Name: 利用pHluorin标记的受体监视亚细胞定位和贩运 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 学习使用pHluorin标记和全内反射荧光显微镜实时监测膜蛋白的亚细胞定位和贩运动态。该方法可在小鼠神经母细胞瘤2A细胞中快速、高分辨率地观察蛋白质从内质网向细胞膜的转运过程，为研究基因突变和药物对蛋白质运输的影响提供重要工具。

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本工作部分得到了美国国家药物滥用研究所 T32 DA 016176、美国国家药物滥用研究所 DA 038817 和美国国家药物滥用研究所 DA 040047 的支持。

1. 细胞培养与转染
<ol>
	<li>在生长培养基中培养小鼠神经母细胞瘤2a（N2a）细胞。
	<ol>
		<li>从200 ml高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、250 ml低血清培养基、50 ml胎牛血清（FBS）和5 ml青霉素/链霉素（100倍浓缩液）配制500 ml N2a生长培养基。</li>
		<li>在37 °C、5% CO₂条件下，将细胞培养于T75培养瓶中2 培养箱</li>
		<li>必要时以1:15比例传代细胞，或在细胞融合度达到约80-90%时进行。通常每周2-3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用多聚-D-赖氨酸包被35 mm玻璃底培养皿。
	<ol>
		<li>在超净工作台中，将 200 µl 浓度为 0.1 µg/ml 的多聚-D-赖氨酸加入无菌 35 mm 培养皿的玻璃底区域。</li>
		<li>将培养皿置于37 °C培养箱中孵育1小时。</li>
		<li>用 ddH₂O 轻轻冲洗培养皿2O 3-4 次。</li>
		<li>让培养皿完全干燥超过1小时。</li>
		<li>必要时，使用生物安全柜内的紫外灯对培养皿进行灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为全内反射荧光显微镜成像接种N2a细胞。
	<ol>
		<li>移除贴壁细胞的培养基。</li>
		<li>在37 °C、5% CO₂条件下，用1 ml 1×胰蛋白酶（含EDTA）孵育5分钟，使细胞从培养瓶中脱落。2 培养箱</li>
		<li>加入9 ml培养基以灭活胰蛋白酶。使用移液器混匀培养基、胰蛋白酶和脱离的细胞。</li>
		<li>使用血细胞计数板对细胞进行显微计数，并计算所需体积，使每个聚-D-赖氨酸包被的玻璃底培养皿中加入 90,000 个细胞。该细胞密度对于实现高效转染及单细胞全内反射荧光（TIRF）成像至关重要。</li>
		<li>向每个含有90,000个细胞的玻璃底培养皿中加入2 ml培养基。</li>
		<li>在37 °C、5% CO₂条件下孵育培养皿2 孵育器中孵育16-24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>N2a 转染
	<ol>
		<li>获取一种质粒构建体，其中包含将SEP荧光蛋白插入目标蛋白胞外区的序列。可采用标准克隆技术，如PCR扩增5 可用于构建重组体。 
		注意：SEP 应插入膜蛋白的胞外区，使其位于内质网或运输囊泡的腔内，并在定位于质膜时暴露于细胞外溶液。SEP 的大小与 GFP 相似，可采用类似的克隆策略。</li>
		<li>将培养板中细胞的生长培养基更换为 1.5 ml 低血清培养基（例如，Opti-MEM），在加入转染试剂前约30分钟。 
		注意：为研究药物对受体的诱导变化，可在转染时加入适当浓度的药物。</li>
		<li>将每种目标质粒构建体各500 ng加入250 µl低血清培养基中（管1）。</li>
		<li>向另一管含有250 µl低血清培养基的试管中加入2 µl转染试剂。将2号试管在室温下孵育5分钟。转染试剂与质粒DNA的比例应根据目标蛋白的表达情况进行优化。</li>
		<li>将1号管和2号管混合，制成含有500 µl转染试剂与质粒混合物的溶液。室温孵育25分钟。</li>
		<li>将500 µl转染混合物加入预先铺板的细胞中，每皿总体积为2 ml。</li>
		<li>在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞2 孵育24小时。</li>
		<li>24小时后，移除转染混合物，用生长培养基清洗细胞，然后向每皿中加入2 ml生长培养基。 
		注意：如果在转染时已加入药物，则可在该步骤再次补充药物。</li>
		<li>在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞2 孵育器中孵育24小时。</li>
		<li>转染后48小时对细胞进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 全内反射荧光显微镜（TIRFM）活细胞成像
<ol>
	<li>成像设置
	<ol>
		<li>使用倒置荧光显微镜系统配合扫描载物台进行成像，如图1所示。该系统需配备488 nm DPSS激光源、用于调节488 nm光束位置的步进电机，以及高数值孔径（1.49 NA）的60倍或100倍油浸物镜。</li>
		<li>将激光束通过适当的激发滤光片（带通488/10 nm）。将偏振激光束对准连接至安装在步进电机上的光纤耦合器的单模光纤。在落射荧光模式下，激发光束应位于物镜后孔径的中心位置。</li>
		<li>为实现全内反射荧光（TIRF），使用步进电机将聚焦的激光束沿物镜后孔径移动，直至达到临界角，此时光束不再透过样品，而是完全在玻璃-细胞界面发生全反射。</li>
		<li>使用EMCCD相机（512 × 512像素）在成像软件（例如 Metamorph）控制下采集图像，发射光路中需安装适当的发射滤光片（525/50 nm）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备成像溶液
	<ol>
		<li>通过将150 mM NaCl、4 mM KCl、2 mM MgCl2、2 mM CaCl2、10 mM HEPES和10 mM葡萄糖溶于ddH2O中，配制200 ml细胞外液（ECS）。NaCl、KCl、MgCl2和CaCl2的储备液可预先配制，并在成像当天与新鲜配制的HEPES和葡萄糖混合使用。</li>
		<li>将100 ml ECS溶液的pH调节至7.4，另100 ml ECS溶液的pH调节至5.4。用2 ml pH 7.4的ECS冲洗转染后的细胞。</li>
		<li>成像前向转染细胞中加入2 ml pH 7.4的ECS。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活细胞TIRF成像
	<ol>
		<li>开启整个系统，包括488 nm激光器、相机、平移载物台和成像程序。聚焦落射荧光光束，并将光强调节至60倍物镜下约1 mW。</li>
		<li>在物镜上滴加浸油，将含有转染细胞的培养皿置于平移载物台上。使用载物台夹具固定培养皿，确保其相对于载物台位置不变，以便对同一细胞进行多次成像。</li>
		<li>在落射荧光模式下，调节显微镜焦距并定位具有荧光信号的转染细胞。细胞在多个焦平面内均保持清晰聚焦。选择单个、孤立的细胞用于后续TIRF成像。</li>
		<li>在成像程序中，将曝光时间设为200毫秒，并通过调节EM增益优化荧光强度。</li>
		<li>使用步进电机逐步平移激光束穿过物镜后孔径，使光束进入TIRF模式。当接近临界角时，光束将明显沿培养皿边缘移动，直至在样品平面上发生全内反射的点位汇聚。</li>
		<li>通过调节焦距旋钮确认细胞处于TIRF模式。在TIRF模式下，仅有一个细胞焦平面可被清晰聚焦（即距玻璃界面约150 nm），从而获得等离子膜的高分辨率清晰图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像SEP以确定亚细胞定位
	<ol>
		<li>在成像平面上定位健康、转染成功且孤立的单个细胞。</li>
		<li>在pH 7.4条件下获取细胞的清晰图像。此时应可见标记在等离子膜和内质网上的SEP标记受体。</li>
		<li>迅速阻断激光束，防止样品发生光漂白。</li>
		<li>使用具备记录多个xy位置功能的显微镜成像软件，记忆每个细胞对应的载物台位置。</li>
		<li>对每皿20–30个细胞重复步骤2.4.1–2.4.4，同时使用软件记录每个细胞的位置。</li>
		<li>在完成所有pH 7.4条件下的细胞图像采集后，手动使用移液器移除pH 7.4的ECS溶液。操作时避免触碰培养皿，以防改变已记忆的载物台位置。</li>
		<li>小心向培养皿中加入2 ml pH 5.4的ECS，静置10分钟。在此期间保存已获取的图像。</li>
		<li>在与pH 7.4成像完全相同的条件下，将载物台移至各保存位置，对同一细胞在pH 5.4条件下成像。此时细胞图像应变得模糊，因为所有检测到的荧光均来自局限于内质网的SEP标记受体。保存pH 5.4条件下的细胞图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活细胞中单个囊泡插入事件的成像
	<ol>
		<li>将转染细胞的培养基替换为2 ml pH 7.4的ECS，或替换为Leibovitz's L-15培养基。Leibovitz's L-15培养基的pH不依赖CO2，必要时可支持长时间成像。</li>
		<li>将含有转染细胞的培养皿置于显微镜载物台上。参照上述步骤2.3，固定并以TIRF模式对单个细胞进行聚焦。</li>
		<li>若设备配备自动对焦功能，应启用该功能以防止成像过程中焦距漂移。</li>
		<li>连续采集1,000帧图像，帧速率为200毫秒/帧。在此期间可观察到荧光爆发信号，对应于低pH囊泡与等离子膜融合，使SEP暴露于细胞外pH 7.4环境中。</li>
		<li>定位另一个单个细胞并重复上述步骤。必要时重置自动对焦功能。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 图像分析与数据处理
<ol>
	<li>分析 SEP 荧光以确定亚细胞定位
	<ol>
		<li>使用图像分析软件（如 Metamorph 或 ImageJ（http://imagej.nih.gov/ij/））打开细胞图像。利用滚动球设置对 pH 5.4 和 pH 7.4 的图像均进行背景扣除。</li>
		<li>使用基于强度的阈值来量化单个细胞的荧光。在 pH 7.4 图像中手动选择细胞周围的感兴趣区域。</li>
		<li>使用 ImageJ 中的插件或“分析”选项卡下的内置 &#34;测量&#34;功能，测量细胞面积、平均强度和积分密度。</li>
		<li>对同一细胞在 pH 5.4 条件下的图像重复步骤 3.1.1–3.1.3，以相同方式仔细调整基于强度的阈值和感兴趣区域。</li>
		<li>在获得 pH 7.4 和 pH 5.4 条件下细胞图像的积分密度后，通过从 pH 7.4 的值中减去 pH 5.4 的值得到质膜积分密度。该差值对应于 TIRF 激发区域内质膜上的受体相对数量。</li>
		<li>作为运输的衡量指标，将位于质膜上的 SEP 标记受体的相对百分比计算为：质膜积分密度除以 pH 7.4 时的总积分密度，再乘以 100，表示相对于 TIRF 激发体积内其余可见受体的比例。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析单个囊泡插入事件
	<ol>
		<li>使用图像分析软件打开一系列 1,000 张 tiff 图像。使用滚动球设置对所有帧进行背景扣除。</li>
		<li>调整录像的颜色平衡，以增强对应于囊泡插入事件的强荧光区域。手动计数持续时间超过 3 帧（&#62;600 毫秒）的荧光爆发事件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无任何利益冲突。

SEP 的 pH 敏感性使得位于质膜上的受体与内质网中的细胞内受体得以区分，并可用于解析携带受体的囊泡插入事件5,7,8,9,18,19,20。目前已有多种技术被广泛用于检测蛋白的表面表达水平，包括细胞表面生物素化和配体结合实验。在某些情况下，也可通过 Western 印迹法区分定位于内质网和质膜的蛋白。这种基于 SEP 的技术是对传统检测方法的补充，能够快速读取表面表达情况，并量化蛋白从内质网向质膜的定位转移。由于 SEP 可被遗传编码至目标蛋白中，因此避免了非特异性结合的问题，同时提高了检测灵敏度。SEP 在中性 pH 条件下可被 488 nm 激发，但在酸性条件（pH &...

受体表达、分布和组装的变化与多种疾病相关，包括阿尔茨海默病、帕金森病、囊性纤维化以及药物成瘾1,2,3,4,5。例如，尼古丁及其他烟碱型配体可影响烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）的转运过程，从而导致其转运、表达和上调发生改变1,2,5,6,7,8,9,10。尼古丁可增加细胞内组装完成的nAChRs总数，促进其向细胞膜的转运，并改变亚基的组装方式，从而有利于形成某些亚型的高敏感性受体。在疾病模型中解析受体在转运、组装和表达方面的具体变化，可提供关键的机制性信息，这对于确定药物靶点至关重要。理想的方法应能快速区分细胞内受体与定位于细胞膜上的受体。当某种蛋白主要存在于细胞内时（如nAChRs），这一区分尤为困难。由于大多数nAChRs定位于内质网，传统检测方法缺乏足够的时空分辨率，无法精确定位分泌通路中受体的定位与转运变化。目前对nAChRs的受体转运与表达研究主要依赖放射性配体结合11、生物素标记实验12、蛋白质印迹（Western blotting）13或免疫沉淀技术12。这些方法依赖报告分子的结合特异性或细胞固定，无法同时区分定位于细胞膜与细胞内的受体。因此，离子通道组装与囊泡动态的研究在很大程度上仍依赖低通量的电生理技术14。
随着荧光显微技术的进步，可以获得更高的空间和时间分辨率。基因编码的报告分子（如绿色荧光蛋白（GFP）及其变体）能够消除非特异性结合问题，并提高检测灵敏度15。一种对pH敏感的GFP变体，称为超夹式pHluorin（SEP），可利用细胞内不同区室之间固有的pH差异来确定蛋白定位5,7,8,9,16,17,18。当pH高于6时，SEP发出荧光；而在较低pH条件下则处于关闭状态。因此，当位于内质网（ER）中或插入质膜（PM）时，其腔侧标记有SEP的受体会被检测到，但当其被限制在运输囊泡中时则无法检测。通过调控与质膜上受体接触的细胞外pH，可改变其荧光信号，从而影响这些受体的检测。若在同一细胞中依次于中性细胞外pH和低于6的pH条件下成像，则两幅图像之间的差异可归因于位于质膜上的受体。这种方法可同时测量细胞内（周边内质网）和质膜上的受体分布5,7,8,9。当细胞外pH为中性时，还可分辨单个囊泡的插入事件。一旦低pH的运输囊泡与质膜融合，囊泡的腔面暴露于中性细胞外溶液中，导致荧光突然增强，表现为荧光爆发信号7,18,19,20。SEP使得能够检测定位于质膜和周边内质网的受体，并提供了一种测量受体在这两个亚细胞区域之间转运的方法5,7,18。
为了在质膜上实现更高的分辨率，可通过全内反射荧光显微镜（TIRFM）对带有基因编码SEP的受体进行成像。当大多数受体定位于细胞内区域时，该方法尤为适用，因为TIRFM可增强质膜的可见性。TIRFM还能够分辨携带SEP标记受体的单个囊泡在插入质膜（PM）过程中的运输动态。全内反射发生在具有不同折射率的材料界面处，例如细胞与玻璃盖玻片之间21,22。当以488 nm激发光照射时，SEP产生荧光，该激发光被定向以在玻璃与细胞溶液界面处实现全内反射。这会产生一种穿透样品约150 nm的隐逝波，仅激发该范围内的荧光基团。因此，仅检测到在此激发范围内、处于中性pH环境中的含SEP受体，这些受体对应于位于质膜或周边内质网上的受体。由于检测仅限于隐逝波的激发，来自细胞内区域的背景荧光被降低，信噪比得以提高21,22。此外，由于激发光不穿透细胞主体，光损伤被最小化，从而允许对活细胞进行长时间的成像观察。因此，结合基因编码SEP的TIRFM技术可提供所需的高分辨率和高灵敏度，用于测量膜受体在分泌途径中的亚细胞定位及运输动态。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;试剂/材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带滤膜盖的无菌细胞培养瓶，Greiner Bio One，75 cm²&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>VWR</td><td>82050-856</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿，无菌</td><td>细胞 E&amp;amp;G</td><td>GBD00002-200</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>vwr</td><td>215017510</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基&amp;lrm; （DMEM），高葡萄糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-965-084&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>31-985-088</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，认证级，美国来源，标准型（无菌过滤）&amp;nbsp;</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>16-000-044</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶（1 倍浓度），无酚红</td><td>Fisher Scientific</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>VWR</td><td>45000-652</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 培养基，无酚红</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>21083027</td><td>可选</td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>11668030</td><td>轻柔混匀；切勿涡旋震荡</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-10</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>目标浸油&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>F型</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td></td></tr><tr><td>60倍，1.49 数值孔径油浸物镜</td><td>奥林巴斯</td><td>APON 60XOTIRF</td><td></td></tr><tr><td>电动载物台</td><td>之前</td><td>IXPROXY</td><td></td></tr><tr><td>电动执行器（步进电机）</td><td>Thorlabs</td><td>ZST213</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph（或其他成像软件）</td><td>Metamorph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 nm 激光器</td><td>市场技术</td><td></td><td></td></tr><tr><td>单模光纤</td><td>Thorlabs</td><td>SM450</td><td></td></tr><tr><td>镜子</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E01</td><td></td></tr><tr><td>二向色镜 488 nm LP</td><td>Semrock</td><td>Di02-R488-25x36</td><td></td></tr><tr><td>带通滤光片，488 nm</td><td>Semrock</td><td>LL01-488-12.5</td><td></td></tr><tr><td>带通滤光片，525/50</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td></td></tr></tbody></table>

利用phluorin标记的受体监测亚细胞定位与转运

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

要理解膜蛋白的运输、组装和表达，需要一种能够区分位于细胞内细胞器中的膜蛋白与定位于质膜上的膜蛋白的方法。传统的基于荧光的检测方法无法区分存在于不同细胞器中的膜蛋白。前沿技术通过将pH敏感型荧光团与全内反射荧光显微镜（TIRFM）相结合，超越了传统方法。TIRF照明仅激发玻璃-样品界面约150 nm范围内的样本，从而降低背景信号，提高信噪比，并增强分辨率。TIRFM的激发体积涵盖质膜及邻近细胞器，例如周边内质网（ER）。超激发pHluorin（SEP）是绿色荧光蛋白（GFP）的一种pH敏感型变体。将SEP基因编码至目标膜蛋白的胞外结构域，可使荧光团定位于内质网腔面以及细胞的胞外区域。当pH大于6时，SEP具有荧光；而在较低pH值下则处于非荧光的“关闭”状态。因此，标记了SEP的受体在位于内质网（ER）或插入质膜（PM）时会发出荧光，但在局限于运输囊泡或高尔基体等其他细胞器时则不发光。通过调节胞外pH，可控制质膜上受体的荧光状态。同一细胞在中性和酸性胞外pH条件下所获得的TIRF图像之间的荧光差异，对应于质膜上受体的相对数量。该方法可实现对胞内和质膜定位受体的同步测量。当胞外pH为中性时，还可检测单个囊泡的插入事件，这对应于低pH的运输囊泡与质膜融合并转变为荧光状态的过程。这一多功能技术可用于研究膜蛋白的定位、表达及运输过程。

将硒代半胱氨酸（SEP）掺入受体后，可在活细胞中直接检测该受体。结合全内反射荧光显微技术（TIRFM），可评估受体在质膜上的相对表达水平及其在全内反射激发区域内的亚细胞定位分布情况。此外，还可解析单个囊泡的运输事件。
质膜上SEP标记受体的相对表达水平
在激发光作用下，SEP的荧光强度受周围溶液pH值的调控。当SEP与定位于质膜的受体融合时，可通过改变胞外pH值来开启或关闭其荧光信号5,7,8,9,17。当胞外溶液p...

利用对pH敏感的荧光蛋白——超 ecliptic pHluorin（SEP）标记膜蛋白的胞外结构域，可确定该蛋白的亚细胞定位、表达水平及转运过程。通过全内反射荧光显微镜（TIRFM）对SEP标记的蛋白进行成像，能够定量分析蛋白在周边内质网和质膜中的表达水平。

利用pHluorin标记的受体监测亚细胞定位与转运

理解膜蛋白的运输、组装和表达需要一种能够区分存在于细胞内……的蛋白的方法

本荧光成像方法的总体目标是监测膜蛋白运输及细胞内分布的变化。该方法可深入了解蛋白运输过程中的变化，例如基因突变或药理学试剂对囊泡输送速率以及细胞表面蛋白表达水平的影响。该技术的主要优势在于，可在不破坏样本的情况下，快速、高分辨率地实时进行测量。成像前 48 小时，将含有 SEP 的质粒构建体转染至鼠神经母细胞瘤 2A 细胞中，其中 SEP 是一种对 pH 敏感的荧光基团，可插入目标蛋白的胞外区域。当转染细胞准备就绪可用于成像时，在全内反射荧光（TIRF）显微镜下，向细胞中加入 2 毫升 pH 7.4 的细胞外溶液（ECS）。将细胞培养皿放置在载物台的移动平台上，并使用载物台夹具将培养皿固定到位。在落射荧光模式下，调节显微镜焦距并定位荧光转染的细胞。细胞在多个焦平面中将保持清晰对焦。选择单个、孤立的细胞以进行后续的全内反射荧光（TIRF）成像。在成像程序中，将曝光时间设置为 200 毫秒，并通过调节 EM 增益来优化荧光强度。使用步进电机以逐步移动的方式将激光束沿物镜平移，从而将激光切换至全内反射荧光（TIRF）模式。当接近临界角时，光束将明显沿培养皿边缘移动，直至在样品平面上发生全内反射的点处汇聚，此时光束在培养皿边缘不再可见。通过调节焦距旋钮确认细胞处于全内反射荧光（TIRF）模式。在TIRF模式下，仅有一个细胞平面可以被聚焦，从而获得高分辨率、清晰定义的细胞质膜图像。开始此操作前，需在成像平面上找到健康的转染单个细胞。在 pH 7.4 条件下获取细胞的聚焦图像。质膜和内质网上的 SEP 标记受体应可见。迅速阻断激光束，使其无法照射到样品，以防止光漂白。使用能够记录多个XY位置的显微镜成像软件，记录与每个细胞相对应的载物台位置。通过该软件，在每个培养皿中采集20至30个细胞的图像，同时记录每个细胞的位置。在收集完pH 7.4条件下的所有细胞图像后，用移液器手动移除pH 7.4的ECS，操作时不要触碰培养皿。小心地向培养皿中加入 2 毫升 pH 5.4 的 ECS，并等待 10 分钟。在此期间，保存先前获取的图像。在与采集 pH 7.4 图像时完全相同的条件下，移动载物台至每个已保存的位置，并在 pH 5.4 条件下获取同一细胞的图像。由于所有检测到的荧光均来自局限于内质网的SEP标记受体，细胞形态应显得较不清晰。保存pH 5.4条件下的细胞图像。为观察单个囊泡的插入事件，首先将转染细胞的培养基替换为两毫升pH 7.4的ECS。接下来，将转染后的细胞培养皿放置在显微镜载物台上，并使用载物台夹具固定培养皿。如前所述，在全内反射荧光（TIRF）模式下对准单个细胞进行聚焦。如果设备具备自动对焦功能，请启用该功能，以防止成像过程中焦点漂移。连续记录1,000帧图像，帧速率为200毫秒。在此期间将可见荧光爆发，对应于低pH值的运输囊泡与质膜融合，使SEP暴露于细胞外p

utilizing-phluorin-tagged-receptors-to-monitor-subcellular

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

利用pHluorin标记的受体监视亚细胞定位和贩运

本报告介绍了利用活细胞成像和光漂白技术，研究在神经元质膜上外源性表达的、pH敏感型GFP标记蛋白的表面表达、转运途径及运输动力学。...

利用荧光恢复与荧光丢失光漂白技术评估培养神经元中膜蛋白的侧向扩散与胞吐作用

通过将膜受体的胞外结构域与超 ecliptic pHluorin...

成像小鼠原代培养神经元中pHluorin标记受体插入质膜的过程

本文描述了利用一种pH敏感的绿色荧光蛋白变体pHluorin，研究轴突导向受体在细胞表面转运的时空动态。 pHluorin标记的受体在细胞培养中均有表达...

利用pHluorin评估细胞培养及鸡胚中轴突导向受体动态变化

本方案描述了如何利用全内反射荧光显微镜观察和追踪活细胞表面的单个受体，从而分析受体的侧向流动性、受体复合物的大小，以及可视化瞬时的受体-受体相互作用。该方案可拓展应用于其他膜蛋白。...

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使用TIRFM和pH敏感型GFP探针评估SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中神经递质囊泡动态：细胞成像与数据分析

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学习使用pHluorin标记和全内反射荧光显微镜实时监测膜蛋白的亚细胞定位和贩运动态。该方法可在小鼠神经母细胞瘤2A细胞中快速、高分辨率地观察蛋白质从内质网向细胞膜的转运过程，为研究基因突变和药物对蛋白质运输的影响提供重要工具。

利用pHluorin标记的受体监测亚细胞定位与转运

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