使用微阵列进行表达谱分析

DNA 微阵列是广泛使用的工具，可同时测量许多不同基因的表达水平。它们由数千个探针组成——每个探针代表一个不同的基因——这些探针被固定在“芯片”或载玻片上，并依赖互补杂交来评估不同生物学条件下的基因表达情况。

本视频将介绍微阵列技术的基本原理、使用微阵列进行基因表达谱分析的实验方案，以及该技术的一些当前应用。

让我们首先讨论基因表达谱分析和微阵列技术的原理。

评估生物样本中基因表达的最早方法之一是Northern blotting，该方法涉及对固定在膜上的特定RNA分子进行“探针杂交”。游离探针可识别样本中互补的RNA序列，通常标记有放射性或荧光分子，以便进行检测和可视化。

微加工、基因组测序及其他技术的进步推动了微阵列生物芯片的发展。与Northern印迹法类似，微阵列技术基于探针与样本核酸序列之间的互补结合原理。然而，与Northern印迹不同的是，在微阵列中，是将寡核苷酸探针固定于玻璃载片或芯片上。待测样本则来源于目标细胞或生物体中分离的RNA，经逆转录生成互补DNA（cDNA）。该cDNA可直接用荧光分子标记，或通过进一步扩增其数量以提高检测灵敏度。 在 体外 转录为cRNA，然后将样本杂交到芯片上。由于为不同应用设计的微阵列上的探针可能是“有义”链（即其序列方向与生物体表达的RNA相同）或“反义”链，研究人员必须确保样本的链方向性与探针互补。

芯片上每个基因特异性点的“原始”荧光强度数据可被定量和处理。这些数据可进一步进行统计学检验，如学生t检验，以确定目的基因在两种细胞类型或实验条件下荧光信号（即表达水平）是否存在显著差异。

研究人员还可以利用这些数据根据相似的表达模式对基因进行“聚类”或分组。例如，在比较两个细胞群体之间的表达模式时，某些基因可能表现出大致相同方向和幅度的表达变化，因此会被归为同一组。研究人员可以通过一种树状图或“树状图谱”（dendrogram）来展示这些关系，其中“分支”的高度和排列方式反映了基因表达模式的相似性或差异性。这类分析有助于揭示基因网络，因为“聚类”在一起的基因可能参与相同的生物通路。

在讨论了微阵列技术的原理之后，让我们来看一个典型的微阵列实验。

为了确保所提取RNA的质量，实验台面和设备应使用能够灭活RNase（即会降解RNA的酶）的化学试剂进行处理。随后从感兴趣的样本中提取并纯化RNA，并通过分光光度法测定其浓度和完整性。

将提取的样本RNA逆转录为cDNA，再转录为cRNA。接着，用荧光分子对样本进行标记并打断成片段，此时可再次检测其质量和数量，同时评估荧光标记的程度。

标记后的cRNA与“杂交溶液”混合，然后加载到微阵列芯片上。为促进有效杂交，在芯片上安装“杂交盖片”以形成“杂交室”。随后缓慢将杂交混合液加入芯片表面。操作过程中需避免产生气泡，因为气泡会干扰样本与微阵列特定区域的结合，导致假阴性信号。样本加样完成后，将芯片在适当温度下孵育长达24小时。

杂交完成后，从芯片上移除杂交盖片，洗去未结合的样本，并使用专用的载片离心机通过离心彻底干燥芯片。干燥后的芯片被插入微阵列扫描仪中，调整仪器参数，确保芯片上最强信号不发生饱和。随后对芯片进行扫描，生成整张芯片的图像。

芯片扫描完成后，将图像文件导入数据提取软件，并检查是否存在信号异常。从微阵列图像中提取的数据需经过一系列统计学处理，包括log₂转换，以便研究人员以基因表达倍数变化的形式进行数值化描述；以及标准化处理，用于校正不同微阵列芯片之间的信号差异。经过处理的数据可进一步用于深入分析。

现在我们已经演示了如何使用微阵列进行表达谱分析，接下来让我们看看微阵列在具体实验中的应用方式。

研究人员常使用微阵列来评估基因表达在生物过程（如细胞分化）中的变化。在此项研究中，科学家检测了三种代表视网膜发育不同阶段的人类细胞类型中微小RNA（microRNA）的表达水平。这些microRNA是长度为22个核苷酸的小分子RNA，参与基因表达的精细调控。通过比较这些细胞间的microRNA表达情况，研究人员能够鉴定出可能参与视网膜组织分化与发育的基因。

微阵列还可用于评估不同细胞或组织类型之间的表达差异。在本实验中，研究人员通过使大鼠接受电击，建立了创伤后应激障碍（post-traumatic stress disorder, PTSD）的啮齿类动物模型。随后从不同脑区收集神经元并提取RNA，利用微阵列技术鉴定这些神经元中线粒体相关基因的差异表达，从而揭示PTSD背后复杂的分子机制。

最后，研究人员还将微阵列应用于癌症研究，以期发现新的疾病生物标志物。在人类进化过程中，由于病毒感染，人类基因组中保留了被称为“内源性逆转录病毒”（endogenous retroviruses, ERVs）的病毒遗传序列，其中部分ERV仍处于活跃表达状态。在此项研究中，研究人员利用微阵列比较了前列腺癌组织与正常前列腺组织中ERV的表达水平。该方法帮助研究人员鉴定出多个在前列腺癌中表达上调的ERV，这些ERV有望成为用于疾病诊断的潜在生物标志物。

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