全细胞贴片记录用于电泳生理测定通道视紫质中的离子选择性

本文介绍了如何使用 HEK293 细胞通过电生理全细胞膜片钳记录来确定通道视紫红质的离子选择性。在这里，展示了研究阴离子选择性通道视紫红质的氯化物选择性的实验程序。然而，该程序可转移到具有不同选择性的其他通道视紫红质上。

本实验的总体目标是确定新的光门控离子通道的氯选择性。这种方法可以回答通道视紫红质生物物理学中的关键问题，例如光电流振幅、动力学和离子选择性。该技术的主要优点是直接读取生物物理通道活性，可快速且易于复制。

通常，刚接触这种方法的个体会很挣扎，因为从制备 HEK 细胞到记录光电流的实验程序的每一步都必须进行优化。HEK 细胞的接种和横切将由 Altina Klein 演示。要开始此过程，请在单独的烧杯中称量 100 毫升细胞内和 500 毫升细胞外缓冲溶液的固体成分。

然后加入相应量的制备的储备溶液。接下来加入超纯水，并使用酸和碱小心调节 pH 值。然后用葡萄糖将细胞内和细胞外溶液的渗透压分别调节至 290 毫奥斯摩尔和 320 毫摩尔。

在此过程中，将最多三个赖氨酸涂层的玻璃盖玻片并排放置在 35 毫米培养皿中。然后将 1.5 倍 10 接种到第五个 HEK 细胞中，在每个培养皿中加入 2 毫升补充有 10% FBS 和 1 微摩尔视黄醇的标准 DMEM。要转染每个培养皿的细胞，请在 250 μL 不含 FBS 的 DMEM 和 6 μL 转染试剂中制备 2 μg 质粒 DNA 的溶液。

孵育 15 分钟后，轻轻地将溶液加入细胞中。测量前，使用微量移液器拉拔器拉出一些低电阻贴片移液器并对其进行火抛光。将移液器存放在无尘容器中以备测量当天使用。

录制前 30 分钟，打开所有设置组件以加热至工作温度。确保缓冲液处于室温下。首先，用硅密封测量室，以防止外部缓冲液泄漏。

然后将一个盖玻片放入腔室并关闭。用细胞外缓冲液小心填充腔室，以防止细胞分离。将培养皿与其他盖玻片一起存放在培养箱中，用于下一组实验。

然后使用 40 倍物镜将测量室置于显微镜下进行细胞可视化。接下来，在浴槽电极上放置一个俄歇桥，并将其与液位传感器和浴槽处理器的灌注出口一起放入腔室中。用 1 毫升新鲜的外部溶液交换细胞外溶液两次，以去除残留的培养基和分离的细胞。

聚焦细胞并寻找需要从其他细胞中分离的转染细胞。然后使用三波段滤镜组和橙色光来激发和可视化 mCherry。接下来，用细胞内溶液填充其中一个拉出的移液器。

并通过翻转移液器数次去除气泡。然后将移液器安装在移液器支架上，并施加一些正压以防止吸头堵塞。在显微镜下找到补片移液器的尖端，并使用显微作器将其导航至靠近细胞的位置。

在数据采集软件中，以 Bath 模式启动膜测试并施加电压步长。检查移液器电阻是否在 1.3 至 3.0 兆欧的所需范围内。然后将偏移电流归零，并通过转动放大器上的移液器偏移旋钮来调节移液器电位。

要在全细胞配置中建立贴剂，用贴剂移液管从顶部慢慢接近细胞，并在接触细胞之前释放正压。有时，cell attached configuration 在此之后会自行形成。接近细胞后，将膜测试从 Bath 模式更改为 Patch 模式。

通过转动移液器电容补偿旋钮来补偿移液器电容，以获得测试脉冲的平坦响应。将膜测试切换到细胞模式。然后通过施加短脉冲负压或负压并增加强度来破坏密封，以获得全细胞确认，从而在不破坏密封的情况下破裂贴片。

通过设置两个全电池参数（电池电容和串联电阻）来启动串联电阻补偿。在串联电阻补偿面板中，开启高达 90% 的预测和校正，然后打开全电池补偿开关，以迭代方式调整全电池参数，以获得理想的平坦测试密封响应。建立全细胞配置后，至少等待两分钟后再记录，以确保通过贴片移液器充分更换细胞内溶液。

记录不同保持电位下的光感应电流。接下来，在不破坏贴片的情况下，将细胞外缓冲液交换为腔室中的低氯化物至少五次，并在新的氯化物浓度下记录另一个电流电压关系。该图显示，在绿光照明期间，PsACR1 具有快速瞬态电流，该电流会迅速衰减到稳态电流水平。

关灯后，光电流在几毫秒内衰减到零。降低细胞外氯化物浓度完全消除了向外的光电流。交换细胞外氯离子浓度会导致反向电位发生变化，这可以从电流电压图中推断出来。

通过多次测量评估反向电位可量化由外部氯化物浓度变化引起的剧烈反向电位偏移。引人注目的是，测得的反转电位与计算的氯化物能斯特电位直接对应，这证实了 PsACR1 的高氯化物选择性。观看此视频后，您应该对如何在表达通道视紫红质的 HEK 细胞上进行光诱导光电流的电生理记录有很好的了解。

一旦掌握，整个过程可以在四天内完成，而光电流的记录需要几个小时。作为对该程序的补充，可以进行定点诱变和光谱分析，以进一步阐明通道视紫红质的结构特征和细胞机制。通道视紫红质的表征和分子工程为神经科学研究人员通过光纵选定神经元的兴奋性铺平了道路。