在嵌合斑马鱼胚胎的个别视网膜祖细胞转基因表达的体内成像来研究细胞非自治的影响

在不同的遗传背景的个体WT视网膜祖细胞的现场跟踪允许细胞非自主性的信令神经过程中贡献进行评估。这里，通过胚胎移植和体内的时间推移共焦成像的基因敲除，嵌合体的产生的组合物用于此目的。

这些程序的总体目标是研究发育细胞内或其周围环境中基因表达的变化如何影响发育过程中的时间过程。这种方法可以帮助回答关键问题，例如命运规范的时间是由细胞内细胞自主表达的基因控制，还是由相邻细胞中的细胞非自主表达的基因控制。该技术的主要优点在于能够跟踪体内脊椎动物中的单个祖细胞，因为这些细胞在遗传不同的环境中发育。

演示该程序的是我实验室的研究助理 Stefanie Dudczig。根据文本方案准备斑马鱼胚胎以及带有吗啉或 mRNA 的显微注射针头后，将针尖浸入培养皿中的一滴矿物油中。通过踩下脚踏板测量注射体积，并调整气压和/或持续时间，直到注射体积相当于 1 纳升，用千分尺滑块测量，或者使用目镜刻度测量。

将显微镜载玻片放入培养皿中，然后用移液管沿载玻片边缘沉积单细胞期胚胎。接下来，使用精细移液管，尽可能多地去除液体，以防止注射过程中移动。然后，使用切掉一半薄尖端的 Microloader 移液器吸头，将胚胎对齐成单列。

然后，将针头放向单细胞期胚胎，并以平稳的笔触穿透绒毛膜和蛋黄。一旦针尖在蛋黄中居中，踩下脚踏板一次，将 1 纳升 H2AGFP 或 H2BRFP mRNA 显微注射到单龄胚胎的卵黄中。取出注射针，移动装有胚胎的培养皿，使下一个胚胎就位，然后继续注射，直到注射到整个胚胎列。

注射所有胚胎后，将培养皿倾斜 30 至 45 度角，并在挤压瓶中使用柔和的 E3 培养基流将注射的胚胎转移到新的、干净的培养皿中。受精后 3 小时，在荧光显微镜下以 2 倍至 5 倍的放大倍率，使用 RFP 过滤器检查供体胚胎的标记信号。选择具有强荧光信号的发育良好的胚胎。

根据文本方案准备注射板和培养皿后，使用金刚石刀刮擦针头，同时旋转针头直到尖端脱落，将长型、精细拉动的玻璃尖端巴斯德移液器的尖端切割成允许舒适作的长度。确保切口是直的。然后，为了不损坏去绒毛膜的胚胎，通过在本生灯中旋转切割表面来对玻璃移液管进行火抛光，以产生光滑的末端。

为了去绒毛膜胚胎，将发育良好的宿主和供体胚胎放入两个单独的 10 毫升锥形玻璃烧杯中，并尽可能多地去除液体。向每个烧杯中加入 5 毫升先前制备的 0.5 毫克/毫升蛋白酶溶液，并在解剖显微镜下观察胚胎的同时轻轻旋转胚胎。在继续旋转的同时，一旦第一个胚胎从绒毛膜中出来，使用 E3 培养基进行三次快速冲洗，通过倒出大部分液体来去除蛋白酶溶液，然后沿侧面轻轻倒入 E3 重新填充烧杯。

一旦可以观察到最初的几个去绒毛膜胚胎，就通过快速但温和的冲洗来停止酶促去绒毛膜化。对于移植，仅选择具有对称细胞团且蛋黄没有明显变形或损伤的去绒毛膜胚胎。要进行囊胚移植，请将针头安装在持针器中，并将其连接到移植装置的管道上。

通过手动作注射器将液体吸入和吸出针头来测试密封性。接下来，用玻璃移液器将供体胚胎转移到琼脂糖模具的第一列中。然后将宿主胚胎转移到琼脂糖模具的第 2 至第 6 列中。

轻轻地将移植针放在供体胚胎的卵裂球细胞上，然后慢慢将大约 20 到 50 个细胞吸入移植针中。避免吸出蛋黄。使用显微作器，从供体胚胎中取出移植针。

将注射皿向左移动，然后将移植针尖端穿过细胞团的一侧，插入第一个宿主胚胎的动物极。根据命运映射，在表面附近沉积 5 到 10 个细胞，显示该区域产生前脑眼场。要安装胚胎进行成像，请将最多五个胚胎吸入塑料移液管中，并让胚胎在重力作用下积聚在尖端。

将移液管接触先前制备的含有 1% 低熔点琼脂糖的塑料管表面，使胚胎沉入管中，同时限制 E3 转移的量。接下来，将五个胚胎从琼脂糖塑料管转移到含有 0.5 至 1 毫升琼脂糖的培养皿中，并使用相同的移液管去除多余的琼脂糖，以便只剩下一小滴。使用吸头折断的微量加载移液器将胚胎横向对齐，直到琼脂糖凝固。

然后继续在单个琼脂糖滴中一次封片最多五个胚胎。如果使用正置显微镜成像，请避免将胚胎放置在培养皿周长的一厘米范围内。使用额外的 1% 低熔点琼脂糖将琼脂糖滴在培养皿侧面相互连接，以防止成像过程中出现任何移动和横向移动。

选择具有正确安装角度和强烈心跳的胚胎，以及一些主要位于发育中的视网膜腹前象限的移植供体细胞，基因表达波开始的地方。根据文本协议进行成像。如图所示，将 1 纳升 mRNA 显微注射到单细胞期胚胎的卵黄中，可在受精后 3 小时产生荧光报告蛋白表达，此时选择最亮的供体。

受精后 24 小时，在相关视网膜位置移植供体细胞的胚胎进行延时成像 16 至 24 小时。该单光学 Z 切片的共聚焦图像显示了发育中的眼处红色通道中的明场叠加，在其他未标记的宿主环境中，一些标记的供体细胞以红色显示。这些显微照片来自移植到未标记野生型宿主中的 atoh7：gapGFP 转基因胚胎发育中的野生型供体细胞的延时成像。

转基因表达起始适用于少数细胞，如图所示。一旦掌握，显微注射可以在两个小时内完成，胚胎选择、准备和移植可以在同一天的三个小时内完成。在这些程序之后或同时进行，我们还可以在特定年龄固定胚胎以进行尸检分析。

例如，我们可以量化表达特定基因或蛋白质、具有特定形态或已迁移到特定位置的供体细胞的比例。看完这个视频，你应该对如何对斑马鱼胚胎进行基因作并在基因不同的供体和宿主之间产生嵌合体有一个很好的了解。您还应该能够安装胚胎进行体内延时成像，以回答在固定组织中无法回答的问题。