Name: 超高分子量基因组DNA的分离纯化白粉病对长读测序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 学习从白粉病单倍体分生孢子中分离纯化超高分子量基因组DNA的方法，用于长读长测序。该技术解决了专性活体营养型真菌病原体DNA提取难题，为研究复杂真菌基因组结构和植物-病原体互作机制提供可靠方案。

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本方案的制定得到了美国联合基因组研究所-社区测序项目（#1657）的支持。部分工作由Philomathia基金会、美国国家科学基金会（#0929226）以及能源生物科学研究所对S. Somerville的资助支持；B. Keller的研究由瑞士国家科学基金会（#310030_163260）资助。我们衷心感谢我们的同事M. Figureroa和M. Miller（明尼苏达大学）、R. Panstruga（亚琛工业大学）、C. Pedersen（哥本哈根大学）、P. Spanu（帝国理工学院）、J. Taneja（加州大学伯克利分校）、M. Wildermuth（加州大学伯克利分校）、R. Wise（爱荷华州立大学）和S. Xiao（马里兰大学）在本方案开发过程中提供的宝贵建议，并感谢他们慷慨分享各自的实验方案。

1. 真菌材料的制备
<ol>
	<li>白粉菌的培养
	<ol>
		<li>在生长室中培养植物，条件如下：白天温度 22 °C，夜间温度 20 °C，相对湿度 80%，光照周期 14 小时，光照强度为 125 µE/m2/s（由荧光灯提供）。</li>
		<li>按照文献18,29所述方法，用白粉菌菌株 Golovinomyces cichoracearum UCSC1 侵染黄瓜植株（Cucumis sativa 品种 Bush Champion）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>白粉菌分生孢子的收集
	<ol>
		<li>在接种后 7–10 天，使用带有在线滤膜（孔径 11 µm）的小型真空泵从感病植株上收集分生孢子，孢子将积聚在滤膜上。轻轻施加压力，将真空泵吸头沿叶片表面移动以收集分生孢子。 
		注意：在严重感染、面积约 130 cm2 的黄瓜叶片上，G. cichoracearum 分生孢子的平均产量为 20 mg。</li>
		<li>将滤膜上约 150 mg 的分生孢子（体积约为 375 µL，相当于 7–8 片感病黄瓜叶片的孢子量）刷至一张洁净纸上，随后转移至含有两个直径为 5/32 英寸的预冷（液氮中预冷）钢珠的 2 mL 冻存管中。立即将冻存管放回液氮中，并于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过球磨法破碎分生孢子
	<ol>
		<li>将球磨仪的铝制板在液氮中快速冷冻。将冻存管装入球磨仪的支架中，在室温下以每秒 30 个循环的频率剧烈震荡 30 秒，使分生孢子与钢珠充分研磨。震荡结束后立即在液氮中重新冷冻冻存管。 
		注意：初始阶段可通过显微镜在 100 倍放大下观察样品，以评估研磨过程中细胞壁破裂的效率。如有需要，可额外进行 1–2 轮、每轮 30 秒、每秒 30 个循环的研磨，但应尽量减少研磨次数。一旦确定最佳研磨条件，此步骤常规无需再通过显微镜评估分生孢子的破碎情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 基因组DNA纯化
<ol>
	<li>分生孢子裂解
	<ol>
		<li>操作需迅速以避免分生孢子解冻，使用磁铁将钢珠从冻存管中取出。加入 700 µL 65 °C 的裂解缓冲液（表 1），涡旋 5–10 秒，直至形成悬浊液。</li>
		<li>加入 300 µL 预热（65 °C）的 5%（v/v）月桂酰肌氨酸钠溶液，轻轻倒置混匀（每 3 秒倒置一次），共 5 次。于 65 °C 孵育 30 分钟；在 10、20 和 30 分钟时各轻轻倒置混匀 3 次。使用宽口移液吸头将全部溶液转移至新的 2 mL 微量离心管中。后续所有步骤中，均通过轻柔缓慢倒置混匀，并使用宽口移液吸头转移含 DNA 的溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA 提取 I
	<ol>
		<li>向裂解液中加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1 v/v），轻轻倒置混匀 5 次。室温孵育 10 分钟，在孵育中途和结束时分别再次轻轻倒置混匀 5 次。室温下以 14,000 × g 离心 15 分钟。使用宽口移液吸头小心将水相转移至新的 2 mL 微量离心管中；避免吸取界面层物质。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA 沉淀 I
	<ol>
		<li>加入等体积室温的 100% 异丙醇（约 750 μL），轻轻倒置混匀 6 次。室温下以 14,000 × g 离心 15 分钟。小心吸除上清并弃去。</li>
		<li>加入 450 μL 预冷（-20 °C）的 70% 乙醇。室温下以 14,000 × g 离心 5 分钟。小心吸除上清并弃去。以 1,000 × g 离心 3 秒，用细口移液吸头小心吸除残留上清并弃去。室温下空气干燥沉淀 15 分钟。干燥时间不得超过 15 分钟。</li>
		<li>将沉淀重悬于 300 µL TE 缓冲液（10 mM Tris-Cl，1 mM 乙二胺四乙酸，pH 8.0）中。4 °C 过夜孵育。轻轻弹动以溶解未完全溶解的残留物质。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为去除 RNA 污染，加入 10 µL RNase A（10 mg/mL）。轻轻倒置混匀 3 次。以 1,000 × g 离心 3 秒。37 °C 孵育 2 小时。</li>
	<li>DNA 提取 II
	<ol>
		<li>加入 300 µL 苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1 v/v），轻轻倒置混匀 5 次。室温孵育 10 分钟，在孵育中途和结束时分别再次轻轻倒置混匀 5 次。室温下以 14,000 × g 离心 15 分钟。使用宽口移液吸头将上清转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA 沉淀 II
	<ol>
		<li>加入 0.01 体积的 3 M 醋酸钠（pH 5.2）（约 3 µL），轻轻倒置混匀 5 次。加入 2.5 体积预冷（-20 °C）的 100% 乙醇（约 750 μL）。轻轻倒置混匀 5 次。-20 °C 过夜孵育。</li>
		<li>4 °C 下以 14,000 × g 离心 30 分钟。小心吸除上清并弃去。</li>
		<li>加入 450 µL 预冷（-20 °C）的 70% 乙醇。4 °C 下以 14,000 × g 离心 5 分钟。小心吸除上清并弃去。以 1,000 × g 离心 3 秒。用细口移液吸头小心吸除残留上清并弃去。</li>
		<li>室温下空气干燥沉淀 30–60 分钟。将沉淀重悬于 27.5 µL TE 缓冲液中。4 °C 过夜孵育。轻轻弹动以溶解未完全溶解的残留物质。</li>
		<li>取 2.5 µL 样品加入 22.5 µL TE 中（终体积 25 μL），用于质量控制检测（见下文）。DNA 样品在送测前可暂存于 4 °C。如需长期保存，应置于 -80 °C 冻存，并尽量减少冻融循环以防止 DNA 断裂。 
		注意：此步骤移液时需格外小心，因高分子量基因组 DNA 较难准确移取，确保 &#34;QC Aliquot&#34; 能准确代表基因组 DNA 样品。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 质量控制
<ol>
	<li>样品纯度
	<ol>
		<li>使用TE空白对照，在微量分光光度计上加载1 µL质控分装样品，检测DNA的样品纯度。记录A260/A280和A260/A230读数。纯DNA的A260/A280比值约为1.8，A260/A230比值介于1.8至2.2之间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基因组DNA定量
	<ol>
		<li>根据制造商说明书，使用商用双链DNA定量检测试剂盒对质控分装样品进行定量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA质量评估I
	<ol>
		<li>在1x TAE缓冲液（40 mM Tris，20 mM乙酸，1 mM EDTA，pH 8.0）中，将约60 ng基因组DNA和DNA分子量标记物加样至0.7%琼脂糖凝胶。以70 V电压电泳运行40–45分钟，直至基因组DNA条带距离加样孔约2 cm，且DNA分子量标记物的条带分离清晰可见。根据所用凝胶电泳设备的具体情况，可能需要调整上述条件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA质量评估II
	<ol>
		<li>在0.5x TBE缓冲液（44.5 mM Tris，44.5 mM硼酸，1 mM EDTA，pH 8.3）中，将约60 ng基因组DNA和一种适用于脉冲场凝胶电泳的高分子量DNA分子量标记物加样至1%琼脂糖凝胶，并在0.5x TBE电泳缓冲液中采用5–80 kbp波形的脉冲场凝胶电泳程序运行16小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细菌、真菌及植物污染物检测
	<ol>
		<li>采用聚合酶链式反应（PCR）扩增核糖体基因相应的内转录间隔区（ITS）区域，引物及扩增条件见表2。将10 µL扩增产物上样至凝胶。 
		注：使用真菌ITS引物应扩增出代表白粉菌ITS区域的条带。应对该扩增产物以及使用细菌或植物引物获得的任何扩增产物进行测序，以确定污染来源。在真菌扩增产物中仅应检测到白粉菌ITS序列。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了从专性活体营养型白粉菌中获得高纯度、高分子量的基因组DNA，我们开发了一种对先前所述方法的改进版本30。采用该优化方案的平均得率为每150 mg分生孢子可获得7 µg DNA，是此前方案得率的两倍。此外，DNA片段平均长度从约20 kbp提高至超过48.5 kbp。该方案在黄瓜-G. cichoracearum体系中进行了优化。若要在其他白粉菌或专性活体营养型真菌中获得最佳质量和最高纯度的DNA，可能需要对该方案进行进一步调整。未来，该方案或可用于从其他专性活体营养型真菌中获取适用于长读长DNA测序的高分子量DNA，但可能需要进一步优化。
在优化本方案的过程中，如何平衡高DNA得率与提取DNA的高分子量是一个关注重点。为尽量减少DNA剪切，已去除包括涡旋在内的多个步骤，并改用轻柔颠倒混匀的方式。这一改变在未显著降低DNA得率的前提下，提高了提取DNA的质量。此外，在细胞裂解步骤开始时即移除钢珠，与将钢珠保留在溶液中直至裂解结束相比，可显著提高DNA得率。
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白粉菌是一类专性活体营养型真菌植物病原体，综合来看，它们是全球范围内造成植物病害的最主要原因1。目前已描述的白粉菌物种超过900种，在分类学上归属于白粉菌科（Erisyphaceae）中的五个族2。由于其重要的经济影响以及与寄主植物之间形成的密切互作关系，白粉菌病害已受到长达&#62;100年的持续研究。在侵染过程中，白粉菌会引发寄主细胞结构、代谢过程和分子生物学层面的显著变化，从而有利于该病原菌的生存与繁殖。然而，由于其专性寄生的生活方式，对白粉菌的研究面临特殊挑战，目前尚未实现该类真菌的纯培养生长3,4,5,6,7,8。此外，尽管已有部分物种实现了瞬时转化，但稳定、可靠的白粉菌遗传转化体系至今仍未建立9,10。
白粉菌基因组的测序与组装一直面临困难，这主要源于其基因组本身的若干特征。与其他真菌基因组相比，白粉菌基因组较大（120 - 180 Mbp），并含有60 - 90%均匀分布的重复元件11这些元件包括非长末端重复序列以及未分类的重复元件。两个 专化型 一种白粉菌物种的 禾谷布氏霉 小种 禾谷类 和专化型 tritici (Bgh 和 Bgt, 分别) 以及葡萄白粉病 Erysiphe necator 已完成测序，并已获得其他多个物种的草图基因组12,13,14基因组的重复性质使得组装困难，且已完成的 Bgh 基因组被组装成6,989条超级contig，其L50为2 Mb12.
尽管基因组较大，白粉菌的蛋白质编码基因数量却较少，分别预测出 Bgh 和 Bgt 含有 5,845 和 6,540 个基因。测序的白粉菌似乎还缺少至少 99 个在其他真菌中至关重要的核心基因，这与其依赖寄主植物生存的特性一致11,12,13,14。
靠近端粒、着丝粒、核糖体RNA基因阵列以及富含可移动元件区域的重复序列，难以通过短读长测序策略进行有效组装，因此在基因组组装中常常被低估15。这些区域被认为是基因组序列中许多缺口形成的主要原因，这一点在具有大量重复元件扩增的白粉菌中尤为突出16。高度可变的基因组区域通常位于此类重复序列区域中3。这些区域是染色体结构重排的发生位点，且常编码处于强烈选择压力下的基因，例如编码效应蛋白的基因以及编码次级代谢酶的基因。单分子长读长测序技术的进步为跨越基因组中重复区域的测序提供了潜在解决方案15。例如，Faino et al.（2015）发现，结合使用长读长测序技术和光学图谱技术，能够成功获得植物病原真菌Verticillium dahlia两个菌株的无缺口基因组序列，使基因组中重复DNA序列的比例提高了三倍，增加了基因注释的数量（同时减少了部分或缺失的基因注释），并揭示了基因组的重排现象17。
为了使用这些长读长测序技术，需要高浓度、高质量的基因组DNA，其最小长度需超过&#62; 20 kbp。本文介绍了我们针对在黄瓜上生长的白粉菌物种Golovinomyces cichoracearum进行分生孢子收集、从分生孢子中提取高分子量DNA以及质量控制评估的方法18。本实验方案基于瑞士苏黎世大学B. Keller实验室团队开发的方案13,19，并进行了多项改进，显著提高了DNA得率，并增加了长度超过&#62;48.5 kbp的DNA比例。此外，本方案还纳入了美国能源部联合基因组研究所推荐的质量控制步骤20,21,22。
裂解缓冲液中每种试剂的功能以及每一步纯化步骤的原理均如Henry（2008）所述23。在本方案的设计过程中，还参考了已发表的从植物和微生物组织中分离高分子量基因组DNA的可用方案24,25,26,27,28。

<table><tbody><tr><td>MM400 球磨仪</td><td>Retsch</td><td>20.745.0001</td><td>或同等性能的球磨仪</td></tr><tr><td>用于球磨的 2 mL 管</td><td>Sarstedt&amp;nbsp;</td><td>72.694.007</td><td></td></tr><tr><td>5/32&quot; 不锈钢研磨珠</td><td>OPS Diagnostics</td><td>GBSS 165-5000-01</td><td></td></tr><tr><td>微处理器控制的 280 系列水浴锅，预设温度为 65 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2825</td><td>或同等性能的水浴锅</td></tr><tr><td>微处理器控制的 280 系列水浴锅，预设温度为 37 &amp;deg;C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2825</td><td>或同等性能的水浴锅</td></tr><tr><td>Eppendorf 5417R 冷冻微量离心机</td><td>Krakeler Scientific&amp;nbsp;</td><td>38-022621807</td><td>或同等性能的微量离心机</td></tr><tr><td>氯仿:IAA (24:1 v/v)</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C0549</td><td>接触皮肤或吸入时具有危害性。操作时需佩戴腈类手套、防护眼镜、实验服，并在通风橱内进行</td></tr><tr><td>苯酚:氯仿:IAA&lt;br /&gt; (25:24:1 v/v)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15593031</td><td>接触皮肤或吸入时具有危害性。操作时需佩戴腈类手套、防护眼镜、实验服，并在通风橱内进行</td></tr><tr><td>100% 异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>34923</td><td>使用前需预冷至 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>RNase，无 DNase 污染（10 mg/mL）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>偏重亚硫酸钾</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P2522</td><td></td></tr><tr><td>月桂酰基肌氨酸钠</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H6269</td><td></td></tr><tr><td>Uvex by Honeywell Futura Goggles S345C，Uvextreme</td><td>Staples</td><td>423263</td><td>或同等性能的护目镜</td></tr><tr><td>High Five COBALT 腈类手套，大号</td><td>Neta Scientific</td><td>HFG-N193</td><td>或同等性能的手套</td></tr><tr><td>GelRed 核酸凝胶染料，水溶液，10,000 倍稀释</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭 10 mg/mL</td><td>Biotium</td><td>40042</td><td>接触皮肤时具有危害性。操作时需佩戴腈类手套和防护眼镜</td></tr><tr><td>超纯琼脂糖，生物试剂级</td><td>VWR International LLC</td><td>JT4063</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Marker</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FERSM1332</td><td></td></tr><tr><td>8 - 48 kb CHEF DNA 分子量标准</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3707</td><td></td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>4472172</td><td>或同等性能的脉冲场凝胶电泳装置</td></tr><tr><td>Whatman 定性滤纸，1 号</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>WHA1001042</td><td>或同等性能的生长培养箱</td></tr><tr><td>Percival 生长培养箱</td><td>Percival</td><td>AR66LXC9</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 8000 紫外-可见分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td><td>或同等性能的分光光度计</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA 定量检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P11496</td><td></td></tr><tr><td>TAE 缓冲液（Tris-乙酸-EDTA）（50x）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B49</td><td>使用前用水稀释 50 倍（至 1x）</td></tr><tr><td>TE 缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12090015&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris-硼酸-EDTA，10x 溶液（电泳用）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP13334</td><td>使用前用水稀释 10 倍（至 1x）</td></tr><tr><td>液氮</td><td></td><td></td><td>液氮（-196 &amp;deg;C）具有冷冻危险性。升温时会迅速膨胀，切勿密封于密闭容器中</td></tr></tbody></table>

用于长读长测序的白粉菌高分子量基因组dna纯化

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

白粉菌是一类具有重要经济意义的真菌性植物病原体。由于缺乏完善的遗传学和基因组学资源，目前对这类病原体的分子生物学和遗传学了解相对较少。这些生物体具有庞大且富含重复序列的基因组，使得基因组测序和组装极为困难。本文介绍了一种从白粉菌物种Golovinomyces cichoracearum中获取高分子量基因组DNA的收集、提取、纯化及质量控制评估方法。该方案包括通过机械破碎孢子，随后采用优化的酚/氯仿法提取基因组DNA。通常每150 mg分生孢子可获得约7 µg DNA。利用本方法提取的基因组DNA适用于长读长测序（即，&#62; 48.5 kbp）。本方法还描述了用于评估基因组DNA大小、得率和纯度的质量控制措施。对本文所述质量水平的基因组DNA进行测序，将有助于多个白粉菌基因组的组装与比较，进而加深对该类农业病原菌的理解并提升其防控水平。

60纳克纯化基因组DNA的代表性示例 G. cichoracearum 使用凝胶电泳和脉冲场凝胶电泳在琼脂糖凝胶上进行电泳的结果如图所示 图1 和 2分别. 通过、勉强通过和未通过质量控制的基因组DNA样品示例如下所示。完全通过质量控制的基因组DNA样品适用于长读长基因组测序方法。勉强通过质量控制的样品可被接受，但优先选择完全通过质量控制的样品。未通过质量控制的样品不适用于长读长基因组测序方法。
<img alt="显示DNA分离的电泳凝胶结果；泳道标记为1-4，表示样品的迁移情况。" src="/files/ftp_upload/55463/55463fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：纯化基因组DNA的琼脂糖...

本文介绍了一种从专性活体营养型真菌病原体白粉菌中提取、纯化基因组DNA并进行质量控制的方法，适用于长读长基因组测序。

用于长读长测序的白粉菌高分子量基因组DNA纯化

白粉菌是一类具有重要经济意义的真菌性植物病原体。目前对其分子生物学和遗传学方面的了解仍相对有限……

本实验方案的总体目标是从白粉菌单倍体分生孢子中分离高分子量的基因组DNA，用于长读长基因组测序。该方法可解答植物病原真菌生物学领域中的一些关键问题，例如难以研究的基因组结构与组成。该技术的主要优势在于，能够从难以操作的病原体中提取高质量的基因组DNA。实验开始时，使用磁铁快速从分生孢子冻存管中取出钢珠。加入 700 微升 65 摄氏度的裂解缓冲液，涡旋震荡溶液 5 到 10 秒。5 到 10 秒后，形成浆液状混合物。加入 300 µL 预热至 65 度的 5%（体积比）Sarkosyl 溶液，轻轻颠倒混匀五次。在 65 °C 下孵育试管 30 分钟。使用宽口吸头，将全部溶液转移至新的 2 mL 微离心管中。向裂解液中加入等体积的氯仿-异戊醇，轻轻倒置离心管混匀5次。室温孵育10分钟。在孵育至一半时间时，轻轻倒置离心管混匀5次，在孵育结束时再重复一次。接下来，离心并在室温下静置15分钟。使用宽口吸头，小心地将水相转移至新的2毫升微量离心管中，避免转移界面处的物质。加入750 µL室温的100%异丙醇，并轻轻翻转管子6次。然后在室温下离心混合物15分钟。小心移除上清液并弃去。加入450 µL预冷的70%乙醇。将混合物在室温下离心5分钟。小心移去上清液并弃去。在1000 ×g 条件下离心3秒。用细尖移液器小心吸去上清液，并弃去。将沉淀在室温下风干15分钟。加入300微升TE缓冲液重悬沉淀。将DNA在4摄氏度孵育过夜。第二天早晨，轻轻弹击管壁以重悬未完全溶解的DNA。为去除RNA污染，加入10 µL RNase。轻轻颠倒离心管三次，并在1000 ×g下离心DNA 3秒。然后在37摄氏度下孵育DNA两小时。加入300微升苯酚-氯仿-异戊醇，轻轻颠倒混匀五次，于室温孵育DNA 10分钟。在孵育中途和结束时，再次轻轻颠倒离心管混匀五次。接下来在室温下离心15分钟。使用宽口吸头将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中。加入3微升3摩尔的乙酸钠（pH 5.2），然后轻轻翻转管子5次。加入750微升预冷的100%乙醇，轻轻翻转离心管5次。在20摄氏度下孵育混合物过夜。次日上午，在4摄氏度下离心30分钟。小心移除并弃去上清液。加入450微升预冷的70%乙醇。然后在4摄氏度下离心5分钟。离心沉淀DNA后，小心移除上清液。将离心管再次以1000 × g离心3秒，使残留的上清液沉降至管底。用细尖移液器吸除残留的上清液。将沉淀在室温下风干30至60分钟。风干后，加入27.5 µL TE缓冲液重悬沉淀。次日，轻轻翻转以重悬未完全溶解的残留物质。取2.5 µL样品加入22.5 µL TE缓冲液中，用于质量控制检测。将DNA样本在4°C下保存，直至送样进行测序。如需长期保存，应将样本存于-80°C，并尽量减少冻融循环，以防止DNA剪切。根据该方案，使用纯化的基因组DNA进行凝胶电泳检测，结果显示：合格样本呈现一条清晰且位于20 kbp以上的单一条带，无明显拖尾；边缘合格样本呈现一条位于20 kbp以上的单一条带，但略有拖尾；不合格样本则显示在20 kbp以下出现明显拖尾，并含有约100 bp的片段。脉冲场凝胶电泳（PFGE）用于区分高质量 DNA 样本与边缘质量 DNA 样本，前者大部分 DNA 片段大于 48.5 kbp，后者大部分 DNA 片段在 20 至 48.5 kbp 之间。完成该步骤后，可进一步采用单分子长读长测序等其他方法，以深入探究白粉菌基因组的相关问题。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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用于长读长测序的白粉菌高分子量基因组DNA纯化

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