Name: 全细胞贴片记录用于电泳生理测定通道视紫质中的离子选择性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 学习全细胞贴片记录技术用于测定通道视紫红质的氯离子选择性。该方法在HEK293细胞中直接测量光电流幅度与动力学特性，为光控离子通道的生物物理学研究提供可重复的实验方案。

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感谢Maila Reh、Tharsana Tharmalingam，特别是Altina Klein提供的出色技术协助。本工作由德国研究基金会（DFG）（SFB1078 B2、FOR1279 SPP1665项目资助P. H.）以及催化统一概念卓越集群UniCat、BIG-NSE（J.V.）和E4（P.H.）资助。

<img alt="图1" src="/files/ftp_upload/55497/55497fig1.jpg" /> 
图1：膜片钳装置。 （1）光源，（2）光纤，（3）可编程快门，（4）数字转换器，（5）快门驱动器，（6）放大器，（7）灌流系统，（8）个人计算机，（9）显示器，（10）法拉第屏蔽笼，（11）显微镜载物台，（12）灌流入口，（13）灌流出口，（14）记录室，（15）液位传感器，（16）带琼脂桥的浴槽电极，（17）移液管固定器，（18）探头端，（19）显微操作器，（20）倒置显微镜，（21）显微镜灯外壳，（22）显微镜灯电源，（23）注水U形管，（24）三通阀，（25）防震台，（26）CCD相机。（A）装置的照片和（B）示意图。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55497/55497fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
1. 录制前的准备工作
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>细胞内</td>
			<td>细胞外1</td>
			<td>细胞外2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>高氯</td>
			<td>高氯</td>
			<td>低氯</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>c&#160; [mM]</td>
			<td>c&#160; [mM]</td>
			<td>c&#160; [mM]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-ASP</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>110</td>
			<td>140</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>10</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH</td>
			<td>7.2</td>
			<td>7.2</td>
			<td>7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>osmolarity&#160;</td>
			<td>290 mOsm</td>
			<td>320 mOsm</td>
			<td>320 mOsm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：缓冲溶液的离子组成。 HEK细胞中氯离子选择性实验所用的细胞内（intra.）和细胞外（extra.）缓冲液组成。所用缩写：乙二醇双四乙酸（EGTA）、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和天冬氨酸（ASP）。所有浓度单位均为 mM。
<ol>
	<li>按照表1中所示的离子浓度配制记录溶液。
	<ol>
		<li>用超纯水配制15 mL的2 M MgCl2、CaCl2、KCl和CsCl储备液。</li>
		<li>根据表1，分别称取100 mL细胞内缓冲液和500 mL细胞外缓冲液所需的固体成分，置于不同的烧杯中，随后加入相应体积的上述储备液。例如，对于细胞内缓冲液，加入0.3803 g（10 mM）EGTA、0.2383 g（10 mM）HEPES和0.6428 g（110 mM）NaCl，并加入100 µL的2 M MgCl2和CaCl2储备液，以及50 µL的2 M KCl和CsCl储备液。</li>
		<li>加入超纯水，并使用不干扰测量的酸和碱小心调节pH值，即不会被ChR传导的酸和碱，如柠檬酸和N-甲基-D-葡糖胺（NMG+）。</li>
		<li>用葡萄糖将细胞内溶液的渗透压调节至290 mOsm，细胞外溶液调节至320 mOsm。 
		注意：轻微低渗的细胞内溶液可提高膜片钳封接的成功率26。</li>
		<li>所有溶液均通过0.22-µm滤器无菌过滤。溶液可在4 °C下保存两周，或在-20 °C下长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算液接电位并准备记录程序。 
	注意：全细胞记录模式建立后，细胞外氯离子浓度的变化会引起显著的液接电位（LJP），必须进行校正27,28。LJP可直接测量或计算，本方案采用计算方法。本实验中将使用在线校正，因此每种细胞外缓冲液需准备一个独立的记录程序。然而，若涉及较多细胞外溶液，建议采用事后校正以避免错误校正。
	<ol>
		<li>打开液接电位计算器（JPC）27，并打开“新建实验”对话框。选择“膜片钳测量”，再选择“全细胞测量”和“标准盐溶液电极”，并输入温度25 °C。每一步操作后，点击“下一步”按钮进入下一阶段。 
		注意：实验在空调控制的实验室中于25 °C室温下进行。确保缓冲液在实验开始前已达到室温。如需改变样品温度，可使用孵育台或温控腔室。浴槽温度可使用温度计定期测量。</li>
		<li>根据表1列出的浓度，输入移液管内溶液和高氯缓冲液中所有阴离子和阳离子的浓度。 
		注意：JPC将计算出初始条件下的LJP为-0.5 mV。</li>
		<li>点击“新建浴槽溶液”以输入低氯缓冲液的阴离子和阳离子组成。 
		注意：JPC将根据改变后的细胞外记录溶液计算出新的LJP为+12.6 mV。</li>
		<li>通过从施加的钳制电位中减去计算出的LJP，为两种测量条件分别准备两个LJP校正后的记录程序：高氯条件下减去-0.5 mV，低氯条件下减去+12.6 mV。因此，两个程序的起始钳制电位分别为-79.5 mV（高氯）和-92.6 mV（低氯），以确保两种情况下LJP校正后的起始钳制电位均为-80 mV。 
		注意：以下步骤适用于材料表中提到的数据采集软件。</li>
		<li>在采集软件中打开程序编辑器，切换至“模式”菜单，选择“事件刺激”，并设置7次扫描。</li>
		<li>切换至编辑器中的“波形”菜单，设置一个持续200 ms、钳制电位为0 mV的阶段，随后是一个持续2 s、起始钳制电位为-79.5 mV（高氯条件）并逐步变化的阶段。在第二阶段设置“电位增量”为20 mV，使每次扫描的钳制电位增加20 mV。</li>
		<li>在波形编辑器的电压阶跃期间，设置一个持续500 ms、波长为540 nm（3.10 mW/mm²）的光照阶段。为此，将控制光源的快门的“数字位模式”设置为在上述第二阶段开始后500 ms激活（参见1.2.6）。 
		注意：光强可能影响通道电流的生物物理特性，如幅度或失活。因此，光功率密度必须始终报告。为测量光通过所有光学元件和盖玻片后的功率，应使用校准过的光功率计。为计算功率密度，需使用物镜测微尺测定物镜照明区域，并将测得的光功率除以该照明面积。</li>
		<li>保存高氯细胞外溶液的记录程序。修改该程序，将第一阶段的钳制电位替换为-92.6&#160;mV（低细胞外氯），并保存第二个程序用于测量低氯细胞外条件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照改良方案对玻璃盖玻片进行赖氨酸包被29。
	<ol>
		<li>将约100片盖玻片放入玻璃培养皿中，加入250 mL 1 N HCl。</li>
		<li>将装有盖玻片的培养皿置于线性摇床上，以120 rpm振荡72小时以清洁盖玻片，随后用超纯水冲洗至pH中性。</li>
		<li>用少量95%乙醇浸泡盖玻片以进一步清洁。 
		注意：清洁后的盖玻片可在70%乙醇中保存，后续操作需在层流罩中进行。</li>
		<li>使用本生灯和镊子对每片盖玻片进行火焰灼烧，然后转移至新的培养皿中。</li>
		<li>将玻璃盖玻片与无菌的50 µg/mL聚-D-赖氨酸溶液在室温下、以150 rpm线性摇动孵育至少1小时（或过夜）。</li>
		<li>用超纯水清洗盖玻片，以去除多余的聚-D-赖氨酸。</li>
		<li>将盖玻片平铺在无菌纸上干燥10分钟，并暴露于紫外线下进行灭菌（至少20分钟）。</li>
		<li>将盖玻片收集至用铝箔覆盖的无菌培养皿中，待用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用标准分子生物学技术制备与mCherry融合的PsACR1基因DNA。
	<ol>
		<li>使用限制性内切酶或其他成熟的克隆方法，将编码PsACR1的人源密码子优化基因序列克隆至peGFP-C1质粒（CMV启动子，卡那霉素抗性）中，使其与mCherry荧光蛋白阅读框一致。 
		注意：也可使用其他荧光蛋白，但需确保配备相应的滤光片组，以便在显微镜下观察其荧光信号。</li>
		<li>通过热激法将质粒DNA转化至化学感受态XL1Blue E. coli细胞中，按标准流程涂布于含30 µg/mL卡那霉素的琼脂平板上30。在37 °C下过夜培养。</li>
		<li>次日，从单菌落中挑取细胞接种于4 mL含30 µg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37 °C、180 rpm摇床中过夜培养。</li>
		<li>过夜培养后，使用市售试剂盒（见材料表）按照制造商说明从菌液中提取质粒DNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种细胞 
	注意：所有操作均在层流罩中进行。
	<ol>
		<li>将最多三片经赖氨酸包被的玻璃盖玻片并排置于35 mm培养皿中。 
		注意：轻轻按压盖玻片底部，防止其相互滑动。</li>
		<li>每皿中加入2 mL含10%胎牛血清（FBS）的标准DMEM培养基，接种1.5 × 105个HEK细胞。</li>
		<li>加入全-trans视黄醛至终浓度1 µM。继续培养至少一天后，再进行步骤1.6。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过脂质体转染法瞬时转染细胞31。
	<ol>
		<li>为每皿细胞准备含2 µg质粒DNA（按步骤1.4制备）的250 µL无FBS DMEM溶液，并加入6 µL转染试剂（见材料表）。</li>
		<li>孵育15分钟后，轻轻（逐滴）将溶液加入细胞中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备琼脂桥
	<ol>
		<li>将0.75 g琼脂糖加入50 mL无菌氯化钠溶液（140 mM）中，通过微波加热溶解。 
		注意：使用2–3 M KCl制备琼脂桥可进一步降低LJP（因离子浓度更高，例如持续从桥中扩散，且K+与Cl-迁移率相近），但为减少离子（尤其是Cl-）向浴液中的泄漏，本实验未采用此方法32。</li>
		<li>使用注射器将液态琼脂糖溶液填充至10 µL移液枪头（或细径软管）中。 
		注意：避免琼脂桥中产生气泡。</li>
		<li>琼脂桥冷却凝固后，将其保存于无菌140 mM氯化钠溶液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备记录电极和浴槽电极。
	<ol>
		<li>从膜片钳装置中取出浴槽电极和记录电极的银丝。</li>
		<li>用砂纸打磨银丝以去除前次实验残留的氯化银。将清洁后的银丝浸入3 M KCl溶液中，并连接至1.5 V电池的正极，进行电解氯化银镀层。 
		注意：可使用实验室电源替代电池。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用微电极拉制仪从玻璃毛细管中拉制低阻抗膜片电极（1.5–3.0 MΩ），并按Brown et al33所述方法进行火焰抛光。测量当天将电极保存于无尘环境中。</li>
	<li>在记录前30分钟开启所有设备，使其预热至工作温度。确保缓冲液已达到室温。</li>
</ol>
2. 选择性测量
<ol>
	<li>在完成1.6中所述细胞的瞬时转染后24至48小时开始记录。</li>
	<li>将一张盖玻片放入测量室中，并用硅胶密封以防止外部缓冲液泄漏。将装有其余盖玻片的培养皿置于孵育箱中，用于下一批实验。</li>
	<li>小心地用细胞外缓冲液（高[Cl⁻]）填充 chamber-]) 以防止细胞脱落，然后将其置于显微镜下，使用40倍物镜观察细胞。</li>
	<li>将琼脂桥置于浴电极上方，并与液面传感器及灌流出口一同放入记录室中。</li>
	<li>用 1 mL 新鲜的细胞外溶液（高 [Cl⁻]）更换细胞外溶液两次-]) 以去除残留的培养基和脱落的细胞。</li>
	<li>将细胞调至清晰对焦，寻找已转染（带荧光）的细胞，并确保该细胞与其他细胞分离。使用三通滤光片组和橙色光（590 nm；带宽15 nm；100% 强度）激发并观察 mCherry。 
	注意：HEK细胞可通过间隙连接与邻近细胞形成电耦合34 导致全细胞构型下膜电阻较低。</li>
	<li>用细胞内液填充一支拉制好的移液管，并通过多次翻转移液管以去除气泡。</li>
	<li>将移液器安装在移液器架上，并施加一定的正压以防止吸头堵塞。</li>
	<li>在显微镜下找到膜片钳电极尖端，并使用显微操作器将其移至细胞附近。 
	注意：以下步骤适用于材料清单中提到的放大器、数据采集和评估软件。</li>
	<li>开始 &#34;膜测试&#34; 在数据采集软件中施加一个电压阶跃（测试脉冲； 例如 5 mV 持续 10 ms，基线为 0 mV），通过指定软件手动或自动进行 &#34;灌流模式&#34; 同时运行 &#34;膜测试&#34; 在数据采集软件中。</li>
	<li>检查移液管电阻是否处于理想范围（1.5–3.0 MΩ）&#937;).</li>
	<li>通过调节放大器上的移液电极偏置旋钮，在操作过程中调整移液电极电位以消除零偏移电流 &#34;浴槽模式&#34; 的 &#34;膜检测&#34;.</li>
	<li>建立全细胞记录模式的膜片钳26. 
	注意：以下步骤需要向所用移液器 holder 的侧端口施加正压和负压。可通过注射器、吹嘴或电子控制的压力调节器实现。本方案中采用正压和负压 通过 一个吹嘴。
	<ol>
		<li>从上方缓慢将膜片电极移向细胞，并在即将接触细胞时解除正压。 
		注意：当电极尖端接近细胞时，电阻会略有上升；这表现为测试脉冲的幅度减小。</li>
		<li>更换 &#34;膜测试&#34; 从 &#34;灌流模式&#34; 到 &#34;膜片钳模式&#34; 因此将钳制电位设定为细胞预期的静息电位（-30 至 -40 mV）。</li>
		<li>在某些情况下，撤去正压（2.13.1）后会自动形成细胞贴附构型；若未形成，可轻轻施加负压以促进吉封（gigaseal）的形成。 
		注意：当测试脉冲减小为脉冲起始和结束时的两个微小电容峰，且膜电阻处于 GΩ 范围时，即形成细胞贴附式构型。&#937; 范围；最高达 -60 mV 的负电压可能有助于吉欧封接的形成。</li>
		<li>通过旋转来补偿移液管电容 &#34;移液管电容补偿&#34; 调节旋钮以获得测试脉冲的平坦响应。</li>
		<li>通过施加短暂的负压脉冲或强度逐渐增加的负压，使膜片破裂但不破坏封接，以获得全细胞构型。 
		注意：从细胞贴附式到全细胞构型的成功转换以电容峰的增大为标志。</li>
		<li>通过设置所用放大器的全细胞参数和补偿调节，应用串联电阻补偿，以准确将膜电位钳制在目标钳制电压。
		<ol>
			<li>切换 &#34;膜测试&#34; 到 &#34;全细胞&#34; 模式，在 &#34;串联电阻补偿&#34; 面板开启 &#34;预测&#34; 和 &#34;校正&#34; 高达90%，以避免电容响应的过冲和振荡，打开全细胞补偿开关，并使用相应的前面板旋钮调节全细胞参数（&#34;全细胞电容&#34; 和 &#34;串联电阻&#34;通过迭代方式调节放大器的增益，以获得理想平坦的测试密封响应。 
			注意：有关串联电阻补偿与校正的详细说明，请参考放大器使用手册或相关指南，因不同厂商的设备操作流程可能存在差异。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>建立全细胞记录模式后，需等待至少2分钟再开始记录，以确保通过膜片钳电极充分置换细胞内液。35.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用先前建立的方案（1.2 节中设置的方案），在不同钳制电位下记录光诱导电流。</li>
	<li>将细胞外缓冲液更换为低 [Cl-] 在不破坏封接的情况下，至少在腔室中重复五次，并记录另一条电流-电压关系曲线（参见 步骤1.2）在新的氯化物浓度下。 
	注：使用自动缓冲液置换的灌流系统可促进该过程，但并非必需。</li>
	<li>对每种待测离子条件重复步骤 2.15，但在各次测量之间需反复通过以下方式检查封接质量 &#34;膜检测&#34; 如上所述。 
	注意：为确保膜电位准确及细胞内离子成分稳定，膜电阻应高于 500 MΩ&#937; 而接入电阻不应超过 10 MΩ&#937;，参见. 2.12.6）。进行膜测试时，切记关闭全细胞参数补偿。</li>
	<li>重复步骤2.2至2.15，对多个细胞进行操作，但每次测试系列需使用新的盖玻片，以确保细胞的健康状态。</li>
</ol>
3. 数据评估
<ol>
	<li>通过减去光照前的平均电流，调整每条电流轨迹的基线。</li>
	<li>通过取光照最后 40 ms 内的电流平均值，计算稳态光电流 Is（图 2A）。 
	注意：根据实验方案或科学问题，可分析峰值光电流或调整平均时间长度以确定稳态光电流。</li>
	<li>对所有测试条件和不同细胞重复步骤 3.1）和 3.2）。</li>
	<li>将测定的光电流对相应的钳制电位作图。 
	注意：若对多个测量值进行平均，可将单个记录归一化至某一特定条件或细胞电容。</li>
	<li>电流-电压关系曲线与电压轴的交点即为反转电位（净电流为零）。通过相邻两个数据点之间的线性插值确定该值。 
	注意：若光电流未发生极性反转，可从最接近零的最后两个点进行线性外推，以估算交点位置。</li>
	<li>对相同条件下的测定反转电位取平均，并将其对细胞外缓冲液的氯离子浓度作图（参见 图 2B）。</li>
</ol>

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<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+differentiating+photocurrent+properties+of+two+channelrhodopsins+from+chlamydomonas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from chlamydomonas.</a> J. Biol. Chem. 284 (9), 5685-5696 (2009).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在特定的离子和电学条件下测定反转电位，可提供光激活通道视紫红质（ChRs）后转运离子种类的信息。若在复杂的生理介质中仅改变一种离子种类，且测得的反转电位按理论能斯特电位发生偏移，则表明该离子种类是唯一被转运的离子。
然而，对于通道视紫红质（ChRs），由于对不同离子种类的通透性以及传导离子之间的竞争，其反转电位的偏移通常比根据能斯特方程预期的要小。在这种情况下，情况变得更加复杂，必须分别交换所有可能被传导的离子，因而需要多种测量溶液。此外，大多数CCR以及首批人工ACR9,10,21对质子具有通透性，而质子浓度的变化需要特别细致的分析，因为质子浓度不仅可能改变反转电位，还可能通过影响氢键网络、个别残基的质子化状态以及二级结构的变化，进而影响离子电导9、光流动力学21,<sup cl...

通道视紫红质（Channelrhodopsins，ChR）是一类存在于运动性绿藻眼点中的光控离子通道，作为趋光性和避光反应的主要光感受器。1自2002年首次被描述以来2，光敏通道蛋白为新兴的光遗传学领域奠定了基础，并可应用于多种可兴奋细胞 例如 在骨骼肌、心脏或大脑中3,4,5. ChRs 在靶细胞中的表达可使相应细胞的离子通透性受到光的控制。在神经元环境中，这能够实现细胞的光控激活6,7,8 或抑制9,10 动作电位（AP）发放的特性——取决于所传导的离子——可通过光实现空间和时间上的精确控制，这突显了视蛋白变体的离子选择性如何决定其在光遗传学中的应用。
最早发现的ChRs来自 莱茵衣藻 和 衣藻属卡特里种 对质子具有通透性，同时也允许钠、钾等单价阳离子通过，对钙和镁等二价阳离子也有一定程度的通透性11,12,13如今，已有超过70种天然的阳离子通道视紫红质（CCRs）14,15,16,17 以及若干工程化变体18,19,20 具有不同性质，例如 光电流大小、光谱敏感性、动力学特性及阳离子选择性等方面均已得到表征。在神经科学领域，通道型视紫红质（CCRs）被用于激活细胞并触发动作电位（APs）；而在多年中，光驱动的微生物泵是沉默神经元所仅有的可用拮抗工具。2014年，两个研究团队同时证明，通过分子工程手段改变假定离子传导孔道内的极性，可将CCRs转化为阴离子传导型通道视紫红质（ACRs）。9,21随后，在多种隐藻藻类中鉴定了天然的ACRs22,23,24最重要的是，光激活 ACRs 可介导成年神经元中的氯离子电流，从而在远低于微生物泵所需的光强度下实现神经元活动的抑制，因为微生物泵每吸收一个光子仅转运单个电荷。
通过膜片钳电生理记录技术检测HEK293细胞中光诱导电流，可直接评估ChR的活性。膜片钳技术最初于20世纪70年代末开发25，后由Hamill et al. 进一步改进，能够以高电流分辨率记录单个小细胞的总电流（全细胞模式），并直接控制膜电压26。在细胞培养体系中应用该技术，可精确控制离子环境及电生理记录条件，从而研究离子选择性以及不同离子对总电流的相对贡献。本文以Proteomonas sulcata的阴离子通道视紫红质（PsACR1）22,23为例，通过在不同细胞外氯离子浓度下记录电流-电压关系，验证其对氯离子的高通透性。

<table><tbody><tr><td>HEK293细胞</td><td>Sigma Aldrich</td><td>85120602</td><td>人胚胎肾细胞</td></tr><tr><td>视黄醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2500</td><td>全反式视黄醛</td></tr><tr><td>FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrome</td><td>FG 0445</td><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Roth</td><td>3810</td><td>琼脂桥</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Roth</td><td>5239</td><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Biomol</td><td>2452</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Roth</td><td>3054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biochrome</td><td>S0615</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Roth</td><td>HN06</td><td>D(+)-葡萄糖</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>6781</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Roth</td><td>2189</td><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957</td><td></td></tr><tr><td>NMG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004</td><td>N-甲基-D-葡糖胺</td></tr><tr><td>Na-天冬氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6683</td><td>L-天冬氨酸钠盐一水合物</td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Roth</td><td>6490</td><td></td></tr><tr><td>AgeI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER1462</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER0695</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>NheI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER0975</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>XL1Blue &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Agilent Technologies</td><td>200249</td><td>化学感受态&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Roth</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>LB培养基</td><td>Roth</td><td>X964</td><td></td></tr><tr><td>琼脂粉</td><td>Roth</td><td>6494</td><td>琼脂平板</td></tr><tr><td>质粒提取试剂盒</td><td>Marchery-Nagel</td><td>740727.25</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Biochrome</td><td>A 2213</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸氢溴酸盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>盖玻片包被</td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>定制</td><td></td><td>火焰抛光</td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>TPP</td><td></td><td>不同规格</td></tr><tr><td>超净工作台</td><td>Kojair</td><td>Biowizard SL130</td><td></td></tr><tr><td>搅拌器</td><td>IKA</td><td>RCT classic</td><td></td></tr><tr><td>银丝</td><td>Science Products</td><td>AG-T25; AG-T10</td><td>电极，0.64 mm（浴槽）；0.25 mm（电极）</td></tr><tr><td>pH计</td><td>Knick</td><td>765 Calimetric</td><td></td></tr><tr><td>渗透压计</td><td>Vogel</td><td>OM 815</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>ID03</td><td>火焰抛光</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;培养箱</td><td>Binder</td><td>CB150</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿</td><td>TPP</td><td>93040</td><td>内径34 mm</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Roth</td><td>P232</td><td>直径15 mm</td></tr><tr><td>温度计</td><td>R&amp;ouml;ssel Messtechnik</td><td>MTM12</td><td></td></tr><tr><td>分光镜</td><td>Chroma</td><td>21011</td><td>90/10透射</td></tr><tr><td>移液器支架</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>PPH-1P-AXU-0-1.5</td><td></td></tr><tr><td>前置放大器</td><td>Molecular Devices</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>放大器</td><td>Molecular Devices</td><td>AxoPatch200B</td><td></td></tr><tr><td>数模转换器</td><td>Molecular Devices</td><td>DigiData1400</td><td>数字模拟转换器</td></tr><tr><td>光源</td><td>TILL Photonics</td><td>Polychrome V</td><td>设定为540 nm全强度</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 100</td><td></td></tr><tr><td>快门</td><td>Vincent Associates</td><td>VS25</td><td></td></tr><tr><td>快门驱动器</td><td>Vincent Associates</td><td>VCM-D1</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>Warner Instruments</td><td>G150F-3</td><td>硼硅酸盐毛细管，末端火焰抛光，外径1.5 mm，内径&amp;nbsp;0.86 mm</td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P1000</td><td></td></tr><tr><td>灌流系统</td><td>Lorenz Messger&amp;auml;tebau</td><td>MPCU</td><td></td></tr><tr><td>三通道滤光片组</td><td>Chroma</td><td>69008</td><td>荧光滤光片&amp;nbsp; ECFP/EYFP/mCherry&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CCD相机</td><td>Watec</td><td>Wat-221SCCD</td><td></td></tr><tr><td>光度计</td><td>Gigahertz Optik</td><td>P9710</td><td>测量光强</td></tr><tr><td>物镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>421462-9900-000</td><td>W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC</td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>记录室</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电源</td><td>Manson</td><td>HCS-3202</td><td>避免显微镜内置电源产生的电噪声</td></tr><tr><td>防震台</td><td>Newport</td><td>M-VW-3636-OPT-01</td><td></td></tr><tr><td>法拉第笼</td><td>定制或任何匹配的商用台</td><td></td><td></td></tr><tr><td>管路</td><td>任意商用，例如Roth</td><td></td><td>不同尺寸和材质，用于灌流系统和微电极压力施加；琼脂桥</td></tr><tr><td>线性摇床</td><td>Sunlab Instruments</td><td>SU 1000</td><td></td></tr><tr><td>液接电位计算器</td><td>Molecular Devices 或直接来自 Peter H. Barry</td><td></td><td>程序包含在Clampex采集软件中，或可从&amp;nbsp; p.barry@unsw.edu.au 获取</td></tr><tr><td>数据采集软件</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampex 10.X</td><td></td></tr><tr><td>数据分析软件</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampfit 10.X</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Ps&lt;/em&gt;ACR1</td><td>GenBank 或 Addgene</td><td>KF992074.1 或 Addgene 质粒 #85465</td><td>编码&lt;em&gt;Ps&lt;/em&gt;ACR1 蛋白的基因</td></tr><tr><td>放大器使用指南</td><td>Molecular Devices</td><td>The Axon Guide</td><td></td></tr></tbody></table>

全细胞膜片钳记录法用于光敏通道蛋白离子选择性的电生理测定

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

在过去的十年中，通道视紫红质已成为神经科学研究中不可或缺的工具，可用于非侵入性地调控靶细胞中的电学过程。在这一背景下，通道视紫红质的离子选择性尤为重要。本文描述了通过在HEK293细胞上进行电生理膜片钳记录，研究最近发现的源自Proteomonas sulcata的阴离子传导型通道视紫红质的氯离子选择性。测量光门控光电流的实验过程需要一个可快速切换——理想情况下为单色光——的光源，并将其耦合至常规膜片钳装置的显微镜中。实验前的准备工作包括缓冲溶液的配制、液接电位的考虑、细胞的接种与转染，以及膜片电极的拉制。实际记录不同氯离子浓度下的电流-电压关系以确定其反转电位，通常在转染后24至48小时内进行。最后，将电生理数据结合氯离子传导的理论模型进行分析。

图2展示了按照所述方案进行测量所获得的代表性结果。在绿光照射期间，PsACR1表现出一个快速的瞬时电流，随后迅速衰减至一个稳定的电流水平。光照关闭后，光电流在数毫秒内衰减至零（图2A）。改变细胞外氯离子浓度会引起反转电位的偏移，该偏移可直接在记录的光电流轨迹中观察到。通过对多次测量的反转电位进行分析，可量化因外部氯离子浓度变化所引起的显著反转电位偏移（图2B）。值得注意的是，实测的反转电位与氯离子的计算能斯特电位完全一致（图2C），证实了PsACR1具有高度的氯离子选择性。
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本文介绍了如何利用HEK293细胞进行电生理全细胞膜片钳记录，以测定通道视紫红质的离子选择性。此处演示了研究一种阴离子选择性通道视紫红质对氯离子选择性的实验步骤。然而，该方法同样适用于其他具有不同选择性的通道视紫红质。

在过去的十年中，通道视紫红质已成为神经科学研究中不可或缺的工具，被用于非侵入性地操控……

本实验的总体目标是确定新型光控离子通道对氯离子的选择性。该方法可解答通道视紫红质生物物理学领域中的一些关键问题，例如光电流幅度、动力学特性以及离子选择性。该技术的主要优势在于能够直接读取生物物理水平的通道活性，且操作快速、易于重复。初学者通常会遇到困难，因为从HEK细胞的制备到光电流记录的每一步实验操作都需要进行优化。HEK细胞的接种和转染将由Altina Klein演示。开始该操作时，分别称取100毫升细胞内缓冲液和500毫升细胞外缓冲液的固体成分，放入不同的烧杯中。然后加入相应体积的已配制好的储备溶液。接着加入超纯水，并使用酸和碱小心调节pH值。随后分别用葡萄糖将细胞内液和细胞外液的渗透压调节至290毫渗量和320毫渗量。在此步骤中，将最多三片涂有赖氨酸的玻璃盖玻片并排置于一个35毫米的培养皿中。然后在每个培养皿中加入2毫升标准DMEM培养基，该培养基补充有10% FBS和1微摩尔的视黄醇，并接种1.5 × 10⁵个HEK细胞。为转染每个培养皿中的细胞，配制含有2微克质粒DNA溶于250微升不含FBS的DMEM中的溶液，并加入6微升转染试剂。孵育15分钟后，将溶液轻轻加入细胞中。测量前，使用微电极拉制仪制备一些低电阻膜片钳电极，并进行火焰抛光。将电极存放于无尘容器中，供当天测量使用。记录开始前30分钟，打开所有装置组件，使其升温至工作温度。确保缓冲液处于室温。开始时，用硅胶密封测量室，以防止外部缓冲液泄漏。然后将一张盖玻片放入腔室并关闭。小心地用细胞外缓冲液填充腔室，以防止细胞脱落。将装有其他盖玻片的培养皿置于孵育箱中，用于下一轮实验。然后将测量室置于显微镜下，使用40倍物镜观察细胞。接着将Auger桥置于浴电极上方，并将其连同液面传感器和灌流出口一并放入测量室中。用一毫升新鲜的外部溶液更换细胞外溶液两次，以去除残留的培养基和脱落的细胞。将细胞调至清晰对焦，寻找需要与其他细胞分离的转染细胞。然后使用三波段滤光片组和橙色光激发并观察 mCherry。接着，用细胞内溶液填充一支拉制好的移液管。通过反复倒置移液管数次去除气泡。随后将移液管安装在移液管架上，并施加一定的正压以防止吸头堵塞。在显微镜下找到膜片钳移液管的尖端，使用显微操作器将其移动至细胞附近。在数据采集软件中，以浴液模式启动膜测试并施加电压阶跃。检查移液管电阻是否处于期望的1.3至3.0兆欧范围内。然后将偏移电流归零，并通过调节放大器上的移液管偏移旋钮来调整移液管电位。建立全细胞记录模式时，从上方缓慢移动记录电极接近细胞，并在接触细胞前立即释放正压。有时在此之后会自动形成细胞贴附模式。接近细胞后，将膜片测试模式从浴液模式（Bath mode）切换至膜片模式（Patch mode）。通过调节移液管电容补偿旋钮，使测试脉冲的响应呈平坦状态，从而补偿移液管电容。将膜测试切换至细胞模式。然后施加短暂的负压脉冲或强度逐渐增加的负压，破坏膜片但不破坏封接，以获得全细胞记录的确认。通过设置全细胞模式的两个参数——细胞电容和串联电阻，开始串联电阻补偿。在串联电阻补偿面板中，开启预测和校正功能，最高补偿至90%。然后打开全细胞补偿开关，并以迭代方式调节全细胞参数，以获得理想平坦的测试封接响应。建立全细胞记录构型后，至少等待两分钟再开始记录，以确保通过膜片电极充分置换细胞内溶液。在不同的钳制电位下记录光诱导电流。随后，在不破坏膜片的情况下，至少用低氯细胞外液在记录 chamber 中置换五次，然后在新的氯离子浓度下记录另一组电流-电压关系。该图显示，在绿光照射期间，PsACR1 表现出一个快速的瞬时电流，该电流迅速衰减至一个稳定的电流水平。关闭光照后，光电流在数毫秒内衰减至零。降低细胞外氯离子浓度会完全消除外向光电流。改变细胞外氯离子浓度会引起反转电位的偏移，该偏移可通过电流-电压关系曲线推断得出。通过多次测量结果评估反转电位，可以量化外部氯离子浓度变化所引起的显著反转电位偏移。值得注意的是，实测的反转电位与氯离子的计算能斯特电位直接对应，这证实了PsACR1具有高度的氯离子选择性。观看本视频后，您应能够充分理解如何对表达通道视紫红质的HEK细胞进行光诱导光电流的电生理记录。一旦掌握，整个实验可在四天内完成，而光流记录则需要数小时。结合该实验方法，可进一步开展定点诱变和光谱学方法，以深入阐明通道视紫红质的结构特征及其细胞作用机制。通道视紫红质的表征与分子工程研究为神经科学领域的研究人员利用光来调控特定神经元的兴奋性奠定了基础。

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