Name: 对酶活性G4 Resolvase1净化用G-四DNA亲和方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: 学习利用ATP依赖性纯化步骤从细菌表达系统中分离高纯度且具有催化活性的G4 Resolvase1蛋白的方法。该技术可有效排除错误折叠或无催化活性的酶，为体外生化实验提供可靠的酶源。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢以下资助方的支持，包括Ware基金会（资助J.P.V.）、美国国立卫生研究院资助项目T32-CA079448（资助P.J.S.）以及鲍尔州立大学的启动资金（资助P.J.S.）。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

<ol><li>Qin, Y., Hurley, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures%2C+folding+patterns%2C+and+functions+of+intramolecular+DNA+G-quadruplexes+found+in+eukaryotic+promoter+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions.</a> Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).</li>
<li>Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+and+understanding+the+stability+of+G-quadruplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Predicting and understanding the stability of G-quadruplexes.</a> Bioinformatics. 25 (12), i374-i382 (2009).</li>
<li>Todd, A. K., Johnston, M., Neidle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+prevalent+putative+quadruplex+sequence+motifs+in+human+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA.</a> Nucleic Acids Res. 33 (9), 2901-2907 (2005).</li>
<li>Huppert, J. L., Balasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+quadruplexes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Prevalence of quadruplexes in the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 33 (9), 2908-2916 (2005).</li>
<li>Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+G-quadruplex+propensity+with+G4Hunter%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter.</a> Nucleic Acids Res. 44 (4), 1746-1759 (2016).</li>
<li>Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M. Jr, Mergny, J. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26883636">G-quadruplexes and helicases.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).</li>
<li>Huppert, J. L., Balasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-quadruplexes+in+promoters+throughout+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G-quadruplexes in promoters throughout the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 35 (2), 406-413 (2007).</li>
<li>Eddy, J., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+function+correlates+with+potential+for+G4+DNA+formation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gene function correlates with potential for G4 DNA formation in the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 34 (14), 3887-3896 (2006).</li>
<li>Eddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+motifs+correlate+with+promoter-proximal+transcriptional+pausing+in+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 4975-4983 (2011).</li>
<li>Vaughn, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEXH+protein+product+of+the+DHX36+gene+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).</li>
<li>Booy, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RHAU+%28DHX36%29+unwinds+a+G4-quadruplex+in+human+telomerase+RNA+and+promotes+the+formation+of+the+P1+helix+template+boundary%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary.</a> Nucleic Acids Res. 40 (9), 4110-4124 (2012).</li>
<li>Creacy, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+binds+both+DNA+and+RNA+tetramolecular+quadruplex+with+high+affinity+and+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+and+G4-RNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).</li>
<li>Giri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+tightly+binds+and+unwinds+unimolecular+G4-DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).</li>
<li>Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAH-box+RNA+helicase+RHAU+binds+an+intramolecular+RNA+G-quadruplex+in+TERC+and+associates+with+telomerase+holoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme.</a> Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).</li>
<li>Sexton, A. N., Collins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%27+guanosine+tracts+of+human+telomerase+RNA+are+recognized+by+the+G-quadruplex+binding+domain+of+the+RNA+helicase+DHX36+and+function+to+increase+RNA+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 5' guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation.</a> Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).</li>
<li>Smaldino, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+Dissection+of+Telomeric+DNA+Binding+Requirements+of+G4+Resolvase+1+Shows+that+G4-Structure+and+Certain+3%27-Tail+Sequences+Are+Sufficient+for+Tight+and+Complete+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3'-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding.</a> PLoS One. 10 (7), e0132668(2015).</li>
<li>Booy, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RHAU+%28DHX36%29+suppresses+expression+of+the+transcription+factor+PITX1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1.</a> Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+contains+G-quadruplex+structures+in+its+promoter+and+5%27-UTR+and+its+expression+is+modulated+by+G4+resolvase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5'-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1.</a> Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).</li>
<li>Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+mRNA+deadenylation+and+decay+by+the+exosome-bound%2C+DExH+protein+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU.</a> Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).</li>
<li>Yoo, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHX36+enhances+RIG-I+signaling+by+facilitating+PKR-mediated+antiviral+stress+granule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation.</a> PLoS Pathog. 10 (3), e1004012(2014).</li>
<li>Lai, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAH-box+helicase+RHAU+is+an+essential+gene+and+critical+for+mouse+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The DEAH-box helicase RHAU is an essential gene and critical for mouse hematopoiesis.</a> Blood. 119 (18), 4291-4300 (2012).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DDX1%2C+DDX21%2C+and+DHX36+helicases+form+a+complex+with+the+adaptor+molecule+TRIF+to+sense+dsRNA+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells.</a> Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).</li>
<li>Kim, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartate-glutamate-alanine-histidine+box+motif+%28DEAH%29%2FRNA+helicase+A+helicases+sense+microbial+DNA+in+human+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).</li>
<li>BD Biosciences. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bd.com/ds/technicalCenter/misc/difcobblmanual_2nded_lowres.pdf">http://www.bd.com/ds/technicalCenter/misc/difcobblmanual_2nded_lowres.pdf</a> (2016).</li>
<li>Booy, E. P., McRae, E. K., McKenna, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+G4+quadruplex+telomerase+RNA+unwinding+by+the+RNA+helicase+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of G4 quadruplex telomerase RNA unwinding by the RNA helicase RHAU.</a> Methods Mol Biol. 1259, 125-135 (2015).</li>
<li>Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+amino+terminal+RHAU-specific+motif+in+the+recognition+and+resolution+of+guanine+quadruplex-RNA+by+the+DEAH-box+RNA+helicase+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU.</a> Nucleic Acids Res. 38 (18), 6219-6233 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案提供了一种高效表达、纯化和定量分离DHX36基因产物G4解旋酶1（G4-Resolvase1，G4R1，亦称为RHAU和DHX36）的方法（图1）。该方案包含两个纯化步骤：首先利用钴亲和磁珠进行His标签亲和纯化，随后通过G4-DNA偶联磁珠进行酶学特异性纯化。其中第二步具有独特优势，充分利用了重组G4R1蛋白对G4结构所具有的高亲和力、高特异性以及催化解旋活性。由于G4R1对G4结构具有极强的亲和力（解离常数Kd处于低皮摩尔范围），因此在从G4磁珠上洗脱前可使用高盐缓冲液（接近NaCl溶解度极限）进行洗涤，显著减少非特异性结合蛋白的污染。此外，G4R1对G4结构的催化活性使其可在加入ATP和MgCl2后被特异性地洗脱出具有活性的重组蛋白。该两步纯化策略可稳定获得高纯度、具有催化活性的重组G4R1蛋白13，产量足以满足大多数生物化学分析的需求。
以下几个关键步骤可确保获得高产量、高纯度且具有催化活性的rG4R1。第一步是优化细菌表达菌株中His-rG4...

G4 结构是在 DNA 和 RNA 的富含鸟嘌呤区域中形成的高稳定性核酸二级结构。G4 结构通过 Hoogsteen 氢键相互作用以及中心空腔内与单价阳离子（i.e.&#160;K+ 和 Na+）的配位键合而得以稳定，这些阳离子对 G4 结构显著的热稳定性具有重要贡献1,2。早期的生物信息学研究表明，人类基因组包含 &#62;375,000 个“潜在的 G4 形成基序”3,4。最近的研究估计表明，G4 基序的数量可能高出 2 至 5 倍5，而另一项研究预测人类基因组中存在 716,310 个不同的潜在 G4 形成序列6。G4 形成序列在进化上是保守的，并非在基因组中随机分布。G4 基序在基因编码区富集，且超过 40% 的基因启动子含有 G4 基序7。有趣的是，基因中 G4 基序的富集程度已被证明可提示该基因的功能。例如，原癌基因和参与发育的基因中的 G4 结构富集程度显著高于肿瘤抑制基因8,9。

由于G4结构具有高热稳定性，在基因组中广泛存在，并且可能显著影响主要的细胞过程，因此细胞进化出专门的酶来调控这些结构也就不足为奇了。其中一种酶是G4解旋酶1（G4 Resolvase1，G4R1；也称为RHAU和DHX36），我们先前已将其鉴定为人类（HeLa）细胞中大部分四链G4-DNA解旋活性的来源10。此后研究发现，G4R1能够紧密结合并催化性地解开四链和单链的G4-DNA及G4-RNA，其报道的解离常数（KD）是目前G4结合蛋白中最紧密的11,12,13。此外，G4R1的G4解旋活性已被证实参与多种生化和细胞过程，包括端粒/端粒酶生物学11,14,15,16、转录与剪接17,18,19,20、发育21、造血21以及免疫调控22,23。鉴于G4序列在基因组中广泛且特异性分布，且G4R1被发现参与多种多样的细胞功能，高效表达并纯化高活性的重组G4R1（rG4R1）对于阐明该蛋白的生化机制与功能行为具有极其重要的意义。

本文展示了一种新颖的表达与纯化方案（图1），该方案利用rG4R1依赖ATP的G4解旋活性，高效分离具有活性的酶。该方案可适用于纯化其他依赖ATP的核酸酶，前提是酶促反应的产物不再作为结合底物，G4R1即属于此类情况。

<table><tbody><tr><td>TriEx4-DHX36 质粒</td><td>Addgene</td><td>68368</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta2(DE3)plysS 感受态细胞</td><td>Novagen</td><td>71403-4</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544034&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Difco 优质肉汤</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td>在细菌平板/大量培养中使用浓度为 35 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>羧苄青霉素（经植物细胞培养测试）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3416</td><td>在细菌平板/大量培养中使用浓度为 50 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>异丙基-&amp;beta;-D-硫代半乳糖苷（IPTG）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶（来自鸡蛋清）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl，pH 8</td><td>Universal Scientific Supply Co.&amp;nbsp;</td><td>1963-B</td><td>或来自标准来源</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl，pH 7</td><td>Universal Scientific Supply Co.&amp;nbsp;</td><td>1966</td><td>或来自标准来源</td></tr><tr><td>1.5 M Tris-HCl，pH 8.8</td><td></td><td></td><td>用于制备分离胶（用于蛋白质定量凝胶）；来自标准来源</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl，pH 6.8</td><td></td><td></td><td>用于制备浓缩胶（用于蛋白质定量凝胶）；来自标准来源</td></tr><tr><td>1 M Tris-乙酸盐，pH 7.8</td><td>Universal Scientific Supply Co.&amp;nbsp;</td><td>1981</td><td>或来自标准来源</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td></td><td></td><td>来自标准来源</td></tr><tr><td>氯化镁（1&amp;nbsp;M 溶液）</td><td>Life Technologies</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Universal Scientific Supply Co.&amp;nbsp;</td><td>1665</td><td>或来自标准来源</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇（2-BME）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8849</td><td></td></tr><tr><td>亮抑蛋白半硫酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素磁性珠</td><td>Promega</td><td>Z5482</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA，pH 8&amp;nbsp;</td><td>Universal Scientific Supply Co.&amp;nbsp;</td><td>0718</td><td>或来自标准来源</td></tr><tr><td>0.2 M EDTA，pH 6</td><td>Universal Scientific Supply Co.&amp;nbsp;</td><td></td><td>来自标准来源；初始用 NaOH 调节 pH，再用 HCl 将 pH 调回。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>α-乳白蛋白（牛乳来源 I 型）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5385</td><td></td></tr><tr><td>钴金属亲和珠</td><td>Clonetech</td><td>635502</td><td></td></tr><tr><td>L-组氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>腺苷-5'-三磷酸（来自细菌来源）</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺/Bis 溶液（37.5:1）</td><td>Biorad</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>用于配制蛋白凝胶电泳缓冲液（192 mM 甘氨酸，25 mM Tris 碱，0.1% SDS）</td></tr><tr><td>10% 十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Universal Scientific Supply Co.&amp;nbsp;</td><td>1667</td><td>用于配制蛋白凝胶电泳缓冲液（192 mM 甘氨酸，25 mM Tris 碱，0.1% SDS）；或来自标准来源</td></tr><tr><td>10x TBE&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11666703001</td><td>或来自标准来源</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>用于配制蛋白凝胶电泳缓冲液（192 mM 甘氨酸，25 mM Tris 碱，0.1% SDS）；来自标准来源</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>411019</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>广谱蛋白分子量标记物</td><td>Promega</td><td>V8491</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的 Z33 寡核苷酸（&quot;Z33-Bio&quot;）</td><td>Oligos Etc</td><td></td><td>5&amp;rsquo; AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-生物素 3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>TAMRA 标记的 Z33 寡核苷酸（&quot;Z33-TAM&quot;）</td><td>Oligos Etc</td><td></td><td>5&amp;rsquo; TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>荧光涂层薄层色谱板</td><td>Life Technologies</td><td>AM10110</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2637</td><td>30% 溶于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 R-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27816</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>多波段紫外灯</td><td></td><td></td><td>可发射 365 nm 紫外光</td></tr><tr><td>台式离心机（带摆动转子）</td><td></td><td></td><td>可冷却至 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td></td><td></td><td>可冷却至 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Digital Sonfier</td><td>Branson</td><td></td><td>或具有等效功能的设备，可提供超声波脉冲（30% 振幅，2 秒开/2 秒关）</td></tr><tr><td>50 &amp;deg;C 水浴</td><td></td><td></td><td>用于 Z33 形成四链体结构</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 细菌培养箱</td><td></td><td></td><td>用于细菌转化及携带 TriEx4-DHX36 质粒的 Rosetta2 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 大量培养物的初始过夜生长</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C/14&amp;nbsp;&amp;deg;C 摇床培养箱（用于细菌）</td><td></td><td></td><td>用于携带 TriEx4-DHX36 质粒的 Rosetta2 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 大量培养物的生长和蛋白诱导</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td></td><td></td><td>可读取 OD600；可根据碱基序列测定寡核苷酸浓度（例如 Biorad SmartSpec 3000）</td></tr><tr><td>温度计</td><td></td><td></td><td>来自标准来源</td></tr><tr><td>PCR 排管</td><td></td><td></td><td>来自标准来源</td></tr><tr><td>15 和 50 mL 离心管（聚丙烯）</td><td></td><td></td><td>来自标准来源</td></tr><tr><td>微量离心管（2.0 mL）</td><td></td><td></td><td>来自标准来源</td></tr><tr><td>500 mL 离心瓶（聚丙烯）</td><td>Thermo Scientific</td><td>3141-0500</td><td></td></tr><tr><td>标准规格的移液器吸头和血清移液管</td><td></td><td></td><td>来自标准来源</td></tr><tr><td>加样枪头</td><td></td><td></td><td>来自标准来源</td></tr><tr><td>自动重复移液器</td><td></td><td></td><td>用于快速分装 rG4R1；来自标准来源</td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td></td><td></td><td>来自标准来源</td></tr><tr><td>液氮</td><td></td><td></td><td>来自标准来源</td></tr><tr><td>干冰</td><td></td><td></td><td>来自标准来源</td></tr><tr><td>Laemmli 上样缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Biorad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>大板凝胶电泳装置</td><td>Biorad</td><td></td><td>我们使用 Biorad 的 Protean II xi cell 装置</td></tr><tr><td>磁铁</td><td>Life Technologies</td><td>12301D</td><td>我们使用 One Lambda（现为 Thermo Fisher Scientific 品牌）的磁铁；Life 也是 Thermo 的子公司，因此此处列出的磁铁应为合适替代品</td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td></td><td></td><td>来自标准来源</td></tr><tr><td>滤纸和漏斗</td><td></td><td></td><td>来自标准来源</td></tr><tr><td>玻璃烧杯</td><td></td><td></td><td>来自标准来源</td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td></td><td></td><td>来自标准来源</td></tr><tr><td>Kimwipes 纸巾</td><td></td><td></td><td>来自标准来源</td></tr><tr><td>透明文件保护套</td><td></td><td></td><td>来自标准来源</td></tr><tr><td>扫描仪及配套 TWAIN 软件</td><td></td><td></td><td>来自标准来源</td></tr><tr><td>图像分析软件</td><td></td><td></td><td>例如 Fuji Multiguage 或等效软件</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td>或等效软件&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

一种基于g-四链体dna亲和力的方法用于纯化具有酶活性的g4解旋酶1

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

一种称为G-四链体（G4、G4结构）的高级核酸结构可在DNA和RNA的富含鸟嘌呤区域形成，并具有高度的热稳定性。人类基因组中存在&#62;375,000个假定的G4形成序列，这些序列在启动子区域、非翻译区（UTRs）以及端粒重复序列中富集。由于这些结构可能影响复制和转录等细胞过程，细胞已进化出相应的酶来调控它们。其中一种酶是G4解旋酶1（G4R1），该酶由我们的实验室与Nagamine 等共同通过生物化学方法表征，发现其可极紧密地结合G4-DNA和G4-RNA（Kd 处于低皮摩尔浓度范围）。G4R1是HeLa细胞裂解液中大部分G4解旋活性的来源，并已被证实参与端粒代谢、淋巴系统发育、基因转录、造血以及免疫监视等过程。高效表达和纯化具有催化活性的G4R1，对于希望进一步深入了解G4结构与G4解旋酶之间动力学相互作用的研究实验室而言具有重要意义。本文中，我们描述了一种重组G4R1（rG4R1）的详细纯化方法。该方法结合了传统的亲和层析纯化技术，利用在人类密码子优化的细菌中表达的C端组氨酸标签酶，并进一步利用rG4R1结合并解旋G4-DNA的能力，通过ATP依赖性的洗脱步骤获得高活性的纯化酶。本方案还包括一个质量控制步骤，通过检测纯化后的酶解旋G4-DNA的能力来评估rG4R1的酶活性。同时提供了一种用于定量纯化rG4R1的方法。文中还讨论了该方案的若干替代性优化策略。

本方案（图1）通常可获得近乎纯的、具有催化活性的rG4R1。作为酶活性的衡量指标，通常观察到在G4活性检测（上文所述，图2）中，0.2 pmol的TAMRA标记四链G4-DNA有50%被0.2 - 0.013 µL范围内的rG4R1转化为单体。经考马斯亮蓝染色，纯化的rG4R1在预期的120 kDa处显示单一主条带，另有一微弱的约75 kDa污染条带，可能代表仍保留结合G4-DNA磁珠能力并能以ATP依赖方式洗脱的截短型rG4R1（图3）。目标条带通过蛋白质标准曲线进行定量，本方案通常每升细菌培养物可获得200 µL浓度为20–100 nM的纯化酶。
<img alt="蛋白质纯化，His6x-G4R1 与 Co²⁺ 珠结合，G4-DNA，磁分离示意图。" src="/files/ftp_upload/55496/55496fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" dat...

G4解旋酶1与G-四链体（G4）结构的结合亲和力是目前报道中G4结合蛋白中最强的，并且在HeLa细胞中构成了G4-DNA解旋活性的主体。本文描述了一种新方案，该方案利用G4-解旋酶1的高亲和力及其ATP依赖性的解旋活性，特异性纯化具有催化活性的重组G4R1蛋白。

一种基于G-四链体DNA亲和力的方法用于纯化具有酶活性的G4解旋酶1

称为G-四链体（G4、G4结构）的高级核酸结构可在DNA和RNA的富含鸟嘌呤区域中形成，并且具有高度...

本方法的总体目标是利用一种独特的ATP依赖性纯化步骤，从细菌表达系统中分离出G-四链体解旋酶G4解旋酶1蛋白，从而获得近乎纯度高且具有催化活性的酶。该方法可帮助研究人员获得近乎纯度高且具有催化活性的重组G4解旋酶1蛋白，用于多种体外生物化学分析。该技术的主要优势在于能够从蛋白制备物中去除错误折叠或无催化活性的酶分子。使用ATP洗脱G-四链体解旋酶的想法源于无法通过极高盐浓度将具有催化活性的酶从G4珠上洗脱下来。按照文本方案所述，准备并培养大量表达G-四链体解旋酶1（G-quadruplex Resolvase1）或G4R1的细菌培养物。在室温下，用三毫升TN缓冲液重悬细菌沉淀。用手握住瓶子并轻轻旋转，以融化并重悬细菌沉淀。待其完全融化且悬浮均匀后，用TN缓冲液将体积补至5毫升。随后，每份培养物中加入250微升水中溶解的20毫克溶菌酶，并加入至重悬的细菌中。用手轻轻摇动瓶子，使溶菌酶消化细菌约5至10分钟。随着消化的进行，悬液颜色会略微变浅，且悬液相对不粘稠。加入250微升蛋白酶抑制剂混合液（简称PIC）。然后，加入一份数量为10 µL的亮抑蛋白酶肽（leupeptin），并充分混匀。将悬浮液置于冰上，加入10 mL冷TN缓冲液和22 µLβ-巯基乙醇（BME）。将悬浮液转移至50 mL离心管中。将细菌置于冰上，使用数字超声波破碎仪进行超声处理，超声功率设为30%。以开启2秒、关闭2秒的脉冲模式持续1分钟。重复超声处理三次，每次超声之间将样品置于冰上冷却至少2分钟。接下来，加入等体积预冷的4倍浓度的氯化钠-柠檬酸钠溶液（SSC）以及BME、PIC和亮抑蛋白酶肽，混匀悬浮液。在已预冷至4摄氏度的台式离心机中，以2,300 × g离心裂解物20分钟。然后将上清液转移至预冷的新鲜50毫升离心管中。取1毫升链霉亲和素磁珠（streptavidin paramagnetic beads，SPB）悬浮液用于每份培养物，转移至1.5毫升微量离心管中。用磁铁沉淀SPB，随后用2×SSC缓冲液加5毫摩尔/升EDTA（pH 8）洗涤SPB两次。接下来，将洗涤后的SPB重悬于200微升相同溶液中。向SPB悬液中加入一个三倍OD的G4 DNA等分试样。通过反复吹打数次，快速混匀。然后，将试管置于旋转仪上，在室温下旋转至少30分钟。旋转结束后，通过加入1毫升0.4%乳白蛋白封闭与G4结合的SPB，并置于冰上保存，直至后续使用。为使组氨酸标签重组G4R1蛋白结合钴珠，向每个含有澄清细菌裂解液的50毫升试管中加入1毫升钴珠悬液。将混合物在旋转仪上室温孵育20分钟。孵育结束后，在4 °C的台式离心机中以110 ×g离心5分钟，使钴珠沉淀。小心吸去上清液，留下数毫升液体，以免扰动沉淀的钴珠。然后，用 10 至 15 毫升冰冷的 4 × SSC 缓冲液（含 BME）洗涤珠子，并像之前一样离心收集珠子。将下一管澄清裂解液加入到已沉淀的钴珠中。在旋转仪上室温孵育 20 分钟，再用 10 至 15 毫升 4 × SSC 缓冲液（含 BME）洗涤珠子。然后，在 4°C 条件下以 100 × g 离心 5 分钟，使磁珠沉淀。第二次洗涤后，吸去上清液，保留约 2 毫升含有磁珠和液体的混合物于管底。使用 1 毫升宽口吸头，将结合有蛋白的钴磁珠转移至预冷的 2 毫升离心管中。在4摄氏度下，将两毫升管中的磁珠在微量离心机中高速短暂离心。小心吸去并弃除上清液，注意避免丢失与蛋白质结合的钴珠。用移液器加入0.5毫升组氨酸洗脱缓冲液（HEB），并通过倒置试管轻轻重悬磁珠。然后将钴珠置于HEB中，在4°C的旋转仪上孵育5分钟。接着，在4°C下以18,000 × g离心1分钟。用移液器小心吸取含有蛋白的上清液，留下少量液体覆盖在钴珠表面。将上清液转移至预冷的15毫升离心管中。重复上述步骤，共进行三次HEB洗脱。然后用0.2摩尔/升EDTA（pH 6.0）洗脱一次。随着EDTA螯合钴离子，钴珠的颜色将从粉红色变为白色。将第四次也是最后一次洗脱液转移至15毫升离心管后，使用1毫升移液枪末端的凝胶上样枪头吸取钴珠中残留的洗脱缓冲液。将枪头插入管底，可收集含有残留蛋白的洗脱缓冲液。用磁铁将制备好的 G4 SPB 移至管壁一侧，弃去上清液。然后，向 G4 SPB 中加入 1 毫升 3× 洗脱缓冲液，用移液器吹打混匀。将悬浮在 3× 洗脱缓冲液中的 G4 SPB 用移液器转移至含有约 2 毫升含蛋白 HEB EDTA 的 15 毫升离心管中。在37摄氏度水浴中孵育15分钟，期间偶尔振荡，防止磁珠沉淀。按照文本方案洗涤与蛋白结合的G4 SPB后，将G4 SPB置于冰上，用磁力架磁分离收集磁珠，然后将磁珠重悬于100微升预热的洗脱缓冲液中。立即将磁珠转移至预热的PCR管中，在37摄氏度孵育30秒。立即加入12微升5摩尔的氯化钠，用力吹打20至30次。高盐浓度与洗脱缓冲液中的ATP共同作用，可将重组G4R1从G4磁珠上洗脱下来。立即用磁铁吸附G4 SPB，将含有蛋白的洗脱液转移至冰上预冷的新的PCR管中。重复洗脱并转移后，最终产物约为200微升含有纯化重组G4R1的洗脱缓冲液。最后，进行质量控制的酶活性检测，以验证是否已如文本方案所述纯化得到高活性的重组G4R1。G4检测可定量重组G4R1的酶活性。在酶促反应中，当酶量处于 0.2 至 0.013 微升范围内时，通常可观察到 0.2 皮摩尔四甲基罗丹明标记的四分子 G4 DNA 有 50% 转化为单体。纯化的重组 G4R1 蛋白经考马斯亮蓝染色显示，在预期的 120 千道尔顿大小处出现单一主条带，同时在约 75 千道尔顿处有一微弱的污染条带。该条带可能代表截短的重组 G4R1，其仍保留了结合 G4 DNA 磁珠的能力，并能以 ATP 依赖的方式被洗脱。通过蛋白质标准曲线对目标条带进行定量。该方案通常每升细菌培养物可获得 200 微升浓度为 20 至 100 纳摩尔的纯化酶。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用独特的 ATP 依赖性纯化步骤，从细菌表达系统中纯化出近乎纯度高且具有催化活性的 G4 解旋酶 1 蛋白。一旦掌握该技术，并在预先制备好冻存的细菌菌体后，重组G4R1的纯化可在约六小时内完成。为保持酶的最佳催化活性，除特别说明外，整个制备过程须置于冰上进行。务必使用蛋白酶抑制剂。避免在离心管中产生气泡。快速冷冻纯化的酶，并避免不必要的冻融循环。该技术建立后，为该领域的研究人员准确测定该蛋白对多种DNA和RNA底物的结合亲和力及解旋酶活性奠定了基础。该方法也可适用于其他ATP依赖性核酸酶的纯化，其酶促反应产物不再作为该酶的结合底物。

a-g-quadruplex-dna-affinity-approach-for-purification-enzymatically

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

对酶活性G4 Resolvase1净化用G-四DNA亲和方法

蛋白质–DNA 复合物的晶体结构可为蛋白质的功能、作用机制以及特异性相互作用的性质提供深入见解。本文中，我们报道了如何优化双链 DNA 的长度、序列和末端，以实现与大肠杆菌（Escherichia coli）复制起始负调控因子 SeqA...

DNA双链的迭代优化以促进SeqA-DNA复合物的结晶

我们描述了一种基于凝胶的高灵敏度非连续检测方法，用于研究T7噬菌体复制蛋白在滞后链起始过程中的动力学。...

滞后链DNA合成的动力学 体外 由T7噬菌体复制蛋白

本文报道了一种用于操控G-四链体的单分子磁镊平台，该平台可用于研究G4的稳定性及其受多种蛋白质调控的机制。...

利用磁镊对G-四链体进行单分子操控

本方案展示了使用一种快速、三步式、基于适配体的指数扩增检测方法来检测目标物。涵盖了样本制备、信号扩增和显色发育步骤，以实现对该体系的应用，特异性识别茶碱而非咖啡因的存在。...

基于适体的靶标检测结合三阶段G-四链体等温指数扩增反应

双--3-氯哌啶类化合物（B-CePs）是用于识别和表征DNA模板中G-四链体结构的有效化学探针 体外本方案详细描述了使用 B-CePs...

体外利用双-3-氯哌啶对G-四链体DNA结构进行化学图谱分析

CRISPR等技术面临的一个重大障碍是脱靶效应，其可能破坏重要基因。“环化用于 体外...

使用CIRCLE-Seq检测基因编辑脱靶效应

本方案演示了通过单分子实验对CMG解旋酶解旋DNA的过程进行活体可视化观察。内容包括：（1）制备DNA底物，（2）纯化荧光标记的黑腹果蝇（Drosophila...

CMG解旋酶解旋DNA的单分子实时可视化观察

本方案介绍了一种基于荧光显微镜的单分子DNA复制检测方法，可实现实时观察DNA聚合酶与G-四链体结构等障碍物之间的相互作用。...

单分子荧光成像观察DNA聚合酶在G-四链体上的动态行为

本文介绍了一种用于制备、纯化和使用酶包封外膜囊泡（OMV）的实验方案，该囊泡可提高酶的稳定性，适用于多种不同应用。...

定向蛋白质包装至外膜囊泡中 大肠杆菌设计、生产与纯化

本文介绍了一种表达和纯化S100A12（钙粒蛋白C）的方法，并描述了一种检测其对人类病原体H.

S100A12的表达、纯化及其抗菌活性

学习利用ATP依赖性纯化步骤从细菌表达系统中分离高纯度且具有催化活性的G4 Resolvase1蛋白的方法。该技术可有效排除错误折叠或无催化活性的酶，为体外生化实验提供可靠的酶源。

一种基于G-四链体DNA亲和力的方法用于纯化具有酶活性的G4解旋酶1

探索更多视频