3.8: 表达谱芯片

DNA 微阵列芯片是广泛使用的工具，可同时测量许多不同基因的表达。它们由数千个探针组成，每个探针代表固定在芯片上的不同基因。或载玻片，并依靠互补杂交来评估不同生物条件下的基因表达。

本视频将介绍微阵列技术的基本原理、使用微阵列进行基因表达谱分析的方案以及一些当前的应用。

让我们首先讨论基因表达谱分析和微阵列技术的原理。

最早开发的用于评估生物样品中基因表达的方法之一是 Northern 印迹，它涉及 "探测"用于固定在膜上的特异性 RNA 分子。?自由浮动？探针识别样品中的互补 RNA 序列，通常用放射性或荧光分子标记，以便观察它们。

微加工、基因组测序和其他技术的进步导致了微阵列生物芯片的发展。与 Northern 印迹一样，微阵列芯片基于探针和样品核酸序列之间互补结合的原理。然而，与 Northern 不同的是，在微阵列中，寡核苷酸探针被固定在载玻片或芯片上。？自由浮动的样品由从目标细胞或生物体中分离的 RNA 产生，这些 RNA 被逆转录为互补或 ？c？-DNA。这可以直接用荧光分子标记，也可以通过体外转录成 cRNA 进一步扩增其量。然后将样品与芯片杂交。因为为不同应用设计的微阵列上的探针可能是 ？sense，？这意味着它们的序列与生物体表达的 RNA 或反义 RNA 的方向相同。研究人员必须确保样品的链方向性与探针的链方向性互补。

？原始的？然后可以定量和处理 ChIP 上每个基因特异性点的荧光强度数据。数据可以进行进一步的统计测试，如 Student 的 t 检验，以确定目标基因的荧光信号和表达水平在两种细胞类型或实验条件之间是否显着不同。

研究人员还可以使用这些数据对或根据相似的表达模式对基因进行分组。例如，当比较两个细胞群之间的表达模式时，可能会发现某些基因在相同方向上表现出大致相等量的表达变化，因此将被归为一组。研究人员可以用一种树形图或 ？树状图？其中 ？树枝的高度和排列？表示基因表达模式的相似或不同程度。这种类型的分析可以提供对基因网络的见解，如"聚类？基因可能参与相同的生物途径。

现在我们已经讨论了微阵列方法的原理，让我们看一下典型的微阵列实验。

为了确保分离的 RNA 的质量，工作空间和设备应使用使 RNase 酶失活的化学物质处理，否则这些酶会破坏 RNA。然后从目标样品中分离 RNA 并纯化，并通过分光光度法测定其浓度和完整性。

该样品 RNA 被转化为 cDNA，然后转化为 cRNA。接下来，用荧光分子标记样品并碎裂，再次检查其质量和数量，此时还可以评估荧光标记的程度。

然后将标记的 cRNA 与 ？杂交溶液？在加载到微阵列芯片上之前。为了促进杂交成功，？mixer？放置在芯片上以形成杂交室。然后将杂交混合物缓慢添加到阵列中。必须注意避免气泡，因为气泡会干扰样品与微阵列上特定区域的结合，并导致假阴性信号。添加样品后，将芯片在适当温度下孵育长达 24 小时。

杂交后，从芯片中取出混合器，洗去未结合的样品，并在专用的载玻片保持离心机中离心，彻底干燥阵列。将干燥的芯片插入微阵列扫描仪中，并调整机器，以便在芯片上观察到的最亮信号不会过度饱和。然后扫描微阵列，并生成整个芯片的图像。

扫描芯片后，图像文件将加载到数据提取软件中，并评估任何信号异常。从微阵列图像中提取的数据经过许多统计作，包括 log2 转换，它允许研究人员根据基因表达的倍数增加或减少来数字描述数据;以及归一化，它解释了微阵列芯片之间的信号差异。然后可以进一步分析这些处理后的数据。

现在我们已经演示了如何使用微阵列进行表达谱分析，让我们看看如何在特定实验中使用微阵列。

研究人员经常使用微阵列来评估基因表达在整个生物过程中的变化，例如细胞分化。在这里，科学家们评估了代表视网膜发育不同阶段的三种人类细胞类型中 microRNA 的水平，microRNA 是参与微调基因表达的 22 个核苷酸的小 RNA。通过比较这些细胞之间的 microRNA 表达，研究人员能够识别可能参与视网膜组织分化和发育的基因。

微阵列也可用于评估不同细胞或组织类型之间的表达差异。在这个实验中，通过将大鼠暴露在电击下建立了创伤后应激障碍 （PTSD） 的啮齿动物模型。从不同的大脑区域收集神经元并分离 RNA。然后使用微阵列鉴定这些神经元中线粒体相关基因的差异表达，从而深入了解 PTSD 背后的复杂分子机制。

最后，研究人员还将微阵列应用于癌症研究，希望能够识别新的疾病生物标志物。由于我们在整个进化过程中受到病毒感染，人类基因组包含被称为内源性逆转录病毒的病毒基因序列。或 ERV，其中一些仍然积极表达。在这里，使用微阵列比较了癌性和正常前列腺组织中 ERV 的表达。这种方法使研究人员能够确定几种在前列腺癌中上调的 ERV，使它们成为可用于诊断疾病的潜在生物标志物。

您刚刚观看了 JoVE 关于使用微阵列进行基因表达分析的视频。该视频介绍了微阵列芯片技术的基本原理、表达谱分析方案以及该技术的应用。一如既往，感谢您的观看！