Name: 的转录分析ç。线虫 RNA测序数据通过炫套房的银河项目 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 学习使用Galaxy平台分析秀丽隐杆线虫RNA测序数据，无需生物信息学背景即可识别差异表达基因并进行基因本体分析。该方法适用于神经科学和基因组学研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者谨向开发 Galaxy 和 DAVID 的实验室、团队及个人致以诚挚感谢，正是他们的工作使新一代测序技术（NGS）在科学界得以广泛应用。同时感谢匹兹堡大学同事在我们进行生物信息学培训期间所提供的帮助与建议。本研究由艾略特医学基金会衰老领域新学者奖（AG-NS-0879-12）以及美国国立卫生研究院资助项目（R01AG051659）支持，资助对象为 AG。

<ol><li>Venter, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sequence+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The sequence of the human genome.</a> Science. 291 (5507), 1304-1351 (2001).</li>
<li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).</li>
<li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat%3A+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25 (9), 1105-1111 (2009).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).</li>
<li>Roberts, A., Trapnell, C., Donaghey, J., Rinn, J. L., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+RNA-Seq+expression+estimates+by+correcting+for+fragment+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving RNA-Seq expression estimates by correcting for fragment bias.</a> Genome Biol. 12 (3), R22(2011).</li>
<li>Roberts, A., Pimentel, H., Trapnell, C., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+transcripts+in+annotated+genomes+using+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Identification of novel transcripts in annotated genomes using RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2325-2329 (2011).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+analysis+of+gene+regulation+at+transcript+resolution+with+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Differential analysis of gene regulation at transcript resolution with RNA-seq.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 46-53 (2013).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Giardine, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galaxy%3A+a+platform+for+interactive+large-scale+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis.</a> Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).</li>
<li>Han, Y., Gao, S., Muegge, K., Zhang, W., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+Applications+of+RNA+Sequencing+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinform+Biol+Insights%22%5BJournal%5D)">Advanced Applications of RNA Sequencing and Challenges.</a> Bioinform Biol Insights. 9 (1), 29-46 (2015).</li>
<li>Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Anal+Chem+%28Palo+Alto+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing platforms.</a> Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif). 6, 287-303 (2013).</li>
<li>Yang, I. S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Whole+Transcriptome+Sequencing+Data%3A+Workflow+and+Software%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Inform%22%5BJournal%5D)">Analysis of Whole Transcriptome Sequencing Data: Workflow and Software.</a> Genomics Inform. 13 (4), 119-125 (2015).</li>
<li>Khatri, P., Draghici, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontological+analysis+of+gene+expression+data%3A+current+tools%2C+limitations%2C+and+open+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Ontological analysis of gene expression data: current tools, limitations, and open problems.</a> Bioinformatics. 21 (18), 3587-3595 (2005).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Shaye, D. D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OrthoList%3A+a+compendium+of+C.+elegans+genes+with+human+orthologs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">OrthoList: a compendium of C. elegans genes with human orthologs.</a> PLoS One. 6 (5), e20085(2011).</li>
<li>Consortium, C. eS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans%3A+a+platform+for+investigating+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li>
<li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+calibration+of+transcriptome+data+from+RNA-Seq+and+tiling+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison and calibration of transcriptome data from RNA-Seq and tiling arrays.</a> BMC Genomics. 11, 383(2010).</li>
<li>Mortazavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolding+a+Caenorhabditis+nematode+genome+with+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Scaffolding a Caenorhabditis nematode genome with RNA-seq.</a> Genome Res. 20 (12), 1740-1747 (2010).</li>
<li>Bohnert, R., Ratsch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rQuant.web%3A+a+tool+for+RNA-Seq-based+transcript+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">rQuant.web: a tool for RNA-Seq-based transcript quantitation.</a> Nucleic Acids Res. 38, Web Server issue W348-W351 (2010).</li>
<li>Lamm, A. T., Stadler, M. R., Zhang, H., Gent, J. I., Fire, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+RNA-seq+using+single-strand%2C+double-strand%2C+and+CircLigase-based+capture+yields+a+refined+and+extended+description+of+the+C.+elegans+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Multimodal RNA-seq using single-strand, double-strand, and CircLigase-based capture yields a refined and extended description of the C. elegans transcriptome.</a> Genome Res. 21 (2), 265-275 (2011).</li>
<li>Amrit, F. R., Ratnappan, R., Keith, S. A., Ghazi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+lifespan+assay+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The C. elegans lifespan assay toolkit.</a> Methods. 68 (3), 465-475 (2014).</li>
<li>Hsin, H., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+from+the+reproductive+system+regulate+the+lifespan+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signals from the reproductive system regulate the lifespan of C. elegans.</a> Nature. 399 (6734), 362-366 (1999).</li>
<li>Alper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+germ+line+regulates+distinct+signaling+pathways+to+control+lifespan+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans germ line regulates distinct signaling pathways to control lifespan and innate immunity.</a> J Biol Chem. 285 (3), 1822-1828 (2010).</li>
<li>Steinbaugh, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-mediated+regulation+of+SKN-1%2FNrf+in+response+to+germ+cell+absence%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Lipid-mediated regulation of SKN-1/Nrf in response to germ cell absence.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Lapierre, L. R., Gelino, S., Melendez, A., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+lipid+metabolism+coordinately+modulate+life+span+in+germline-less%5BTitle%5D)+AND+%22C.+elegans.+Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Autophagy and lipid metabolism coordinately modulate life span in germline-less.</a> C. elegans. Curr Biol. 21 (18), 1507-1514 (2011).</li>
<li>Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+major+fats+are+stored+in+vesicles+distinct+from+lysosome-related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles.</a> Cell Metab. 10 (5), 430-435 (2009).</li>
<li>Ghazi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+networks+that+mediate+signals+from+reproductive+tissues+to+influence+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Transcriptional networks that mediate signals from reproductive tissues to influence lifespan.</a> Genesis. 51 (1), 1-15 (2013).</li>
<li>Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+elongation+factor+that+links+signals+from+the+reproductive+system+to+lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genet. 5 (9), e1000639(2009).</li>
<li>Amrit, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAF-16+and+TCER-1+Facilitate+Adaptation+to+Germline+Loss+by+Restoring+Lipid+Homeostasis+and+Repressing+Reproductive+Physiology+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">DAF-16 and TCER-1 Facilitate Adaptation to Germline Loss by Restoring Lipid Homeostasis and Repressing Reproductive Physiology in C. elegans.</a> PLoS Genet. 12 (2), e1005788(2016).</li>
<li>Wang, M. C., O'Rourke, E. J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+metabolism+links+germline+stem+cells+and+longevity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans.</a> Science. 322 (5903), 957-960 (2008).</li>
<li>McCormick, M., Chen, K., Ramaswamy, P., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+genes+that+extend+Caenorhabditis+elegans%27+lifespan+in+response+to+reproductive+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">New genes that extend Caenorhabditis elegans' lifespan in response to reproductive signals.</a> Aging Cell. 11 (2), 192-202 (2012).</li>
<li>Kartashov, A. V., Barski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioWardrobe%3A+an+integrated+platform+for+analysis+of+epigenomics+and+transcriptomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">BioWardrobe: an integrated platform for analysis of epigenomics and transcriptomics data.</a> Genome Biol. 16, 158(2015).</li>
<li>Goncalves, A., Tikhonov, A., Brazma, A., Kapushesky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pipeline+for+RNA-seq+data+processing+and+quality+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A pipeline for RNA-seq data processing and quality assessment.</a> Bioinformatics. 27 (6), 867-869 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

现代生物学中Galaxy测序平台的重要性
Galaxy 项目在帮助没有生物信息学背景的生物学家快速高效地处理和分析高通量测序数据方面发挥了关键作用。这一公开可用的平台曾被认为是一项艰巨的任务，如今却使运行复杂的生物信息学算法来分析 NGS 数据变得简单、可靠且易于操作。除了提供广泛的生物信息学工具外，Galaxy 成功的关键还在于其用户界面的简洁性，能够以直观且无缝的方式整合复杂测序分析的各个方面。由于这些特点，Galaxy 分析流程已在生物学家群体中得到广泛应用，包括 C. elegans 研究人员。除了帮助用户熟悉 RNA-Seq 分析流程外，Galaxy 还有助于为初级生物学家建立数据分析的基本概念，并理解所涉及工具的原理。这些知识为用户进一步学习更复杂的生物信息学平台（如“R”和“Python”）奠定了基础。除 Galaxy 外，目前还有其他商业软件和开源工具可用于 RNA-Seq 分析。商业软件通常是独立的、易于使用的软件包，但对于不常使用 NGS 的个体研究者而言，费用可能较高。而开源平台（如 BioWadrobe34</...

利用弗雷德·桑格（Fred Sanger）的双脱氧核苷酸测序法完成的首次人类基因组测序耗时10年，耗资约30亿美元1,2。然而，自下一代测序（NGS）技术问世以来短短十余年，现已能够在两周内完成整个人类基因组的测序，成本仅为1000美元。新型NGS仪器以极高的效率实现了测序数据采集速度的持续提升，同时成本显著降低，正以前所未有的方式推动现代生物学的变革，使基因组测序项目迅速普及。此外，这些进展还极大地促进了其他多个领域的研究进展，例如通过RNA测序（RNA-Seq）进行基因表达分析、全基因组表观遗传修饰研究、DNA-蛋白质相互作用分析，以及对人类宿主中微生物多样性的筛查。基于NGS的RNA-Seq尤其能够以高准确性和高灵敏度全面识别和绘制转录组图谱，已取代微阵列技术成为表达谱分析的首选方法。尽管微阵列技术已被广泛使用，但其应用受限于依赖已知基因组信息的预设芯片，且存在交叉杂交、可可靠检测的表达变化范围有限等其他缺陷。相比之下，RNA-Seq能够检测已知和未知的转录本，同时由于其明确的DNA比对特性，背景噪声极低。RNA-Seq结合酵母、果蝇、线虫、鱼类和小鼠等模式生物所提供的丰富遗传工具，已成为近年来众多重要生物医学发现的基础。然而，仍存在诸多挑战限制了NGS在更广泛科学界的应用，包括数据存储、处理能力的局限，尤其是对海量测序数据进行有意义的生物信息学分析的困难。
测序技术的快速发展和数据的指数级积累，使得科研人员迫切需要能够访问、分析并理解这些信息的计算平台。早期的系统高度依赖计算机编程知识，而像美国国家生物技术信息中心（NCBI）这样的基因组浏览器虽然允许非编程人员访问和可视化数据，却无法进行复杂的分析。基于网络、开放获取的平台 Galaxy（<a href="https://galaxyproject.org/" target="_blank">https://galaxyproject.org/</a>）填补了这一空白，已成为一个有价值的分析流程，使研究人员能够处理高通量测序（NGS）数据，并执行从简单到复杂的多种生物信息学分析。Galaxy 最初由宾夕法尼亚州立大学的 Anton Nekrutenko 实验室和约翰斯·霍普金斯大学的 James Taylor 实验室建立并持续维护3。Galaxy 提供了广泛的计算任务，使其成为满足无数生物信息学需求的“一站式平台”，包括 RNA-Seq 研究中的所有步骤。用户可以在 Galaxy 的服务器上或本地计算机上进行数据处理。数据和工作流程可被重复使用和共享。在线教程、帮助页面以及专为 Galaxy 项目设立的 wiki 页面（<a href="https://wiki.galaxyproject.org/Support" target="_blank">https://wiki.galaxyproject.org/Support</a>）提供了持续的支持。然而，对于初次使用的用户，尤其是那些没有接受过生物信息学培训的用户，该分析流程可能显得复杂难懂，自学和熟悉过程可能耗时较长。此外，所研究的生物系统以及实验设计和方法的具体细节，会影响多个分析步骤中的决策，若无指导，这些环节可能难以掌握。
整体RNA-Seq Galaxy工作流程包括数据上传和质量检查，随后使用Tuxedo Suite4,5,6,7,8,9进行分析，该套件包含RNA-Seq数据分析各个阶段所需的一系列工具10,11,12,13,14。一个典型的RNA-Seq实验包括实验部分（样品制备、mRNA分离和cDNA文库构建）、下一代测序（NGS）以及生物信息学数据分析。这些部分的概述以及Galaxy流程中的具体步骤如图1所示。
<img alt="图1" src="/files/ftp_upload/55473/55473fig1.jpg" /> 
图1：RNA-Seq 工作流程概览。 本图展示了用于比较两种线虫品系（A 和 B，分别以橙色和绿色线条及箭头表示）基因表达谱的 RNA-Seq 实验所涉及的实验与计算步骤。图中用方框标出了所使用的 Galaxy 不同模块，并以红色标注了本实验方案中对应的步骤。各项操作的输出结果以灰色文字表示，文件格式以蓝色显示。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55473/55473fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
Tuxedo 软件套件中的第一个工具是一个名为“Tophat”的比对程序。它将高通量测序（NGS）输入的读段拆分为较小的片段，然后将其比对到参考基因组上。这种两步法过程确保了跨越内含子区域的读段（其比对可能因序列中断而被遗漏或失败）能够被识别并正确比对。这提高了测序覆盖度，并有助于发现新的剪接位点。Tophat 的输出结果包含两个文件：一个 BED 文件（包含剪接位点信息，包括基因组位置）和一个 BAM 文件（包含每条读段的比对细节）。接下来，使用 Tuxedo 软件套件中的下一个工具“Cufflinks”，将 BAM 文件与参考基因组进行比对，以估算每个样本内各个转录本的丰度。Cufflinks 通过扫描比对结果，报告跨越每个基因所有可能剪接异构体的全长转录片段（即“transfrags”），从而为每个测序样本生成一个“转录组”（即每个基因所产生的所有转录本的集合）。随后，这些 Cufflinks 生成的转录组组装结果与参考基因组合并，利用下一个工具“Cuffmerge”生成一个统一的注释文件，用于后续的差异分析。最后，“Cuffdiff”工具通过将各个样本的 TopHat 输出结果与最终的 Cuffmerge 输出文件进行比较，来检测样本之间的差异基因表达（图1）。Cufflinks 使用 FPKM/RPKM（每百万比对读段中每千碱基转录本所对应的片段数/读段数）值来报告转录本丰度。这些数值对原始 NGS 数据进行了深度（来自样本并比对到参考基因组的平均读段数）和基因长度（不同基因长度不同，因此必须对基因长度进行标准化，才能比较不同基因间的表达水平）的归一化处理。FPKM 和 RPKM 本质上相同，其中 RPKM 用于单端 RNA-Seq（每个读段对应一个片段），而 FPKM 用于双端 RNA-Seq，因为它考虑了两个读段可能来自同一片段的情况。最终，这些分析的结果是一份在不同实验条件和/或菌株之间差异表达的基因列表。
当一次成功的 Galaxy 运行完成并生成“基因列表”后，下一步的合理操作是进行更深入的生物信息学分析，以从数据集中推导出有意义的知识。为此，已涌现出多种软件包，其中包括公开可用的基于网络的计算工具，例如 DAVID（功能注释、可视化与综合发现数据库）15。DAVID 通过将上传的基因列表与其整合的生物学知识库进行比对，揭示与该基因列表相关的生物学注释，从而帮助研究人员为高通量研究产生的大规模基因列表赋予生物学意义。随后进行富集分析，即 统计学检验，以确定在基因列表中是否存在显著过表达的生物学过程或基因类别。由于具备广泛整合的知识库和强大的分析算法，DAVID 能够帮助研究人员识别基因组学衍生“基因列表”中显著富集的生物学主题，因而成为广受欢迎的选择10,16。其额外优势还包括能够处理来自任意测序平台生成的基因列表，以及提供高度用户友好的操作界面。
线虫 Caenorhabditis elegans 是一种遗传学研究的模式生物，以其诸多优势而广为人知，例如个体小、身体透明、体型结构简单、易于培养，并且非常适合进行遗传学和分子生物学的解析。该线虫具有一个基因组小、结构简单且注释完善的特点，其中多达40%的基因与已知的人类同源基因保守17。事实上，C. elegans 是首个完成全基因组测序的多细胞真核生物18，也是最早利用RNA-Seq技术绘制生物体转录组的物种之一19,20。早期的线虫研究涉及多种高通量RNA捕获、文库构建与测序方法以及生物信息学分析流程的实验，推动了该技术的发展21,22。近年来，基于RNA-Seq的线虫实验已变得普遍。然而，对于传统的线虫生物学家而言，RNA-Seq数据的计算分析仍构成主要障碍，限制了该技术更广泛和更深入的应用。
本文介绍了一种利用 Galaxy 平台分析来自 C. elegans 的高通量 RNA-Seq 数据的实验方案。对于许多初次使用或小规模用户而言，开展 RNA-Seq 实验最具成本效益且最直接的方法是在实验室中提取 RNA，并利用商业机构（或内部）的下一代测序（NGS）平台完成测序 cDNA 文库的构建及测序工作。因此，我们首先详细描述了用于 RNA-Seq 的 C. elegans RNA 样本的提取、定量和质量评估步骤。接着，我们提供了使用 Galaxy 界面对 NGS 数据进行分析的逐步操作指南，包括测序后质量控制检测、序列比对、转录本组装以及基因表达差异定量。此外，我们还提供了利用 DAVID 工具对 Galaxy 分析所得基因列表进行生物学功能富集研究的操作说明。作为工作流程的最后一步，我们介绍了将 RNA-Seq 数据上传至公共数据库（如 NCBI 的 Sequence Read Archive（SRA））（<a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra" target="_blank">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra</a>）的方法，以便科研界自由访问。总体而言，我们期望本文能为首次开展 RNA-Seq 实验的线虫生物学家以及常规进行少量样本分析的用户，提供全面且充分的技术指导。

<table><tbody><tr><td>RNase 喷雾剂&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-402-178</td><td></td></tr><tr><td>Trizol&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>Sonics Vibra Cell&amp;nbsp;</td><td>VCX130</td><td></td></tr><tr><td>离心机&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5415C</td><td></td></tr><tr><td>氯仿&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>2-丙醇&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416P-4</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Decon Labs</td><td>2705HC</td><td></td></tr><tr><td>无RNase水&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP561-1</td><td></td></tr><tr><td>生物分析仪&amp;nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Mac/PC</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

c. elegans rna测序数据通过galaxy平台上的tuxedo软件套件进行转录组分析

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

下一代测序（NGS）技术彻底改变了生物学研究的性质。其中，RNA测序（RNA-Seq）已成为基因表达分析和转录组定位的有力工具。然而，处理RNA-Seq数据集需要复杂的计算专业知识，对生物学研究人员而言存在固有的挑战。这一瓶颈已通过开放获取的Galaxy项目得到缓解，该平台使不具备生物信息学技能的用户也能分析RNA-Seq数据；此外，功能注释、可视化与集成发现数据库（DAVID）是一套基因本体（GO）术语分析工具，有助于从大规模数据集中提取生物学意义。然而，对于初次使用者和生物信息学初学者而言，自主学习并熟悉这些平台可能耗时且令人望而生畏。本文描述了一种简明的工作流程，旨在帮助C. elegans研究人员分离线虫RNA，开展RNA-Seq实验，并利用Galaxy和DAVID平台进行数据分析。本实验方案提供了逐步操作指南，介绍如何使用Galaxy的各种模块来获取原始NGS数据、进行质量控制检查、序列比对以及差异基因表达分析，并在每一步中为用户提供参数设置指导，最终生成基因列表，随后可在DAVID中筛选特定基因类别或生物学过程的富集情况。总体而言，我们预期本文将为首次开展RNA-Seq实验的C. elegans研究人员以及需处理少量样本的常规使用者提供实用参考。

在 C. elegans 中，消除生殖系干细胞（GSCs）可延长寿命、增强应激耐受性，并提高体脂含量24,28。GSCs 的缺失（无论是通过激光消融还是如 glp-1 等突变引起）可通过激活一系列转录因子网络来延长寿命29。其中一个因子 TCER-1 编码人类转录延伸和剪接因子 TCERG1 的线虫同源蛋白30。以下代表性结果展示了在我们近期发表的研究中31，如何利用 RNA-Seq 鉴定在生殖系缺失后受 TCER-1/TCERG1 调控的基因表达变化。我们比较了年龄匹配的第2天成虫 glp-1 和 tcer-1;glp-1 突变体的转录组。对于每种品系，使用第1节所述方案从两个生物学重复样本（共四个样本）中分离 mRNA。RNA 样本被送往商...

Galaxy 和 DAVID 已成为广受欢迎的工具，使没有生物信息学背景的研究人员也能够分析和解读 RNA-Seq 数据。本文描述了一项针对 C. elegans 研究人员的实验方案，用于开展 RNA-Seq 实验，利用 Galaxy 获取并处理数据集，并通过 DAVID 从基因列表中获得有意义的生物学信息。

C. elegans RNA测序数据通过Galaxy平台上的Tuxedo软件套件进行转录组分析

下一代测序（NGS）技术彻底改变了生物学研究的性质。其中，RNA测序（RNA-Seq）已逐渐兴起……

本实验方案的总体目标是帮助缺乏生物信息学专业知识的秀丽隐杆线虫（C.elegans）研究人员开展RNA测序实验，并利用开放获取平台Galaxy分析数据。该方法有助于分析复杂的高通量测序数据，揭示C.elegans表型背后的转录组特征。该技术的主要优势在于，即使没有生物信息学背景的科研人员也能分析原始测序数据，获得差异表达基因列表及其相关的基因本体（gene ontology）术语。尽管该方法专门针对秀丽隐杆线虫（C.elegans）测序数据的细微特征而设计，但也可应用于其他生物体及生物学背景，特别是在需要分析基因组关键转录变化的情况下。本视频介绍 Galaxy 分析流程的基于网页的使用方法。如条件允许，建议在本地运行该工作流程。请根据维基页面上的说明下载并安装 Galaxy。在使用 Galaxy 主页上提供的“从此处开始”教程后，请观看本视频。用户必须熟悉 Galaxy 的用户界面以及工作流程中所使用的工具。首先，单击页眉面板中的“分析数据”以进入分析主页视图。右上角的进度条用于监控已使用的磁盘空间。接下来，在左侧面板中访问工具菜单，然后单击 NGS RNA 分析。这提供了使用分析RNA序列数据所需所有工具的选项。现在，开始一个新的分析历史记录。转到右侧的历史记录面板。单击齿轮图标，然后从弹出菜单中选择“创建新项目”选项。接着，在历史记录下输入名称以标识该分析。要继续操作，请转到工具菜单，在“获取数据”下点击“上传文件”功能，以上传原始的 fastq 文件。任务在分析界面打开后，单击“选择本地文件”或“选择FTP文件”，浏览并选择相应的序列数据。默认情况下，Galaxy将自动检测文件类型。然后从下拉菜单中选择生物体，本例中为C.elegans。接下来，单击“开始”以启动数据上传。文件上传完成后，该操作将保存在历史记录面板中，可从中选择并访问数据。现在，通过进入NGS质控与处理菜单，选择fastq groomer工具，然后在“待处理文件”下选择相应文件，将fast队列格式的文件逐个转换为fastq Sanger格式。选择适当的输入快速等值分数类型，并使用默认参数运行工具。现在可以分析数据文件。在整个实验方案中，请特别注意所使用的文件格式和测试参数。这些知识对于排查检测失败及其他问题非常有价值。可在继续操作前进行质量控制检测。文本方案中提供了有关运行这些检测的详细信息。当文件准备好后，首先打开NGS RNA分析部分，然后点击top hat工具，以对测序数据进行比对分析。在下拉菜单中，回答“这是单端还是双端数据？”的问题。接下来，选择适当的fastq文件。在下一个下拉菜单中选择使用内置基因组，并选择参考的 C.elegans 基因组数据。其他所有参数选项均选择默认值，然后点击执行。为了估算数据集中转录本的相对丰度，请在 NGS RNA 分析部分选择 cufflinks 工具，并在第一个下拉菜单中选择来自 tophat 分析得到的已比对的 accepted hits BAM 格式文件。从第二个下拉菜单中，将参考注释设置为包含当前基因组数据的 GTF 文件。当出现执行偏差校正选项时，选择“是”，并使用默认设置运行任务。接下来，从 NGS RNA 分析菜单中打开 cuffmerge 工具，以合并为所有 RNA 测序样本生成的转录本。工具中的第一个框将加载上一步使用 cufflinks 生成的所有 GTF 文件。现在，选择每种菌株或测试条件（包括同种菌株条件的生物学重复）的组装转录本文件。在“使用参考注释”选项中选择“是”，并选择参考基因组数据文件。接下来，选择“使用序列数据”选项为“是”。系统将自动检测并选择合适的参考基因组。其余所有参数保持默认设置，然后点击执行。将生成单个 GTF 文件。如需比较多个菌株或条件，请返回 NGS RNA 分析部分并选择 cufflinks 工具中的 cuffdiff 工具。然后，在 cuffdiff 工具的 transcripts 菜单中选择来自 cuffmerge 的合并输出文件。然后输入两个条件的标签。对于每个条件，进入“replicates”并选择与该条件下不同生物学重复对应的 TopHat 输出的已接受比对结果文件。要同时选择多个文件，请按住 command 或 control 键。选择文件后，使用默认参数设置，点击执行以运行任务。在历史面板中生成的基因差异检测框内，点击保存图标下载差异表达数据。首先，从网站访问 David。从网页页眉中选择“开始分析”。将从 Galaxy 获得的基因列表复制到 A 框中，在本示例中选择基因标识符为 WormBase 基因 ID。然后在问题三的列表类型中选择“基因列表”，并点击“提交列表”图标。此时将打开分析向导主页，从中可选择 DAVID 任务。本视频片段介绍了其中的一些选项。首先，选择功能注释聚类以进入摘要页面。保持注释类别的默认设置，然后点击功能注释聚类。此选项会根据富集得分对相似的注释术语生成聚类。现在，返回分析向导，选择功能注释图表选项，以鉴定与基因列表显著相关的生物学术语。DAVID 的一个重要功能是可生成功能注释表格。此列表展示了与基因相关的所有注释，但不显示任何统计学计算结果。这对于逐个基因的分析以及查找特定感兴趣基因非常有用。另一个值得查看的 DAVID 工具是基因功能分类。该选项根据基因的富集得分，将基因分类为一系列功能相关的基因组列表。所述实验方案用于鉴定在生殖系缺失后由 tcer-1 调控其表达的基因。通过比较长寿的生殖系缺失 glp-1 突变体与同样缺失生殖系但不表现出寿命延长的 tcer-1 glp-1 双突变体的转录组，实现上述目的。对序列进行质量检测后，未发现低质量的读段，GC 含量为 48% 至 49%，序列读长恒定为 51 个碱基对。样本的基因组覆盖度估计在 7 倍至 11 倍之间。Galaxy 可用于整合每种菌株两个重复样本的 NGS 数据，并进行差异分析，从而生成基因列表，以突出显示全基因组表达谱。总体而言，在两种菌株之间，共有835个基因差异表达，采用的P值截断值为0.05。对上调基因进行功能注释分析，发现四个富集得分较高的注释簇。其中富集最显著的是细胞色素P450和异生物质反应相关基因，其次是参与脂质修饰的基因。对下调靶基因的功能注释聚类也鉴定出多种注释聚类，其中包括细胞骨架功能、生长的正向调控、繁殖以及衰老相关的富集聚类。Galaxy 分析流程为众多生物学领域的研究人员提供了快速高效分析大规模基因表达变化的途径。观看本视频后，您应能够开展 RNA 定向实验，并利用 Galaxy 流程分析原始的高通量测序数据。您还应能够使用 DAVID 平台从 Galaxy 数据中提取具有生物学意义的信息。

transcriptomic-analysis-c-elegans-rna-sequencing-data-through-tuxedo

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

的转录分析<em&gt;ç</em&gt;。<em&gt;线虫</em&gt; RNA测序数据通过炫套房的银河项目

本视频展示了在转染后对分离的鸡胚脊髓样本进行全转录组分析的基本步骤 在卵内...

电穿孔鸡胚脊髓中差异基因表达的RNA-Seq分析

RNA-Seq 分析在揭示非模式生物适应性状分子基础方面正变得越来越重要。本文介绍了一项从蚊子饲养、RNA测序到RNA-Seq数据的生物信息学分析，用于鉴定滞育与非滞育状态的白纹伊蚊（Aedes...

一种用于亚洲虎蚊Aedes albopictus光周期滞育研究的RNA-seq实验与生物信息学分析方案

采用RNA测序和生物信息学分析方法，鉴定小鼠EML细胞中Lin-CD34+和Lin-CD34-亚群内显著差异表达的转录因子。这些转录因子可能在调控自我更新的Lin-CD34+细胞与部分分化的Lin-CD34-细胞之间的转换过程中发挥重要作用。...

通过RNA测序分析鉴定调控EML造血前体细胞自我更新与分化的关键因子

我们介绍一种基于靶向RNA测序的方法，包括制备带索引的cDNA文库、使用定制探针进行杂交与捕获，以及数据分析，以检测特定转录本的基因表达、突变和基因融合。靶向RNA测序可在台式测序仪上对选定转录本进行经济高效且快速的评估。...

靶向RNA测序实验用于分析基因表达与基因组变异

本方案描述了为基于微滴的高通量单细胞RNA测序制备健康的成年哺乳动物单细胞所需的常规操作步骤及质量控制检测。同时提供了测序参数、序列比对以及下游单细胞生物信息学分析方法。...

基于液滴条形码的成年哺乳动物组织单细胞转录组学

本文介绍了一种多重化的单细胞mRNA测序方法，用于分析小鼠胚胎组织中的基因表达。基于微滴的单细胞mRNA测序（scRNA-Seq）方法结合多重化策略，可同时对来自多个样本的单细胞进行分析，显著降低了试剂成本，并最大限度地减少了实验批次效应。...

小鼠胚胎细胞多重单细胞mRNA测序分析

内在无序结构域对致癌融合转录因子的功能具有重要作用。为了靶向治疗这些蛋白，需要更深入地理解这些结构域所采用的调控机制。本文中，我们利用转录组学方法，绘制尤因肉瘤中内在无序的 EWS...

利用转录组学分析绘制无序致癌转录因子的结构-功能关系

本实验方案的目的是利用RNA测序数据研究候选基因的进化与表达。...

利用RNA-seq研究分子进化与基因表达的生物信息学分析流程

本文介绍了一种从原始测序数据到功能分析的完整RNA测序转录组数据分析流程，包括质量控制和预处理步骤，以及高级统计分析方法。...

高通量转录组分析用于研究宿主-病原体相互作用

本研究提出了一种空间Trekker–CUT&amp;#38;Tag多组学方案，将组织切片的直接空间条形码技术与单细胞多组学分析相结合。该方法能够同时实现基因表达和组蛋白H3K27ac修饰的空间解析单细胞谱型分析，为在组织微解剖背景下理解基因调控机制提供了深入见解。...

空间分辨的、整合式单细胞多组学分析：在冷冻组织切片中对转录组与表观基因组靶标进行联合检测

学习使用Galaxy平台分析秀丽隐杆线虫RNA测序数据，无需生物信息学背景即可识别差异表达基因并进行基因本体分析。该方法适用于神经科学和基因组学研究。

C. elegans RNA测序数据通过Galaxy平台上的Tuxedo软件套件进行转录组分析

探索更多视频