活体肺树突状细胞成像的精密小鼠肺切片制备

本方法的总体目标是利用精密切割的肺组织切片（PCLS）来观察肺内多种免疫细胞类型的定位与迁移过程。该方法有助于解答免疫学领域中的关键问题，例如免疫细胞在肺内的定位及其迁移模式。该技术的主要优势在于，可在保持肺组织三维结构的活体离体组织中，同时观察多种细胞间的相互作用。

尽管该方法可用于研究炎症过程中免疫细胞的定位与迁移，也可用于观察气道和平滑肌组织的收缩。采集肺组织时，首先用剪刀从6至12周龄小鼠腹部中线处向上剪开皮肤和腹膜至下颌，并将肠管移至腹腔一侧。剪开下腔静脉以使血液从肺部排出，再用剪刀尖端刺破膈肌，使胸腔得以扩张。

接下来，使用镊子手动将唾液腺和其他组织从气管上分离，并用精细镊子在最厚软骨环前端的气管前侧做一切口，切口大小以刚好允许20号针头穿入为宜。然后将一根1.5英寸长的20号针头套入一段聚乙烯导管，并将导管末端以约45度角斜向剪切。将针头连接至1毫升注射器，并从40°C的2%低熔点琼脂糖溶液中抽取0.8毫升至注射器内。

当所有琼脂糖完全注入后，将导管的斜面端插入切口，缓慢将琼脂糖注入肺部。在不移动针头或注射器的情况下，用胶带将注射器固定在聚苯乙烯底座上，以确保针头稳定地位于气管内，并将动物置于4°C环境中保存至少10分钟。待琼脂糖完全凝固后，使用剪刀小心切除肺组织，并将其置于含有冰冻PBS的3厘米培养皿中。

然后将肺叶转向以进行组织切片，使与气管相连的肺内侧朝下。切片肺组织时，首先在金属注射器推杆上滴一滴万能防流胶水，以环形方式将胶水均匀涂抹。待胶水完全涂抹后，立即用镊子轻轻夹住已切除肺叶的气管面（朝下），并将肺叶在纸巾上轻蘸以去除多余液体。

将干燥的肺叶小心地放置在柱塞顶部，并修剪掉超出柱塞边缘的多余组织。向下移动柱塞，使金属注射器的筒壁向上移动并覆盖组织，形成一个以肺组织位于注射器筒底部的井状结构，深度不超过几厘米。用胶带缠绕注射器底部，以固定柱塞位置。

然后小心地将40摄氏度的2%低熔点琼脂糖倒入注射器中，使其刚好覆盖脑叶顶部，并用冰冷的冷却块包围金属注射器。一到两分钟后，将装有样品的注射器放入自动切片机中，并校准新刀片。接着，用冰冷的PBS填充缓冲槽。

将步进电机驱动器与样本注射器对齐，并移除胶带。将开关拨至快进位置，直到步进电机驱动器刚好接触柱塞的后端。在切片机上设置组织厚度、连续单片、振荡模式和速度参数。

然后按下启动按钮，使用薄刮铲收集落入缓冲罐中的每一片PCLS，并将切片放入含有冰上预冷PBS的24孔板的各个孔中。对于静态PCLS成像，将包含目标解剖区域的肺组织样本转移至各含1毫升相应抗体混合液的3厘米培养皿中。在冰上避光、振荡孵育30至60分钟后，用1毫升冰上预冷PBS洗涤切片两次。

接下来，每个样本加入 50 µL PBS 至一个新的 3 cm 圆形玻璃底培养皿中，并迅速将组织切片转移至液滴中，轻轻操作使组织片平铺展开。然后用移液器吸除 PBS，在载玻片上滴加一滴室温封片剂，随后加盖盖玻片。为成像组织，将培养皿置于共聚焦显微镜载物台上，使用 20 倍物镜，利用平铺成像工具在凸包设置下定位并标记组织边缘，以减少平铺扫描所需时间。

然后设置z轴扫描范围，注意在切片的多个区域（特别是边缘区域）确认所设范围是否合适。对于活细胞成像，在含有目标抗体混合物的条件下孵育30分钟后，用1毫升冷的Leibovitz 10溶液将切片洗涤两次。接着，每份样本向玻璃底培养皿的一个孔中加入50微升新鲜Leibovitz 10培养基，随后立即将每张PCLS转移至培养基中，并轻轻操作组织，使其完全展平。

然后使用移液器吸出每个腔室中的培养基，并用铂金重物固定每个PCLS。小心地将新配制的冰冷新鲜细胞外基质滴加到每个PCLS上，注意将凝胶置于肺组织切片上方，防止切片漂浮在凝胶表面。在37摄氏度下孵育5分钟后，将载玻片转移至预热的共聚焦显微镜腔室中，在20倍物镜下维持37摄氏度进行观察。

然后，根据帧之间的理想间距设置z轴层叠（z-stack）和拼图（tile）范围，使用拼图工具标记组织中的目标区域，并采用居中网格设置将样本置于视野中央。CD11b高表达的传统树突状细胞定位于肺实质，而CD103阳性的传统树突状细胞主要分布在气道周围及胸膜下区域。通过CD88与CD172a的共染色，可将CD172a阴性、CD88阳性的肺泡巨噬细胞与CD172a阳性、CD88阳性的间质巨噬细胞区分开来，后者主要位于肺实质，而非上皮下区域。

对CD90.2（一种已知的T细胞标记物）和TdTomato荧光蛋白（一种在调控淋巴管生成的关键转录因子调控下表达的转基因）进行共标记，有助于识别肺组织中的淋巴管结构。CD103阳性的传统树突状细胞存在于多个解剖区域，包括表达CD324的气道上皮、淋巴管以及胸膜下区域。正如刚刚所展示的，可通过活细胞成像技术记录细胞运动及细胞间的相互作用。

例如，在代表性实验中，口服卵清蛋白-LPS处理16小时后，可在连续四小时内清晰观察到CD103阳性树突状细胞与过继转移的卵清蛋白特异性T细胞之间的相互作用。一旦掌握，若操作得当，组织制备和切片技术可在两个半小时内完成。在进行该操作时，需注意确保琼脂糖充分灌注肺组织，并在后续成像过程中尽量保持肺切片平整，以获得高质量图像。

完成此操作后，还可采用其他方法，例如用乙酰胆碱或甲胆碱处理PCLS，以探究在不同疾病状态下钙信号传导和气道收缩功能的相关问题。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备精密切割的肺组织切片，以观察肺内免疫细胞的定位、迁移及相互作用。