上盖子，将培养板放回培养箱，静置约30分钟以达到平衡状态。</li>
		<li>将EHTs从培养箱转移至EHT分析仪器的联锁腔室内。关闭仪器，记录自发性基线收缩功能（每EHT 20秒）。</li>
		<li>将碳电极连接至起搏电缆，并开始对EHTs进行电刺激（2.5 V，4 ms脉冲持续时间，人：约1 Hz，大鼠：约2 Hz，小鼠：约4 Hz）。记录 &#34;按节律的&#34; 基线（10 秒/每个 EHT）。确保所有 EHT 均正常起搏。刺激频率和电压可能因细胞系不同而有所差异。</li>
		<li>基线记录完成后，将工程化心脏组织（EHTs）从仪器上取下，连同顶部带有PDMS支架的电极一起转移至含有第一种药物浓度的24孔板中。随后立即将EHTs重新放回EHT分析仪器的接口上，并在其中孵育（标准药物孵育时间） 例如 20 分钟。</li>
		<li>重新连接起搏电缆，调整图像识别，并记录EHT在第一药物浓度下的收缩反应。</li>
		<li>对于以下药物浓度，使用含有更高药物浓度的24孔板重复步骤3.5.7和3.5.8。</li>
		<li>保存所有 PDF 记录文件。逐一检查每份记录中的图形识别情况，确认用于标识收缩峰和伪迹的绿色方框位置是否正确（参见 3.2.1 和 图3).</li>
		<li>如有需要，可进行额外的离线分析。
		<ol>
			<li>选择相应的运行 &#34;运行&#34; 通过点击左侧面板的数据库 &#34;选择运行&#34;. 在 &#34;参数&#34; 在左侧标签中，更改收缩分析的参数。现在选择 &#34;离线分析&#34; 在 &#34;离线&#34; 在右侧面板上点击标签以重新分析视频。</li>
			<li>为了调整图像识别并因此录制新的视频文件，请选择 &#34;样本审查&#34; 调整图像识别后 &#34;实时&#34; 注：样本复查一次只能重新分析一个孔，而离线分析可通过点击按钮为所有孔应用新的参数。 &#34;在所有孔中使用该参数&#34; 在 &#34;参数&#34; 左侧面板。这两种离线分析将自动创建新的数据文件和显示结果的 pdf 文件。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过整合生物学重复实验的结果来分析实验，并将数据汇总为频率、收缩力、收缩时间和舒张时间的浓度反应曲线图5D）和/或平均收缩峰的图形显示（图5C). 
		注意：PDMS支架和PTFE垫片可重复使用（PDMS支架最多使用5次，PTFE垫片可无限次使用）。使用后，用水手动清洗，再用去离子水煮沸两次，并进行高压灭菌。重复使用支架时需注意潜在的残留效应，因为药物可能被PDMS吸附。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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 <a target="_blank" href="http://www.eht-technologies.com">http://www.eht-technologies.com</a> Forthcoming.</li>
</ol>

I.M.、T.E. 和 A.H. 是德国 EHT Technologies GmbH 的联合创始人。

工程化心肌组织为心血管研究工具箱提供了一种有价值的选项。采用24孔板格式的工程化心肌组织（EHT）已证明在疾病建模8,14、药物安全性筛选7,8,10,11,15以及基础心血管研究16,17中具有重要价值。
对基本EHT方案的潜在改进包括心肌细胞与非心肌细胞特定混合物的细胞相互作用研究18以及后负荷增强研究14。故障排查的重要方面包括...

由药物引发的长QT综合征等心脏副作用导致过去数年中多款药物被撤市。统计数据显示，约45%的药物撤市案例源于对心血管系统的不良反应1药物在经历昂贵的研发过程并获批后却遭遇失败，这对制药公司而言是最糟糕的情况。因此，研发部门致力于尽早发现此类不良心血管反应。出于经济和伦理方面的考虑，人们正努力减少动物实验，并以新的替代方法取代动物实验 体外 筛选实验正在进行中。
美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）指南中包含了一系列既定的检测方法，用于药物致心律失常作用的临床前评估2体细胞重编程技术以及人诱导性多能干细胞（hiPSC）的分化技术推动了该研究领域的发展3现在提供了在人心肌细胞上筛选新药物候选物的可能性 体外 并避免了物种间差异带来的问题。近期的心肌分化方案4,5 提供无限量的心肌细胞，且无伦理顾虑。然而，收缩力的测量——最重要且研究最充分的 体内 心肌细胞参数尚未明确建立，这与相对不成熟性有关6 与成年心肌细胞相比，人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CM）存在差异。一种可能的改进方法是利用单个细胞构建三维心脏组织7 （工程化心肌组织，EHT）。EHT 实验方案基于将单个鼠源或人源心肌细胞包埋于三维基质中8,9,10 在两个柔性聚二甲基硅氧烷（PDMS）支柱之间的纤维蛋白水凝胶中11 在24孔板中进行。数天内，心肌细胞开始作为单个细胞自发收缩，并逐渐形成细胞网络。7-10天后，可观察到整个组织的宏观收缩。在此过程中，细胞外基质发生重塑，导致组织直径和长度减小。EHT的缩短即使在静息状态下也会引起PDMS支柱弯曲，使发育中的心肌细胞持续承受负荷。EHT可在数周内持续进行等长-动力性肌肉收缩。人源EHT对生理性和药理性刺激均表现出反应性，表明其适用于药物筛选与疾病建模。7.
本文中，我们介绍了一种稳定且简便的人工心肌组织（EHT）制备方案，以及在存在hERG通道抑制剂的情况下，对收缩模式随浓度变化进行自动化收缩力分析的方法。

<table><tbody><tr><td>EHT分析仪器</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>A0001</td><td>包含软件</td></tr><tr><td>EHT PDMS支架</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>C0001</td><td></td></tr><tr><td>EHT PTFE间隔片</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>C0002</td><td></td></tr><tr><td>EHT电极</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>P0001</td><td></td></tr><tr><td>EHT起搏适配器/电缆</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>P0002</td><td></td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Nunc</td><td>144530</td><td></td></tr><tr><td>6孔细胞培养板</td><td>Nunc</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>15 mL离心管，带刻度&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Sarstedt</td><td>831,830</td><td></td></tr><tr><td>旋转培养瓶</td><td>Integra</td><td>182 101</td><td></td></tr><tr><td>搅拌器 Variomag/Cimarec Biosystem Direct&amp;nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>70101</td><td>调节转子转速至40 rpm</td></tr><tr><td>T175细胞培养瓶&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt&amp;nbsp;</td><td>831,812,002</td><td></td></tr><tr><td>V型沉降架&amp;nbsp;</td><td>德国汉堡UKE定制</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;times; DMEM</td><td>Gibco</td><td>52100</td><td></td></tr><tr><td>1-硫代甘油&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49752</td><td></td></tr><tr><td>Activin-A&amp;nbsp;</td><td>R&amp;D systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15510-019</td><td></td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>注射用水</td><td>Baxter GmbH</td><td>1428</td><td></td></tr><tr><td>B27 PLUS胰岛素&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>R&amp;D systems</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶II&amp;nbsp;</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom</td><td>F0415</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>DNase II，V型（来自牛脾）</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>D8764</td><td></td></tr><tr><td>多索吗啡&amp;nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab120843</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&amp;nbsp;</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-921</td><td></td></tr><tr><td>纤维蛋白原（牛源）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A1413302</td><td>用于包被：1:200稀释</td></tr><tr><td>无Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;的HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-053</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Roth</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>Life technologies</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>人血清白蛋白&amp;nbsp;</td><td>Biological Industries</td><td>05-720-1B</td><td></td></tr><tr><td>人胰岛素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Lipidmix&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5146</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>用于EHT重建混合液。</td></tr><tr><td>N-苄基-对甲苯磺酰胺</td><td>TCI</td><td>B3082-25G</td><td></td></tr><tr><td>无MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;的PBS</td><td>Biochrom</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>亚硒酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>TGF&amp;szlig;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>凝血酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7513</td><td></td></tr><tr><td>转铁蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Biorbyt</td><td>orb6014</td><td></td></tr><tr><td>hiPSC</td><td>德国汉堡UKE定制</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>iCell心肌细胞试剂盒</td><td>Cellular Dynamics International</td><td>CMC-100-010-001</td><td></td></tr><tr><td>Pluricyte心肌细胞试剂盒</td><td>Pluriomics</td><td>PCK-1.5</td><td></td></tr><tr><td>Cor.4U - HiPSC心肌细胞试剂盒</td><td>Axiogenesis AG</td><td>Ax-C-HC02-FR3</td><td></td></tr><tr><td>Cellartis心肌细胞</td><td>Takara Bio USA, Inc.</td><td>Y10075</td><td></td></tr></tbody></table>

用于心脏药物安全性筛选的人工心脏组织自动收缩分析

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

心脏组织工程是指构建能够产生三维收缩力的工程化组织的技术。为了在基础研究和临床前药物开发中应用这些技术，建立在标准化条件下自动化生成和分析的方案至关重要。本文介绍了一种从不同物种（大鼠、小鼠、人）心肌细胞生成工程化心肌组织（EHT）的技术。该技术基于在24孔板中，将分散的心肌细胞与纤维蛋白凝胶组装于弹性聚二甲基硅氧烷（PDMS）支柱之间。在浇铸后两周内形成具有三维结构并能产生收缩力的EHT。该方法每周可生成数百个EHT，其技术限制仅取决于心肌细胞的可获得性（每个EHT需0.4–1.0 × 106个细胞）。在一种改良的培养箱中对等长-等张肌肉收缩进行评估，该培养箱配备有用于24孔板的机械锁定装置，并在顶部放置摄像机。软件控制摄像机沿XYZ轴系统依次移动至各个EHT位置。通过自动图像识别算法检测EHT的收缩，收缩力则根据EHT的缩短程度以及PDMS支柱的弹性特性和几何结构进行计算。该方法可在标准化和无菌条件下实现对大量EHT的自动化分析。准确检测药物对心肌细胞收缩功能的影响，对于心脏药物研发和安全性药理学至关重要。我们以hERG通道抑制剂E-4031为例，证明人源EHT系统能够重现药物对人心脏收缩动力学的影响，表明其在心脏药物安全性筛选中具有良好的应用前景。

心脏分化与工程化心肌组织的制备
人诱导多能干细胞（HiPSC）在低生长因子基底膜基质上扩增，用EDTA消化后，在旋转培养瓶中过夜形成拟胚体（EB）。经过三天的中胚层诱导后，使用Wnt抑制剂启动心肌分化。在分化方案进行约17天后，将跳动的拟胚体用II型胶原酶消化为单细胞（图1）。在拟胚体消化后立即取1.0 × 106个新鲜分离的心肌细胞，加入100 µL组织中制备工程化心脏组织（EHT）（图2）。对于冻存细胞（例如 商业供应商提供的细胞），通过将细胞逐滴重悬于培养基中进行解冻，离心后重悬于细胞外基质（ECM）中。在48小时内，可在显微镜下观察到EHT中单个细胞出现自发性搏动。在随后的数天内，心肌细胞沿组织的受力方向纵向伸展、相互连接，形成协调跳动的EHT。通过EHT分析仪器测量PDMS支柱宏观可见的偏转程度。
<p class="jove_ste...

在此，我们展示了由诱导性多能干细胞（hiPSC）衍生的心肌细胞生成人源工程化心肌组织的方法。我们介绍了一种分析收缩力的方法，并以hERG通道抑制剂E-4031引起收缩模式改变的示例进行说明。该方法具有高度的稳健性，适用于心脏药物筛选。

心脏组织工程描述了构建三维力生成型工程化组织的技术。对于这些技术的实施……

该技术的总体目标是生成三维工程化心肌组织，可作为体外收缩分析平台用于药物筛选和疾病建模。该方法有助于回答心血管领域中有关疾病建模、安全性药理学以及基因变异或药物对收缩力影响的关键问题。该技术的主要优势在于，可在无菌条件下长期测量来自不同物种的工程化心肌组织的收缩力。初次使用该方法的科研人员可能会因细胞质量不佳或培养基中缺乏某种成分而遇到困难。重要的是要优化自身的准备工作，并避免反复进行冻融循环。演示本实验操作的将是 Anika Benzin 和 Umber Saleem。开始实验前，向24孔板的每个加样孔中加入1.6毫升温热的2%琼脂糖。立即将聚四氟乙烯间隔片放入琼脂糖中。室温下静置约10分钟后，琼脂糖变为不透明，表明其已凝固。移除间隔物，并将PDMS支架放入铸模中，使每对支架支柱伸入琼脂糖模具内。放置完所有支架后，将心肌细胞悬浮于培养基中，细胞浓度至少为每毫升1.5 × 10⁷个细胞，并加入新鲜配制的含纤维蛋白原的重悬混合液，用移液管轻轻吹打10至15次，直至纤维蛋白原凝块完全溶解。用移液管检查重悬混合液是否均匀。然后，对于每块工程化心肌组织（EHT），在200 µL离心管中将100 µL重构混合液与3 µL凝血酶混合。立即取100 µL该EHT凝血酶混合液分装至琼脂糖槽中。每个EHT均需使用新的滤芯吸头。当所有孔均加入重悬混合液后，盖上细胞培养皿的盖子，并在37摄氏度、7%二氧化碳条件下孵育2小时。孵育结束后，将培养板置于无菌操作台中，向每孔加入200至500微升培养基。轻轻摇动培养板，然后将工程化心脏组织（EHT）放回培养箱中继续培养。10分钟后，小心将支架转移至新的24孔板中，每孔加入1.5毫升EHT培养基，并将该板置于细胞培养箱内，在适当的培养条件下孵育。每周一、三、五更换EHT培养基，方法是将PDMS支架转移至另一含新鲜培养基的孔板中。浇铸后7至10天，EHT应出现自发性收缩，使PDMS支架的支柱发生偏转。为了分析EHT的收缩，在实验当天，应在测量前两小时启动EHT分析仪器中的加热装置。在分析开始前立即接通轴系系统的气体和电子供应。进行基线记录时，将EHT培养板放入EHT分析仪器中，并根据制造商的说明启动收缩分析软件。根据软件使用手册的说明启动新运行，单击“协议”选项卡以输入相关研究信息。打开“设置”选项卡并选择用于分析的孔。由于时间限制，本视频中仅演示两个EHT的情况。然后点击相机视图选项卡，并启动相机的实时模式，启用自动图像检测功能。通过xyz坐标调整24孔板中每个选定孔的相机位置，确保每根EHT均位于窗口中央并处于焦点清晰状态。确认蓝色十字标记位于EHT的顶端和底端，并能随EHT的收缩运动而同步移动。按下“位置确定”按钮以保存每个孔的设定位置。现在点击“参数”选项卡，定义软件识别收缩峰的条件，并以绿色方块标记峰。通过点击“将参数应用于所有孔”按钮保存所有输入的设置。然后点击自动选项卡并按下开始按钮，以记录EHT的基础收缩并计算每个EHT的自发性基础收缩力。实时收缩分析结果将在实时选项卡中显示。请确保蓝色十字仅沿垂直方向移动，以匹配EHT的收缩运动。为了分析某种特定药物对收缩功能的影响，首先将装有无蛋白甲状腺溶液的24孔板转移至无菌操作台中，并将碳电极插入各孔内。将带有PDMS支架的工程化心肌组织（EHT）放置在电极上方，并将EHT放回培养箱中。约半小时后，将EHT置于EHT分析仪器的联锁装置中，记录每块EHT持续20秒的自发性基础收缩力。接下来，将碳电极连接至起搏电缆，并开始对工程化心肌组织（EHT）进行电刺激。每份EHT记录10秒的起搏基线，注意确保所有EHT均被正常起搏。起搏信号现以蓝色垂直线标记，位于每次收缩峰之前的收缩图谱中。基线记录完成后，将电极和PDMS支架转移至含有第一种药物浓度的新24孔板中，并立即将工程化心肌组织（EHT）放回EHT分析仪的联锁装置内，孵育20分钟。重新连接起搏电缆，调整图形识别，记录EHT在第一种药物浓度下的收缩反应。所有药物浓度测试完毕后，保存所有生成的PDF记录文件，并逐一检查每份记录的图形识别情况，以及收缩峰方块位置是否正确、是否存在伪影。对于离线分析，从运行数据库中点击选择相应运行的记录，在参数选项卡中修改收缩分析的参数。然后在离线选项卡中选择离线分析以重新分析视频。调整图像识别并录制新的视频文件。在实时选项卡中调整图像识别并选择样本复查。此时将根据新的位置分析EHT。每个EHT的分析均基于组织顶端和底端的图像识别。随后，通过EHT分析仪器的软件算法自动分析所拍摄的EHT收缩图像，并根据预设的相关标准确定收缩峰值。长期EHT收缩分析测量结果显示，在长达20小时内，收缩力、搏动频率、T1收缩时间及T2舒张时间均未出现明显的时间依赖性变化，表明该类构建物具有较高的稳定性。事实上，每个信号EHT的结果均具有良好的可重复性且变异度较低。然而，暴露于hERG通道阻滞剂会导致T2弛豫时间显著延长，从特定浓度开始出现该效应，并在较高浓度下出现不规则搏动模式。一旦掌握，若操作得当，可在30分钟内制备24个EHT。该技术建立后，为疾病建模领域的研究人员探索基因变异体在体外的作用效果开辟了道路。此模型具有多功能性，可与人诱导性干细胞或基因组编辑技术相结合。通过此操作步骤，可进一步采用组织学或RNA与蛋白质分析等方法，回答有关基因转录和表达的更多问题。观看本视频后，您应已掌握如何制备和分析EHT。若您对此操作流程有任何疑问，请随时直接与我们联系。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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构建定义明确的人源工程化心肌组织以研究心肌细胞治疗机制

来源于人诱导性多能干细胞的自发收缩心肌细胞合胞体是研究人类心脏生理学和药理学的有用模型。本文介绍了一种高通量筛选系统，该系统利用钙敏感性荧光染料和温度可控的成像多孔板读数仪，定量分析外源性化合物对搏动频率的影响。...

在温度控制的384孔板中使用钙敏感荧光染料测量人诱导多能干细胞衍生心肌细胞合胞体的收缩

本文介绍一种易于使用的3D自组装心脏微组织阵列制备方法，该阵列由预先分化的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞组成。这种操作简便且所需细胞量少的心脏微组织制备技术，可用于疾病建模及药物研发的早期阶段。...

利用人iPSC来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞构建三维心脏微组织阵列

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用于临床前心脏风险评估的人诱导多能干细胞衍生心肌细胞结构与收缩变化的杂交细胞分析系统

利用干细胞衍生的心肌细胞生物工程构建的三维心脏组织已成为研究健康与疾病状态下人类心肌的有前景模型 体外...

设计生物反应器以提高工程化心肌组织的数据采集效率与模型通量

本方案介绍了如何使用MyoBLAZER系统测量供体心脏来源的成人原代心肌细胞的收缩力。MyoBLAZER是一种可靠的平台，可用于临床前药物研发阶段评估药物诱导的收缩力变化。...

分离的成年成人原代心肌细胞中心肌收缩力的测量

本方案提供了生成三维工程化心肌和骨骼肌组织的方法，并描述了其在临床前药物筛选中的应用。所述方法利用磁感应系统，可同时平行评估24个组织。...

可扩展的三维工程化肌肉组织中的临床前药物测试

在此，我们展示了一种利用二维人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（hiPSC-CM）单层在柔性基底上培养，并结合基于视频的显微镜技术，用于无创评估心脏医疗设备收缩力的方法。该工具将有助于 体外...

在二维人源干细胞衍生心肌细胞中评估心脏收缩力调节治疗

本文介绍了一种可重复的方法，通过结合熔融电纺写入（MEW）法制备的聚己内酯（PCL）支架、纤维蛋白水凝胶以及人诱导多能干细胞来源的心肌细胞和成纤维细胞，生成三维心肌组织。该技术可精确控制支架结构，适用于临床前药物筛选和心脏疾病建模。...

利用聚己内酯支架的熔融静电纺丝书写技术与人诱导多能干细胞来源的心脏细胞生成三维人心肌组织

了解利用人诱导多能干细胞构建三维工程心脏组织的方法，用于体外收缩分析和药物筛选。该技术可测量收缩力并评估药物对心脏功能的影响，为心脏疾病建模和安全药理学研究提供可靠平台。

用于心脏药物安全性筛选的人工心脏组织自动收缩分析

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