使用微阵列进行表达谱分析
微阵列是用于分析基因表达的重要工具，其原理基于固定在玻璃芯片上的探针与来自样本的核酸之间的互补结合。利用这些阵列，科学家可以同时评估数千个基因的表达情况。此外，还可以比较不同细胞或组织类型的表达谱，从而推断不同基因在生物过程中表达水平的变化，进而深入了解这些基因在通路或网络中可能发挥的功能。
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DNA 微阵列是广泛使用的工具，可同时测量许多不同基因的表达水平。它们由数千个探针组成——每个探针代表一个不同的基因——这些探针被固定在“芯片”或载玻片上，并依赖互补杂交来评估不同生物学条件下的基因表达情况。
本视频将介绍微阵列技术的基本原理、使用微阵列进行基因表达谱分析的实验方案，以及该技术的一些当前应用。
让我们首先讨论基因表达谱分析和微阵列技术的原理。
评估生物样本中基因表达的最早方法之一是Northern blotting，该方法涉及对固定在膜上的特定RNA分子进行“探针杂交”。游离探针可识别样本中互补的RNA序列，通常标记有放射性或荧光分子，以便进行检测和可视化。
微加工、基因组测序及其他技术的进步推动了微阵列生物芯片的发展。与Northern印迹法类似，微阵列技术基于探针与样本核酸序列之间的互补结合原理。然而，与Northern印迹不同的是，在微阵列中，是将寡核苷酸探针固定于玻璃载片或芯片上。待测样本则来源于目标细胞或生物体中分离的RNA，经逆转录生成互补DNA（cDNA）。该cDNA可直接用荧光分子标记，或通过进一步扩增其数量以提高检测灵敏度。 在 体外 转录为cRNA，然后将样本杂交到芯片上。由于为不同应用设计的微阵列上的探针可能是“有义”链（即其序列方向与生物体表达的RNA相同）或“反义”链，研究人员必须确保样本的链方向性与探针互补。
芯片上每个基因特异性点的“原始”荧光强度数据可被定量和处理。这些数据可进一步进行统计学检验，如学生t检验，以确定目的基因在两种细胞类型或实验条件下荧光信号（即表达水平）是否存在显著差异。
研究人员还可以利用这些数据根据相似的表达模式对基因进行“聚类”或分组。例如，在比较两个细胞群体之间的表达模式时，某些基因可能表现出大致相同方向和幅度的表达变化，因此会被归为同一组。研究人员可以通过一种树状图或“树状图谱”（dendrogram）来展示这些关系，其中“分支”的高度和排列方式反映了基因表达模式的相似性或差异性。这类分析有助于揭示基因网络，因为“聚类”在一起的基因可能参与相同的生物通路。
在讨论了微阵列技术的原理之后，让我们来看一个典型的微阵列实验。
为了确保所提取RNA的质量，实验台面和设备应使用能够灭活RNase（即会降解RNA的酶）的化学试剂进行处理。随后从感兴趣的样本中提取并纯化RNA，并通过分光光度法测定其浓度和完整性。
将提取的样本RNA逆转录为cDNA，再转录为cRNA。接着，用荧光分子对样本进行标记并打断成片段，此时可再次检测其质量和数量，同时评估荧光标记的程度。
标记后的cRNA与“杂交溶液”混合，然后加载到微阵列芯片上。为促进有效杂交，在芯片上安装“杂交盖片”以形成“杂交室”。随后缓慢将杂交混合液加入芯片表面。操作过程中需避免产生气泡，因为气泡会干扰样本与微阵列特定区域的结合，导致假阴性信号。样本加样完成后，将芯片在适当温度下孵育长达24小时。
杂交完成后，从芯片上移除杂交盖片，洗去未结合的样本，并使用专用的载片离心机通过离心彻底干燥芯片。干燥后的芯片被插入微阵列扫描仪中，调整仪器参数，确保芯片上最强信号不发生饱和。随后对芯片进行扫描，生成整张芯片的图像。
芯片扫描完成后，将图像文件导入数据提取软件，并检查是否存在信号异常。从微阵列图像中提取的数据需经过一系列统计学处理，包括log2转换，以便研究人员以基因表达倍数变化的形式进行数值化描述；以及标准化处理，用于校正不同微阵列芯片之间的信号差异。经过处理的数据可进一步用于深入分析。
现在我们已经演示了如何使用微阵列进行表达谱分析，接下来让我们看看微阵列在具体实验中的应用方式。
研究人员常使用微阵列来评估基因表达在生物过程（如细胞分化）中的变化。在此项研究中，科学家检测了三种代表视网膜发育不同阶段的人类细胞类型中微小RNA（microRNA）的表达水平。这些microRNA是长度为22个核苷酸的小分子RNA，参与基因表达的精细调控。通过比较这些细胞间的microRNA表达情况，研究人员能够鉴定出可能参与视网膜组织分化与发育的基因。
微阵列还可用于评估不同细胞或组织类型之间的表达差异。在本实验中，研究人员通过使大鼠接受电击，建立了创伤后应激障碍（post-traumatic stress disorder, PTSD）的啮齿类动物模型。随后从不同脑区收集神经元并提取RNA，利用微阵列技术鉴定这些神经元中线粒体相关基因的差异表达，从而揭示PTSD背后复杂的分子机制。
最后，研究人员还将微阵列应用于癌症研究，以期发现新的疾病生物标志物。在人类进化过程中，由于病毒感染，人类基因组中保留了被称为“内源性逆转录病毒”（endogenous retroviruses, ERVs）的病毒遗传序列，其中部分ERV仍处于活跃表达状态。在此项研究中，研究人员利用微阵列比较了前列腺癌组织与正常前列腺组织中ERV的表达水平。该方法帮助研究人员鉴定出多个在前列腺癌中表达上调的ERV，这些ERV有望成为用于疾病诊断的潜在生物标志物。
您刚刚观看了 JoVE 关于使用微阵列进行基因表达谱分析的视频。本视频介绍了微阵列技术的基本原理、表达谱分析的实验方案以及该技术的应用。一如既往，感谢您的观看！
DNA 微阵列是广泛使用的工具，可同时测量许多不同基因的表达水平。它们由数千个探针组成——每个探针代表一个不同的基因——这些探针被固定在“芯片”或载玻片上，并依赖互补杂交来评估不同生物学条件下的基因表达情况。
本视频将介绍微阵列技术的基本原理、使用微阵列进行基因表达谱分析的实验方案，以及该技术的一些当前应用。
让我们首先讨论基因表达谱分析和微阵列技术的原理。
评估生物样本中基因表达的最早方法之一是Northern blotting，该方法涉及对固定在膜上的特定RNA分子进行“探针杂交”。游离探针可识别样本中互补的RNA序列，通常标记有放射性或荧光分子，以便进行检测和可视化。
微加工、基因组测序及其他技术的进步推动了微阵列生物芯片的发展。与Northern印迹法类似，微阵列技术基于探针与样本核酸序列之间的互补结合原理。然而，与Northern印迹不同的是，在微阵列中，是将寡核苷酸探针固定于玻璃载片或芯片上。待测样本则来源于目标细胞或生物体中分离的RNA，经逆转录生成互补DNA（cDNA）。该cDNA可直接用荧光分子标记，或通过进一步扩增其数量以提高检测灵敏度。 在 体外 转录为cRNA，然后将样本杂交到芯片上。由于为不同应用设计的微阵列上的探针可能是“有义”链（即其序列方向与生物体表达的RNA相同）或“反义”链，研究人员必须确保样本的链方向性与探针互补。
芯片上每个基因特异性点的“原始”荧光强度数据可被定量和处理。这些数据可进一步进行统计学检验，如学生t检验，以确定目的基因在两种细胞类型或实验条件下荧光信号（即表达水平）是否存在显著差异。
研究人员还可以利用这些数据根据相似的表达模式对基因进行“聚类”或分组。例如，在比较两个细胞群体之间的表达模式时，某些基因可能表现出大致相同方向和幅度的表达变化，因此会被归为同一组。研究人员可以通过一种树状图或“树状图谱”（dendrogram）来展示这些关系，其中“分支”的高度和排列方式反映了基因表达模式的相似性或差异性。这类分析有助于揭示基因网络，因为“聚类”在一起的基因可能参与相同的生物通路。
在讨论了微阵列技术的原理之后，让我们来看一个典型的微阵列实验。
为了确保所提取RNA的质量，实验台面和设备应使用能够灭活RNase（即会降解RNA的酶）的化学试剂进行处理。随后从感兴趣的样本中提取并纯化RNA，并通过分光光度法测定其浓度和完整性。
将提取的样本RNA逆转录为cDNA，再转录为cRNA。接着，用荧光分子对样本进行标记并打断成片段，此时可再次检测其质量和数量，同时评估荧光标记的程度。
标记后的cRNA与“杂交溶液”混合，然后加载到微阵列芯片上。为促进有效杂交，在芯片上安装“杂交盖片”以形成“杂交室”。随后缓慢将杂交混合液加入芯片表面。操作过程中需避免产生气泡，因为气泡会干扰样本与微阵列特定区域的结合，导致假阴性信号。样本加样完成后，将芯片在适当温度下孵育长达24小时。
杂交完成后，从芯片上移除杂交盖片，洗去未结合的样本，并使用专用的载片离心机通过离心彻底干燥芯片。干燥后的芯片被插入微阵列扫描仪中，调整仪器参数，确保芯片上最强信号不发生饱和。随后对芯片进行扫描，生成整张芯片的图像。
芯片扫描完成后，将图像文件导入数据提取软件，并检查是否存在信号异常。从微阵列图像中提取的数据需经过一系列统计学处理，包括log2转换，以便研究人员以基因表达倍数变化的形式进行数值化描述；以及标准化处理，用于校正不同微阵列芯片之间的信号差异。经过处理的数据可进一步用于深入分析。
现在我们已经演示了如何使用微阵列进行表达谱分析，接下来让我们看看微阵列在具体实验中的应用方式。
研究人员常使用微阵列来评估基因表达在生物过程（如细胞分化）中的变化。在此项研究中，科学家检测了三种代表视网膜发育不同阶段的人类细胞类型中微小RNA（microRNA）的表达水平。这些microRNA是长度为22个核苷酸的小分子RNA，参与基因表达的精细调控。通过比较这些细胞间的microRNA表达情况，研究人员能够鉴定出可能参与视网膜组织分化与发育的基因。
微阵列还可用于评估不同细胞或组织类型之间的表达差异。在本实验中，研究人员通过使大鼠接受电击，建立了创伤后应激障碍（post-traumatic stress disorder, PTSD）的啮齿类动物模型。随后从不同脑区收集神经元并提取RNA，利用微阵列技术鉴定这些神经元中线粒体相关基因的差异表达，从而揭示PTSD背后复杂的分子机制。
最后，研究人员还将微阵列应用于癌症研究，以期发现新的疾病生物标志物。在人类进化过程中，由于病毒感染，人类基因组中保留了被称为“内源性逆转录病毒”（endogenous retroviruses, ERVs）的病毒遗传序列，其中部分ERV仍处于活跃表达状态。在此项研究中，研究人员利用微阵列比较了前列腺癌组织与正常前列腺组织中ERV的表达水平。该方法帮助研究人员鉴定出多个在前列腺癌中表达上调的ERV，这些ERV有望成为用于疾病诊断的潜在生物标志物。
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Q1: How do microarrays measure gene expression?
Microarrays measure gene expression through complementary hybridization between immobilized probes on glass chips and labeled sample nucleic acids. RNA from cells is reverse transcribed to cDNA, then converted to cRNA and labeled with fluorescent molecules. When the labeled sample hybridizes to matching probes on the chip, fluorescence intensity at each spot indicates expression levels for thousands of genes simultaneously.
Q2: What is the difference between microarrays and Northern blotting?
Northern blotting uses free-floating probes to detect RNA immobilized on membranes, while microarrays reverse this arrangement. In microarrays, oligonucleotide probes are immobilized on glass slides, and free-floating labeled cDNA or cRNA samples hybridize to them. This allows microarrays to simultaneously evaluate thousands of genes, whereas Northern blots typically assess one or a few genes at a time.
Q3: Why is RNA quality important before microarray analysis?
RNA quality is critical because RNases—enzymes that degrade RNA—can destroy samples during isolation and preparation. Workspaces and equipment are treated with RNase-inactivating chemicals to protect RNA integrity. Researchers verify RNA quality and concentration through spectrophotometry before converting it to cDNA, ensuring reliable downstream hybridization and accurate gene expression measurements.
Q4: How does microarray data analysis reveal gene relationships?
Microarray data undergoes statistical processing including log2 transformation and normalization to account for signal differences between chips. Researchers then cluster genes based on similar expression patterns across conditions. Dendrograms depict these relationships, showing how closely gene expression patterns match. Clustered genes often participate in the same biological pathways, providing insight into gene networks and functional associations.
Q5: What role do hybridization chambers play in microarray experiments?
Hybridization chambers are formed by placing a mixer onto the microarray chip to create isolated compartments for the hybridization mix. These chambers facilitate controlled binding between labeled sample and immobilized probes. Care must be taken to avoid air bubbles during sample loading, as they interfere with binding and produce false negative signals. Chips are then incubated at appropriate temperatures for up to 24 hours.
Q6: How are microarrays applied to cancer research?
Researchers use microarrays to compare gene expression between cancerous and normal tissues to identify disease biomarkers. For example, scientists compared endogenous retroviruses (ERVs)—viral sequences in human genomes—between prostate cancer and normal tissues. This identified ERVs upregulated in cancer, which can serve as diagnostic biomarkers. Microarrays enable simultaneous evaluation of thousands of genes to pinpoint expression differences associated with disease.
Q7: What does microarray scanning and image processing reveal?
After hybridization, the dried microarray is scanned to produce a digital image showing fluorescence intensity at each probe location. The scanner is adjusted to prevent signal over-saturation. Data-extraction software then analyzes the image for signal irregularities and processes the data through log2 transformation and normalization. This processed data quantifies fold changes in gene expression between experimental conditions.