对酶活性G4 Resolvase1净化用G-四DNA亲和方法

该方法的总体目标是使用独特的 ATP 依赖性纯化步骤从细菌表达系统中分离 G-四链体解旋酶 G4 Resolvase1 蛋白，以分离近乎纯且具有催化活性的酶。该方法可以帮助研究人员在广泛的体外生化测定中为我们获得近乎纯且具有催化活性的重组 G4 Resolvase1 蛋白。该技术的主要优点是它从蛋白质制备中排除了错误折叠或其他催化失活的酶。

使用 ATP 洗脱 G-四链体解旋酶的想法源于即使在极高的盐浓度下也无法从 G4 珠子上洗脱催化活性酶之后。如文本方案中所述，准备并培养表达 G-四链体解析酶 1 或 G4R1 的大型细菌培养物。在室温下在 3 ml TN 缓冲液中解冻细菌沉淀。

将瓶子拿在手中，旋转以解冻并重新悬浮细菌沉淀。解冻并相对均匀地悬浮后，用 TN 缓冲液将体积提高到 5 毫升。接下来，每次培养物将 20 毫克溶菌酶溶解在 250 微升水中，并添加到重悬的细菌中。

让溶菌酶消化细菌大约 5 到 10 分钟，同时旋转手中的瓶子。随着消化的进行，悬浮液的颜色会开始略微变浅，并且悬浮液会相对不粘稠。加入 250 μL 蛋白酶抑制剂混合物，缩写为 PIC。

然后，加入一份 10 微升等分试样的亮肽素并充分混合。将悬浮液置于冰上，加入 10 毫升冷 TN 缓冲液和 22 微升 β 巯基乙醇或 BME。将悬浮液转移至 50 ml 试管中。

使用设置为 30% 振幅的数字超声仪对冰上的细菌进行超声处理。以 2 秒开和 2 秒灭的速度脉冲，持续 1 分钟。重复超声处理 3 次，让样品在两次超声处理步骤之间在冰上冷却至少 2 分钟。

接下来，加入等体积的冷四 X 盐水柠檬酸钠或 SSC 加 BME、PIC 和亮肽素，并混合悬浮液。在预冷至 4 摄氏度的台式离心机中，以 2， 300 倍 G 离心裂解物 20 分钟。然后将上清液转移到新鲜的预冷 50 毫升试管中。

每次培养物取 1 mL 链霉亲和素顺磁珠或 SPB 悬浮液，并将其转移到 1.5 mL 微量离心管中。用磁铁沉淀 SPB。然后用 2 个 X SSC 加 5 毫摩尔 EDTA PH8 洗涤 SPB 两次。

接下来，将洗涤后的 SPB 重悬于 200 微升的相同溶液中。向 SPB 悬液中加入 1 个 3 OD 的 G4 DNA 等分试样。通过上下吹打数次快速混合。

然后，将试管放在旋转器上并在室温下旋转至少 30 分钟。在此旋转期后，通过添加 1 毫升 0.4% 乳清蛋白来阻断 G4 结合的 SPB，并保持在冰上直到需要。要将组氨酸标记的重组 G4R1 与钴珠结合，向每个含有澄清细菌裂解物的 50 毫升试管中加入 1 毫升钴珠浆液。

在室温下在旋转器上孵育混合物 20 分钟。孵育后，在 4 摄氏度的台式离心机中以 110 倍 G 离心 5 分钟。小心吸出液体，并留下几毫升液体，以免干扰沉淀的钴珠。

然后，用 10 至 15 毫升冷的 4 X SSC 加 BME 洗涤珠子，并像以前一样沉淀珠子。将下一个澄清的裂解物倒入沉淀的钴珠上。在室温下在旋转器上再孵育 20 分钟，然后用 10 至 15 mL 的 4 X SSC 加 BME 洗涤珠子。

然后，在 4 摄氏度下以 100 倍 G 的浓度沉淀珠子 5 分钟。第二次洗涤后，吸出液体，并在试管底部留下约 2 毫升的珠子和液体。使用 1 mL 宽口径移液器吸头，将蛋白质结合的钴珠转移到预冷的 2 mL 试管中。

4 摄氏度的微量离心机中，将 2 毫升管中的珠子高速短暂离心。轻轻去除并通过移液丢弃上清液，小心不要丢失蛋白质结合的钴珠。吸取 0.5 毫升组氨酸洗脱缓冲液或 HEB 到磁珠上，然后倒置试管重悬。

然后在冷藏室中将钴珠在 HEB 中的旋转器上孵育 5 分钟。接下来，将悬浮液在 4 摄氏度的微量离心机中以 18， 000 倍 G 离心 1 分钟。通过小心移液轻轻去除含有蛋白质的上清液，在钴珠上留下少量液体。

将上清液转移至预冷的 15 mL 试管中。重复这些步骤，总共进行 3 次 HEB 洗脱。然后用 0.2 摩尔 EDTA 在 PH 值为 6.0 的情况下洗脱一次。

当 EDTA 螯合钴时，钴珠的颜色将从粉红色变为白色。将第四次也是最后一次洗脱液转移到 15 mL 试管中后，使用 1 mL 移液器吸头末端的凝胶加载吸头，从钴珠中移液残留的洗脱缓冲液。通过将尖端插入管底部，可以收集含有洗脱缓冲液的残留蛋白质。

用磁铁将准备好的 G4 SPB 引至试管侧面，弃去上清液。然后，向 G4 SPB 中加入 1 毫升 3 X res 缓冲液并移液混合。将悬浮在三个 X res 缓冲液中的 G4 SPB 移液到含有约 2 mL 含有 HEB EDTA 的蛋白质的 15 毫升试管中。

在 37 摄氏度的水浴中孵育 15 分钟，偶尔搅拌，使珠子不会沉淀。按照文本方案中的说明洗涤蛋白质结合的 G4 SPB 后，用磁铁在冰上沉淀 G4 SPB，并将珠子重悬于 100 微升预热洗脱缓冲液中。立即将磁珠转移到预热的 PCR 管中，并在 37 摄氏度下孵育 30 秒。

立即加入 12 微升 5 摩尔氯化钠，用力上下移液 20 至 30 次。洗脱缓冲液中所含的高盐和 ATP 的组合用于从 G4 微珠中洗脱重组 G4R1。立即用磁铁沉淀 G4 SPB，并将含有洗脱液的蛋白质转移到冰上的新鲜 PCR 管中。

重复洗脱和转移后，最终产物是大约 200 μL 的洗脱缓冲液，含有纯化的重组 G4R1。最后，进行质量控制酶活性测定，以测试是否如文本方案中所述纯化了高活性重组 G4R1。G4 检测试剂盒可检测重组 G4R1 酶活性。

在酶的 0.2 至 0.013 μL 范围内，通常观察到 0.2 皮摩尔的四甲基罗丹明标记的四分子 G4 DNA 的 50% 转化为单体。纯化的重组 G4R1 的考马斯状态表明，预期的 120 道尔顿大小的单个条带，大约 75 道尔顿的轻微污染条带。该条带可能代表截短的重组 G4R1，它保持了以 ATP 依赖性方式将 G4 DNA 珠结合到洗脱液中的能力。

根据蛋白质标准曲线对感兴趣的条带进行定量。该方案通常每 1 升细菌培养物获得 200 微升 20 至 100 纳摩尔纯化酶。观看本视频后，您应该对如何使用独特的 ATP 依赖性纯化步骤从细菌表达系统中纯化 G4 Resolvase1 蛋白有很好的了解，以分离出近乎纯且具有催化活性的酶。

一旦掌握并预先制备冷冻细菌沉淀，即可在大约 6 小时内完成重组 G4R1 的纯化。为了保持酶的最佳催化活性，除非另有说明，否则将制剂保存在冰上很重要。始终使用蛋白酶抑制剂。

避免在试管中形成气泡。快速冷冻纯化的酶，避免不必要的冻融循环。开发后，这项技术为该领域的研究人员准确定义这种蛋白质与各种 DNA 和 RNA 底物的结合亲和力和解旋酶活性铺平了道路。

该方法也适用于纯化其他 ATP 依赖性核酸酶，其中酶促反应的产物不再是酶的结合底物。