Name: 在嵌合斑马鱼胚胎的个别视网膜祖细胞转基因表达的体内成像来研究细胞非自治的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 了解利用嵌合斑马鱼胚胎研究视网膜祖细胞非自主信号传导的方法。通过活体成像和基因敲低技术，实时追踪单个祖细胞在神经发生过程中的命运决定机制。

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本工作获得了澳大利亚研究委员会发现早期职业研究员项目（ARC DECRA）对 PRJ 的资助（DE120101311）以及德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG）对 LP 的研究资助（PO 1440/1-1）。澳大利亚再生医学研究所得到了维多利亚州政府和澳大利亚联邦政府资金的支持。我们感谢 Jeremy Ng Chi Kei 博士，本文所述实验由其完成，相关内容已发表于 Kei 等，2016年。我们感谢Higashijima教授提供的转基因鱼，感谢Turner教授和Rupp教授提供pCS2+质粒，感谢Wilkinson博士构建H2B-RFP和H2A-GFP载体。我们感谢莫纳什大学FishCore设施工作人员对实验动物的悉心照料。

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<li>Kimura, Y., Satou, C., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V2a+and+V2b+neurons+are+generated+by+the+final+divisions+of+pair-producing+progenitors+in+the+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">V2a and V2b neurons are generated by the final divisions of pair-producing progenitors in the zebrafish spinal cord.</a> Development. 135, 3001-3005 (2008).</li>
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<li>Zou, J., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+GFP-expressing+blastomeres+for+live+imaging+of+retinal+and+brain+development+in+chimeric+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of GFP-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

了解邻近细胞在多大程度上影响关键细胞命运决定因子表达的时间，对于高效指导胚胎干细胞或诱导性多能干细胞分化为特定的终末分化细胞类型甚至模式化组织至关重要。此外，在活体动物的发育细胞中研究这些分子事件，还能提供与这些事件相关的特定细胞环境的动态（时间和空间）信息。 体内此类研究在所有脊椎动物模型中均难以轻易实现。
在本方案中，利用易于操作的斑马鱼胚胎作为脊椎动物模型，在体内研究脊椎动物视网膜这种结构相对简单但高度有序的三维组织中的相关问题。in vivo。以验证一个假说为例：耗竭某一特定视网膜细胞类型会影响视网膜前体细胞的基因表达时序和发育命运。我们还可以利用供体细胞标记物进行逆向追踪，以评估特定细胞在转基因表达之前多久经历了最后一次分裂，或评估该细胞在不同环境中转基因表达之前各个阶段的总体行为（例如，迁移）。针对这些研究，本文介绍了一系列相对易于操作的技术组合，包括吗啉代介导的基因敲低、细胞移植和活体成像。在移植方法方面，本方案提出了一种新型、相对简便且成本较低的移植装置，并展示了该操作系统的便捷性。
<p class="...

可视化重要发育过程的能力在一种 体内 脊椎动物的特性使得斑马鱼成为研究正常生理和疾病状态的关键模型（综述见 1,2特别是神经视网膜作为中枢神经系统中易于获取的部分，因其结构高度有序且相对简单，以及在脊椎动物物种间高度保守的神经元类型，适合用于神经发生研究。 3细胞行为的动态过程，如增殖、细胞周期退出、不对称细胞分裂、命运决定、分化以及神经环路形成，可在整个视网膜发生过程中进行追踪，斑马鱼中央视网膜的这一过程在受精后3天（dpf）即已完成 4,5,6,7.
此外，可以在斑马鱼视网膜中同时评估上述各个阶段中不同基因的功能需求，这一优势优于其他脊椎动物模型——在那些模型中，基因敲除技术所导致的表型只能通过固定组织的死后检查进行评估。特别是利用转基因品系，我们可以在视网膜中可视化并监测荧光蛋白作为报告基因的表达，从而获得与特定神经元细胞类型发生相关的基因表达时间分辨率。由于斑马鱼发育迅速，这些事件可在整个发育期间被实时观察，从而更深入地揭示基因表达在神经元细胞身份获得及细胞行为中的时间重要性。
最后，这些方法可与斑马鱼中的嵌合体制备技术（通过移植实现）高效结合，从而深入揭示基因功能的两个关键方面。首先，通过观察来自供体胚胎的移植细胞（在该胚胎中特定基因被敲低），当这些细胞在未标记的野生型环境中发育时，可使我们以细胞自主性的方式获得有关基因功能的重要信息。这有助于深入理解视网膜命运决定因子在正常表达这些因子的前体细胞中的功能。例如，通过分析那些无法从这些基因产生功能性蛋白的前体细胞的发育命运结局，即可阐明上述机制4,6,8,9。利用该方法，我们已证明许多命运决定因子（例如，Vsx1、Atoh7、Ptf1a、Barhl2）以细胞自主性方式发挥作用，驱动特定视网膜神经元命运的建立；基因表达缺失主要导致细胞命运转换，即基因敲低的细胞通过采用替代的命运路径而保持存活4,6,7,10。其次，此类嵌合体实验可用于评估野生型前体细胞在不同遗传环境中发育时的行为变化。例如，通过比较通常表达目标基因（及报告转基因）的野生型细胞在野生型与经遗传操作的宿主环境（例如，基因敲除/敲低）中的发育过程，可评估宿主环境对基因表达和细胞命运的影响。已有研究表明，宿主环境中某些神经元类型的缺失会以非细胞自主性方式影响野生型前体细胞的行为，使其倾向于分化为数量不足或缺失的神经元类型4,7,11,12。鉴于视网膜神经元通过特定神经元命运决定基因（命运基因）的时序性表达，以保守的组织发生顺序产生（命运基因表达）（综述见13），我们利用这些方法证明了当野生型前体细胞在细胞组成异常的视网膜宿主环境中发育时，其命运基因表达的时序如何受到影响。本文中，我们概述了这些方法，以证明相对标准且广泛应用的技术组合如何实现对发育中视网膜前体细胞命运基因表达时序的深入研究8,9。
本方案描述了一种将延时成像与胚胎移植操作简便性相结合的实验方法 离体 利用斑马鱼胚胎发育过程，追踪整个发育性视网膜发生期间单个马赛克标记细胞的动态变化。通过在宿主胚胎、供体胚胎中单独或联合进行功能基因操作，或两者均不操作，可评估基因功能的细胞自主性。该方法可广泛适用于其他研究体系中类似科学问题，前提是这些体系适用于本文所述各项技术组分。

<table><tbody><tr><td>琼脂糖</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td>琼脂糖包被培养皿可提前数日制备，用封口膜密封以防止干燥，并于4 &amp;#176;C保存</td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9414-100G</td><td>可制备较大体积，微波加热溶解后置于40 &amp;#176;C水浴中维持液态。可分装为1 mL等份（每份用于一组胚胎的固定）</td></tr><tr><td>无丝硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>SDR Scientfic</td><td>30-0035</td><td>可使用直径相似的替代品&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带丝硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>SDR Scientfic</td><td>30-0038</td><td>可使用直径相似的替代品&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>玻璃培养皿（60 mm直径）</td><td>Science Supply</td><td>1070506</td><td>可使用任意尺寸的玻璃替代品</td></tr><tr><td>注射管（2 m）</td><td>Eppendorf</td><td>524616004</td><td>在移植过程中连接针头夹持器与注射器</td></tr><tr><td>显微注射模具（带楔形突起的塑料模具）</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>PT-1</td><td>可使用形状相似的替代品</td></tr><tr><td>微针夹持器</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td>可使用任何适配注射针外径的替代品</td></tr><tr><td>显微注射仪</td><td>Narishige 或 Eppendorf Femtojet</td><td></td><td>使用气体压力的气动注射仪</td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Coherent Scientific</td><td>M330IR</td><td>可使用类似替代品</td></tr><tr><td>微量加样吸头</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma</td><td>M5904-500ML</td><td></td></tr><tr><td>拉针仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>Model P-2000</td><td>本实验所用拉针参数为：H 430，Fil 4，Vel 50，Del 225，Pul 75。只要能获得合适针尖尺寸，任何拉针仪均可使用</td></tr><tr><td>封口膜</td><td>Interpath</td><td>PM996</td><td>任何石蜡膜均可</td></tr><tr><td>塑料巴斯德吸管</td><td>Samco Scientific</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>玻璃巴斯德吸管</td><td>Hirschmann Laborgeraete</td><td>9260101</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Sigma</td><td>P5942-25MG</td><td>&amp;nbsp;蛋白酶XIV型</td></tr><tr><td>N-苯基硫脲</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>PTU具有毒性，可配制成储备液以避免频繁接触粉末，购买或使用前请查阅材料安全数据表（MSDS）</td></tr><tr><td>Qiaquick凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>可使用任何可用于纯化DNA的替代试剂盒</td></tr><tr><td>RNeasy Mini试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>可使用任何可用于纯化RNA的替代试剂盒</td></tr><tr><td>SP6 mMessage体外转录试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>AM1340</td><td>可使用任何可用于SP6介导DNA转录的替代试剂盒</td></tr></tbody></table>

体内成像嵌合体斑马鱼胚胎中单个视网膜前体细胞的转基因表达以研究细胞非自主性影响

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

遗传学和实验技术上的优势使斑马鱼成为研究基因操作后果的关键模式脊椎动物 体内 在快速发育期间，可研究多种过程，包括细胞增殖、基因表达、细胞迁移和形态发生。重要的是，通过移植技术可轻松生成嵌合体，从而实现对单个细胞在宿主环境影响下的嵌合标记与追踪。例如，通过结合对宿主胚胎的功能性基因操作例如， 通过吗啉寡聚核苷酸显微注射和活体成像，可评估外源性、非细胞自主信号（由遗传修饰的环境提供）对单个移植供体细胞的影响。本文展示了如何利用该方法比较不同遗传背景宿主环境中荧光报告基因表达的起始时间，以此作为细胞命运决定时机的间接指标。
本文中，我们提供了对斑马鱼胚胎进行显微注射以标记供体细胞并在宿主胚胎中实现基因敲降的实验方案，描述了用于制备嵌合胚胎的移植技术，以及制备和运行相关实验的步骤 在体 多胚胎延时共聚焦成像。特别是，在比较基因表达起始等事件的时间进程时，多位置成像至关重要。这需要同时对多个对照组和实验组胚胎进行数据采集。只要能够根据已建立的胚胎命运图谱准确定位移植位置，该方法可轻松拓展应用于任何适合活体成像的器官或组织中外源性影响因素的研究。

本研究提出了一种实验方案，用于评估野生型视网膜前体细胞在形态干扰宿主胚胎内发育时基因表达时序的变化。实验所用宿主胚胎为Ptf1a形态干扰体，其缺乏视网膜中晚期生成的水平细胞和无长突细胞7,26。作为对照，还设置了对照组宿主胚胎，该组胚胎注射了标准对照吗啉代寡核苷酸。
由于中枢神经系统（包括视网膜）中不同类型的神经元发生具有高度保守的组织发生顺序27,28,29,30,31，后续细胞命运的进展可能依赖于早期出生神经元...

在不同遗传背景下对单个野生型视网膜前体细胞进行活体追踪，可评估细胞非自主性信号在神经发生过程中的作用。本文结合基因敲低、通过胚胎移植构建嵌合体以及 体内 采用延时共聚焦成像技术实现此目的。

遗传学和技术上的优势使斑马鱼成为一种关键的脊椎动物模型生物，可用于追踪基因操作所带来的各种效应……

这些实验方案的总体目标是研究基因表达的变化（无论是在发育中的细胞内还是在其周围环境中）如何影响发育过程中的时间进程。该方法有助于回答一些关键问题，例如细胞命运决定的时间调控是由细胞自身内部表达的基因自主控制，还是由邻近细胞中非自主表达的基因所调控。该技术的主要优势在于能够在体内脊椎动物中追踪单个前体细胞，同时观察这些细胞在遗传背景不同的环境中发育的过程。本实验操作将由我实验室的研究助理 Stefanie Dudczig 演示。按照文本方案准备好斑马鱼胚胎以及含有吗啉代寡核苷酸（Morpholinos）或 mRNA 的显微注射针后，将针尖浸入培养皿中的一滴矿物油内。通过踩下脚踏开关来测定注射体积，并调节气体压力和/或持续时间，直至注射体积相当于一纳升（1 nL），可通过微米载玻片或目镜测微尺进行测量确认。将一张显微镜载玻片放入培养皿中，用移液管沿载玻片边缘滴加单细胞期胚胎。接着，使用细尖移液管尽可能吸除多余液体，以防止注射过程中胚胎移动。然后，使用剪去一半细尖的Microloader移液器吸头，将胚胎排列成单列。然后，将针头缓缓移向处于单细胞期的胚胎，流畅地一次性刺穿绒毛膜和卵黄。当针尖位于卵黄中央时，踩下脚踏开关一次，向单细胞期胚胎的卵黄内显微注射一纳升的H2AGFP或H2BRFP mRNA。拔出注射针，移动培养皿使下一个胚胎进入注射位置，继续注射，直至整列胚胎全部完成注射。注射完所有胚胎后，将培养皿倾斜30至45度角，使用挤压瓶中的E3培养基轻柔冲洗，将已注射的胚胎转移至新的洁净培养皿中。受精后3小时，在2X至5X放大倍数的荧光显微镜下，使用RFP滤光片检测供体胚胎的标记信号，选择发育良好且荧光信号强的胚胎。根据文本方案准备好注射板和培养皿后，使用金刚石刀在旋转的同时刻划长型细拉玻璃尖端巴斯德移液管的尖端，使其尖端脱落，切割至便于操作的长度。确保切口平整。然后，为避免损伤去壳胚胎，将切割后的表面在本生灯上旋转灼烧，对玻璃转移移液管进行火焰抛光，以形成光滑的末端。为了去除胚胎的卵膜，将发育良好的宿主和供体胚胎分别放入两个10毫升的锥形玻璃烧杯中，并尽可能除去液体。向每个烧杯中加入5毫升预先配制的0.5毫克/毫升蛋白酶溶液，在解剖显微镜下轻轻旋转烧杯使胚胎晃动。在持续晃动的同时，一旦发现首个胚胎脱离卵膜，立即使用E3培养基进行三次快速冲洗：倒出大部分液体以去除蛋白酶溶液，然后沿烧杯壁轻轻加入E3培养基重新注满烧杯。一旦观察到最初几个去壳胚胎，应立即进行快速但轻柔的冲洗，以终止酶法去壳反应。进行移植时，仅选择具有对称细胞团且卵黄无明显畸形或损伤的去壳胚胎。为实施囊胚移植，将针头安装至针头夹持器中，并将其连接到移植装置的管路上。通过手动操作注射器，将液体吸入和推出针头，以测试密封性。接下来，使用玻璃移液管将供体胚胎转移至琼脂糖模具的第一列中。然后将受体胚胎转移至琼脂糖模具的第二至第六列中。轻轻将移植针置于供体胚胎的卵裂球细胞上，缓慢吸取约20至50个细胞进入移植针中，避免吸入卵黄。使用显微操作仪将移植针从供体胚胎中提起。将注射皿移至左侧，将移植针尖从细胞团的一侧插入，进入第一个宿主胚胎的动物极。根据命运图谱显示，该区域将发育为前脑眼区，因此将5到10个细胞沉积于表面附近。为胚胎成像做装片准备时，用塑料移液管最多吸入五个胚胎，让胚胎在重力作用下自然沉降至管尖。将转移移液管轻轻接触已准备好的塑料管表面，该管内含有1%低熔点琼脂糖，使胚胎沉入管中，同时尽量减少E3溶液的转移量。随后，将琼脂糖塑料管中的五个胚胎转移至含有0.5至1毫升琼脂糖的培养皿中，并使用同一支转移移液管去除多余的琼脂糖，仅保留少量液滴。使用去尖端的微量加样移液管将胚胎侧向排列，直至琼脂糖凝固。然后每次继续将最多五个胚胎分别置于琼脂糖液滴中进行封片。若使用正置显微镜成像，应避免将胚胎放置在培养皿边缘1厘米范围内。可使用额外的1%低熔点琼脂ose将培养皿侧壁的琼脂糖液滴相互连接，以防止成像过程中胚胎脱落或发生侧向移动。选择具有正确安装角度、心跳强健的胚胎，以及少数移植的供体细胞主要位于发育中视网膜的前腹侧象限（基因表达波起始区域）的胚胎。按照文本方案进行成像。如本图所示，在单细胞期胚胎的卵黄中显微注射一纳升mRNA，受精后三小时即可观察到荧光报告蛋白的表达，此时应选取荧光最强的供体胚胎。受精后24小时，将具有移植供体细胞且位于相关视网膜区域的胚胎进行16至24小时的延时成像。这幅共聚焦单个光学Z切面图像显示了发育中眼睛的明场信号以红色通道呈现，其中少数标记的供体细胞在原本未标记的宿主环境中呈红色。这些显微图像来自将atoh7:gapGFP转基因胚胎中的野生型供体细胞移植到未标记的野生型宿主体内后，对发育过程进行的延时成像。此处显示少数细胞中转基因表达的起始。一旦掌握技术，显微注射可在两小时内完成，同一天内胚胎筛选、制备和移植可在三小时内完成。在进行这些操作的同时或之后，我们还可以在特定发育阶段固定胚胎，用于死后分析。例如，我们可以量化供体细胞中有多少比例表达了特定基因或蛋白、具有特定形态，或迁移至特定位置。观看本视频后，您应能充分掌握如何对斑马鱼胚胎进行遗传操作，并在遗传背景不同的供体与宿主之间生成嵌合体。您还应能够对胚胎进行装片处理，以进行活体延时成像，从而回答那些无法通过固定组织来解答的科学问题。

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发育生物学

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延时活体成像观察发育中斑马鱼前脑内克隆相关神经前体细胞

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