人工程心脏组织的收缩自动分析心脏药物安全筛选

该技术的总体目标是生成三维工程心脏组织，可用作药物筛选和疾病建模的体外收缩分析平台。这种方法可以帮助回答心脏领域中有关疾病建模、安全药理学和基因变异或药物对收缩力影响的关键问题。该技术的主要优点是可以在无菌条件下长时间测量来自不同物种的工程心脏组织中的收缩力。

不熟悉这种方法的科学家可能会为缺乏细胞质量而苦苦挣扎。或者缺少 a in the medium。优化自我准备并避免循环非常重要 演示此程序的将是 Anika Benzin 和 Umber Saleem。

在开始该程序之前，将 1.6 毫升温热的 2% 琼脂糖添加到 24 孔板的急救孔中。并立即将聚四氟乙烯放入垫片中放入琼脂糖中。在室温下放置约 10 分钟后，琼脂糖将变得不透明，表明其凝固。

拆下垫片并将 PDMS 机架放入铸件中，以便成对的机架柱伸入每个琼脂糖模具。放置完所有架子后，我们将心肌细胞悬浮在最低浓度为 1.5 倍 10 至每毫升 7 个细胞的培养基中，并用血清移液管将新鲜制备的溶出纤维蛋白原的重建混合物 10 至 15 倍，直至纤维蛋白原凝块溶解。检查移液器中的复溶混合物的均匀性。

然后，对于每个工程心脏组织 （EHT），将 100 μL 重建混合物与 3 μL 凝血酶混合在 200 μL 试管中。并立即将 100 μL 这种 EHT 凝血酶混合物分装到琼脂糖槽中。为每个 EHT 使用新的过滤器尖端。

一旦所有插槽都装满了重构混合物，盖上细胞培养皿的盖子，并在 37 摄氏度和 7% 的二氧化碳下孵育制剂两个小时。孵育结束时，将板置于无菌罩中，并用 200 至 500 μL 培养基覆盖每个孔。轻轻摇动板，然后将 EHT 放回培养箱中。

10 分钟后，小心地将试板转移到新的24孔板中，每孔含有1.5 mL的EHT培养基，并在适当的培养条件下将板放入细胞培养箱中。每周一、周三和周五，通过将 PDMS 支架转移到装有新鲜培养基的第二个板中，为 EHT 补料。石膏固定后 7 到 10 天，EHT 应表现出自发性收缩，使 PDMS 机架的柱偏转。

为了分析 EHT 的收缩，在实验当天，在测量前 2 小时打开 EHT 分析仪中的加热装置。在分析之前，立即打开轴系统的气体和电子电源。对于基线记录，将 EHT 板放入 EHT 分析仪器中，并根据制造商的说明启动收缩分析软件。

使用软件手册说明开始新的运行，单击实验步骤选项卡以输入相关研究信息。打开 set up （设置） 选项卡并选择要分析的井。由于时间限制，本视频中仅对两个 EHT 进行了演示。

然后单击 camera view 选项卡并使用自动人物检测模式启动相机实时模式。使用 24 孔培养皿中每个选定孔的 xyz 坐标调整相机位置，注意每个 EHT 都位于窗口中心并聚焦。确保蓝色叉位于 EHT 的顶端和底端，并移动以匹配 EHT 的收缩。

并按下 position okay 按钮保存每个孔的设置位置。现在单击参数选项卡以定义软件识别收缩峰值的标准，并用绿色方块标记峰值。通过按下 Use parameters on all wells 按钮保存所有输入的设置。

然后单击自动选项卡和开始按钮以记录基线 EHT 收缩并计算每个 EHT 的自发基线收缩。实时收缩分析将显示在实时选项卡中。确保蓝色十字仅垂直移动以匹配 EHT 的收缩。

为了分析感兴趣的特定药物对收缩的影响，首先在无菌罩下转移一个装满无蛋白甲状腺溶液的 24 孔板，并将碳电极放入孔中。将 EHT 转移到电极顶部的 PDMS 架中，然后将 EHT 放回培养箱中。大约半小时后，将 EHT 放入 EHT 分析仪器的联锁装置中，并记录每个 EHT 20 秒的自发基线收缩力。

接下来，将碳电极连接到起搏电缆并开始电刺激 EHT。每个 EHT 记录 10 秒的起搏基线，注意所有 EHT 的节奏都正确。起搏信号现在由蓝色垂直线标记，包含在每个峰值之前的收缩移植物中。

基线记录后，将电极和 PDMS 支架转移到包含第一个药物浓度的新 24 孔板中，并立即将 EHT 放回 EHT 分析仪器的联锁处进行 20 分钟的孵育。重新连接起搏电缆，调整图形识别并记录响应第一种药物浓度的 EHT 收缩。测试完所有药物浓度后，保存所有生成的 PDF 记录，并检查每个记录是否能识别图形以及收缩峰方格和伪影的正确定位。

对于离线分析，请单击 runs 数据库中相应运行的 select run，然后在参数选项卡中更改收缩分析的参数。然后在 offline （离线） 选项卡中，选择 offline analysis （离线分析） 以重新分析视频。调整图形识别并录制新的视频文件。

在 real time 选项卡中调整图形识别，然后选择 sample review。现在将根据新位置分析 EHT。每个 EHT 的分析基于组织顶部和底端的图形识别。

然后，EHT 分析仪器软件算法自动分析薄膜化的 EHT 收缩，并根据相关的预定义标准确定峰值。EHT 收缩分析的长期测量表明，在长达 20 小时内，收缩力、跳动频率、T1 收缩或 T2 弛豫时间没有明显的时间依赖性变化。表明结构的高度稳定性。

事实上，每个信号 EHT 的结果都是可再现的，变异性很低。然而，暴露于 hERG 通道阻滞剂会导致 T2 弛豫时间显着延长，从浓度开始。以及较高浓度下的不规则跳动模式。

一旦掌握，如果准备得当，可以在 24 分钟内生成 30 个 EHT。开发后，这项技术为疾病建模领域的研究人员探索基因变异在体外的影响铺平了道路。该模型的多功能性使其能够与人类诱导干细胞或基因组编辑技术相结合。

在此程序之后，可以使用其他方法（如组织学或 RNA 和蛋白质分析）来回答有关基因转录和表达的其他问题。看完这个视频后，你应该对如何投射和分析 EHT 有一个很好的了解。如果您对此程序有任何疑问，请随时直接与我们联系。