利用pHluorin标记的受体监视亚细胞定位和贩运

这种荧光成像方法的总体目标是监测膜蛋白运输和细胞内分布的变化。该方法提供了对蛋白质运输变化的见解，例如基因突变或药物对囊泡递送速率和细胞表面蛋白质表达的影响。该技术的主要优点是可以快速、高分辨率、实时地进行测量，而不会破坏样品。

成像前 48 小时，用含有 SEP 的质粒构建体转染小鼠神经母细胞瘤 2A 细胞，SEP 是一种掺入目标蛋白质细胞外区域的 pH 敏感荧光团。当转染的细胞准备好进行成像时，使用全内反射荧光或 TIRF 显微镜，向细胞中加入 2 毫升 pH 7.4 细胞外溶液或 ECS。将细胞培养皿放在翻译台上，并使用载物台支架将培养皿固定到位。

在落射荧光模式下，聚焦显微镜并定位荧光转染的细胞。细胞将保持聚焦在多个聚焦平面上。找到单个分离的细胞以继续进行 TIRF。

在成像程序中，将曝光时间设置为 200 毫秒，并通过设置 EM 增益来优化荧光强度。通过使用步进电机逐步将光束平移穿过物镜，将激光束转换为 TIRF。当临界角接近时，光束将在碟形天线的边缘明显平移，直到它在样品平面上的全内反射点会聚，此时光束沿着碟形天线的边缘不再可见。

通过调整聚焦旋钮验证细胞是否处于 TIRF 模式。在 TIRF 中，只能聚焦一个细胞平面，从而产生具有高分辨率质膜的高度清晰的图像。要开始此过程，请在成像平面中找到健康的转染单细胞。

在 pH 7.4 下获取细胞的聚焦图像。质膜和内质网上 SEP 标记的受体应该是可见的。快速阻挡激光束到达样品，防止光漂白。

使用能够记录多个 XY 位置的显微镜成像软件来记录对应于每个细胞的载物台位置。通过这种方式，捕获每个培养皿 20 到 30 个细胞的图像，同时使用软件记录每个细胞的位置。收集 pH 值为 7.4 的所有细胞图像后，通过移液手动去除 pH 7.4 ECS，无需接触培养皿。

小心地向培养皿中加入 2 毫升 pH 值为 5.4 的 ECS，等待 10 分钟。在此期间，保存以前采集的图像。在用于在 pH 7.4 下收集图像的相同条件下，将载物台移动到每个保存的位置，并在 pH 5.4 下获取同一细胞的图像。

细胞看起来应该不太清晰，因为所有检测到的荧光都来自内质网限制的 SEP 标记受体。保存 pH 5.4 细胞图像。要对单个囊泡插入进行成像，首先用 2 mL pH 7.4 ECS 替换转染细胞的生长培养基。

接下来，将转染细胞培养皿放在显微镜载物台上，并使用载物台支架将培养皿固定到位。如前所述，将单个细胞聚焦在 TIRF 中。如果配备，请设置自动对焦，以便对焦在成像期间不会漂移。

以 200 毫秒的帧速率连续录制一系列 1， 000 帧捕获图像。在此期间，将可见荧光爆发，对应于低 pH 值运输囊泡与质膜融合，使 SEP 暴露于细胞外 pH 值为 7.4。要开始分析 SEP 荧光以确定亚细胞定位，请使用图像分析软件（如 ImageJ）打开细胞图像。

使用滚球设置从 pH 5.4 和 pH 7.4 图像中减去背景。使用基于强度的阈值定量 pH 值为 7.4 的单个细胞的荧光，首先选择图像、调整和阈值。然后手动选择单元格周围感兴趣的区域。

使用 analyze 选项卡下的内置测量函数，测量细胞面积、平均强度和积分密度。在 pH 值为 5.4 的同一样品池中重复这些测量。在 pH 7.4 和 5.4 下获得细胞图像的积分密度后，通过从 pH 7.4 值中减去 pH 5.4 值来计算质膜积分密度。

差异对应于 TIRF 激发区内质膜上受体的相对数量。作为运输的量度，通过将质膜整合密度除以 pH 7.4 下的总整合密度乘以 100，计算位于质膜上的 SEP 标记受体与 TIRF 激发体积中可见的剩余受体相比的相对百分比。要分析单个囊泡插入事件，请使用图像分析软件打开 1， 000 张 TIFF 图像的系列。

使用 rolling ball 设置从所有帧中减去背景。调整录制的色彩平衡，以最大化与囊泡插入事件相对应的强烈区域。手动计数持续时间超过 3 帧或 600 毫秒的荧光突发。

这个 pH 值为 7.4 的细胞图像示例显示了位于质膜和内质网上的受体。在 pH 值为 5.4 时，质膜上的受体不会发出荧光，因此只能看到内质网驻留受体。pH 7.4 和 pH 5.4 时荧光积分密度之间的差异对应于定位于质膜的受体。

在 pH 7.4 下，单个囊泡插入事件在质膜上显示为荧光爆发，持续至少 600 毫秒。在插入之前，不存在明显的突发。当携带 SEP 的运输囊泡到达时，可以看到荧光强度增加。

然后，SEP 标记的受体扩散穿过质膜，直到与先前插入的受体无法区分。一旦掌握，如果执行得当，这种技术可以在每道菜 45 分钟内完成。观看此视频后，您应该对如何监测外周 ER 和质膜之间蛋白质分布的变化有很好的了解。