Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO•) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO• Signals in Single Cells

这种成像方法的总体目标是使用一类新型基因编码的荧光一氧化氮探针 geNOps 在单个细胞水平上实时监测一氧化氮信号。考虑到一氧化氮在生物学和生理学中的重要性，自发现以来，人们一直希望这种分子在细胞甚至亚细胞水平上可视化。我们使用新颖的、相当简单的、基于荧光蛋白的探针 geNOps 来可视化一氧化氮信号。

geNOps 通过荧光猝灭直接立即对一氧化氮做出反应。这意味着您可以监测单细胞中一氧化氮生成、扩散和降解的实时动力学。geNOps 的主要优点是，您实际上可以使用传统的荧光显微镜以高空间和时间分辨率观察一氧化氮信号。

通过在室温下用每孔 1 毫升的铁 （II） 增强剂溶液替换内皮细胞系或 HEK293 细胞的储存缓冲液来开始此过程。在黑暗中孵育细胞 20 分钟。铁加载程序对于获得探针的完全响应性至关重要，并且可能适用于不同的细胞类型和应用。

然后，用储存缓冲液洗涤细胞一次，并在室温下将每个孔与 2 mL 储存缓冲液孵育至少两个小时，以使细胞平衡。然后，在一毫升储存缓冲液中用 3.3 微摩尔的 Fura-2AM 替换储存缓冲液。保护细胞避光，并孵育 45 分钟。

45 分钟后，用储存缓冲液洗涤细胞两次，然后再次孵育至少 30 分钟，以使细胞平衡。要开始该程序，首先在金属灌注室中固定涂有内皮细胞系或 HEK293 细胞的 30 毫米盖玻片。打开成像系统，然后将金属灌注室放在显微镜上。

将 Influx 管连接到缓冲储液器，然后打开灌注系统。现在将外流液连接到真空泵，确保流量一致并避免盖玻片排空。使用半自动灌注系统，使用生理钙缓冲液开始重力驱动灌注。

然后，使用相应的软件定义成像设置。选择 340 纳米和 380 纳米的激发波长进行 Fura-2 成像，选择 480 纳米的激发波长进行激发 G-geNOp。接下来，通过移动显微镜的 xyz 表来选择成像区域，直到几个荧光细胞聚焦。

然后，定义感兴趣的区域。为每个成像区域绘制覆盖几个完整单个荧光细胞的区域。然后，定义一个大小相似的背景区域。

开始在具有电动样品台和单色光源的倒置高级荧光显微镜上收集数据。或者，Fura-2AM 分别在 340 纳米和 380 纳米处激发细胞，对于 G-geNOp，分别在 480 纳米处激发细胞。设置相应的曝光时间，以便随着时间的推移可以检测到所有通道的清晰荧光信号。

使用 CCD 相机收集 Fura-2AM 的 510 纳米发射光，G-geNOp 的发射光为 520 纳米，滤光片组由 500 纳米激发器、495 纳米二向色性和 510-520 纳米发射器组成。然后，每 3 秒录制一帧。在生理钙缓冲液中记录前三分钟，以获得相应荧光信号的基线。

一旦观察到稳定的基线荧光，则改用 100 微摩尔组胺或含有生理钙缓冲液的 ATP 刺激细胞 3 分钟。随后，切换回不含组胺或 ATP 和 L-NNA 的生理钙缓冲液 5 分钟，以去除细胞中的化合物。然后，使用灌注系统在生理钙缓冲液中施用 10 微摩尔 NOC-7 两分钟。

一氧化氮供体强烈影响 G-geNOp 荧光，它通常会响应 10 微摩尔 NOC-7 使细胞减少 20% 以上。在 EA.hy926 细胞中，与激动剂诱导的 G-geNOp 荧光淬灭相比，NOC-7 效应更强。然后，用生理钙缓冲液洗掉一氧化氮释放化合物约 10 分钟，并在恢复基础荧光后停止记录。

此处显示的是负载 Fura-2AM 的表达 G-geNOp 的 EA.hy926 细胞的代表性宽场荧光图像。这里是响应 100 微摩尔组胺的 Fura-2 和 G-geNOp 信号同时记录的代表性时间进程。如图所示，使用灌注系统在 3 分钟后去除组胺。

这些曲线代表了瞬时表达 G-geNOp 的单个 Fura-2AM 负载的内皮细胞的胞质钙和一氧化氮信号的同步记录。在含钙缓冲液中用 100 微摩尔组胺刺激细胞 3 分钟。这里显示的是 EA.hy926 细胞随时间同步记录的钙和一氧化氮信号，该细胞在测量前用 500 微摩尔 L-NNA 预处理。

在 2 毫摩尔钙存在下用 100 微摩尔组胺处理细胞。该图显示了代表胞质一氧化氮信号响应 1 微摩尔 ATP 后用 100 微摩尔 ATP 刺激第二次细胞的平均曲线。掌握后，该技术可让您以最少的工作量实时可视化一氧化氮信号。

我相信这项技术将为研究人员探索和重新研究各种细胞模型中的一氧化氮信号铺平道路。观看此视频后，您应该对如何使用 geNOps 技术在模型系统中对一氧化氮进行实时成像有了很好的了解。