全细胞膜片钳记录法用于光敏通道蛋白离子选择性的电生理测定

本实验的总体目标是确定新型光控离子通道对氯离子的选择性。该方法可解答通道视紫红质生物物理学领域中的一些关键问题，例如光电流幅度、动力学特性以及离子选择性。该技术的主要优势在于能够直接读取生物物理水平的通道活性，且操作快速、易于重复。

初学者通常会遇到困难，因为从HEK细胞的制备到光电流记录的每一步实验操作都需要进行优化。HEK细胞的接种和转染将由Altina Klein演示。开始该操作时，分别称取100毫升细胞内缓冲液和500毫升细胞外缓冲液的固体成分，放入不同的烧杯中。

然后加入相应体积的已配制好的储备溶液。接着加入超纯水，并使用酸和碱小心调节pH值。随后分别用葡萄糖将细胞内液和细胞外液的渗透压调节至290毫渗量和320毫渗量。

在此步骤中，将最多三片涂有赖氨酸的玻璃盖玻片并排置于一个35毫米的培养皿中。然后在每个培养皿中加入2毫升标准DMEM培养基，该培养基补充有10% FBS和1微摩尔的视黄醇，并接种1.5 × 10⁵个HEK细胞。为转染每个培养皿中的细胞，配制含有2微克质粒DNA溶于250微升不含FBS的DMEM中的溶液，并加入6微升转染试剂。

孵育15分钟后，将溶液轻轻加入细胞中。测量前，使用微电极拉制仪制备一些低电阻膜片钳电极，并进行火焰抛光。将电极存放于无尘容器中，供当天测量使用。

记录开始前30分钟，打开所有装置组件，使其升温至工作温度。确保缓冲液处于室温。开始时，用硅胶密封测量室，以防止外部缓冲液泄漏。

然后将一张盖玻片放入腔室并关闭。小心地用细胞外缓冲液填充腔室，以防止细胞脱落。将装有其他盖玻片的培养皿置于孵育箱中，用于下一轮实验。

然后将测量室置于显微镜下，使用40倍物镜观察细胞。接着将Auger桥置于浴电极上方，并将其连同液面传感器和灌流出口一并放入测量室中。用一毫升新鲜的外部溶液更换细胞外溶液两次，以去除残留的培养基和脱落的细胞。

将细胞调至清晰对焦，寻找需要与其他细胞分离的转染细胞。然后使用三波段滤光片组和橙色光激发并观察 mCherry。接着，用细胞内溶液填充一支拉制好的移液管。

通过反复倒置移液管数次去除气泡。随后将移液管安装在移液管架上，并施加一定的正压以防止吸头堵塞。在显微镜下找到膜片钳移液管的尖端，使用显微操作器将其移动至细胞附近。

在数据采集软件中，以浴液模式启动膜测试并施加电压阶跃。检查移液管电阻是否处于期望的1.3至3.0兆欧范围内。然后将偏移电流归零，并通过调节放大器上的移液管偏移旋钮来调整移液管电位。

建立全细胞记录模式时，从上方缓慢移动记录电极接近细胞，并在接触细胞前立即释放正压。有时在此之后会自动形成细胞贴附模式。接近细胞后，将膜片测试模式从浴液模式（Bath mode）切换至膜片模式（Patch mode）。

通过调节移液管电容补偿旋钮，使测试脉冲的响应呈平坦状态，从而补偿移液管电容。将膜测试切换至细胞模式。然后施加短暂的负压脉冲或强度逐渐增加的负压，破坏膜片但不破坏封接，以获得全细胞记录的确认。

通过设置全细胞模式的两个参数——细胞电容和串联电阻，开始串联电阻补偿。在串联电阻补偿面板中，开启预测和校正功能，最高补偿至90%。然后打开全细胞补偿开关，并以迭代方式调节全细胞参数，以获得理想平坦的测试封接响应。建立全细胞记录构型后，至少等待两分钟再开始记录，以确保通过膜片电极充分置换细胞内溶液。

在不同的钳制电位下记录光诱导电流。随后，在不破坏膜片的情况下，至少用低氯细胞外液在记录 chamber 中置换五次，然后在新的氯离子浓度下记录另一组电流-电压关系。该图显示，在绿光照射期间，PsACR1 表现出一个快速的瞬时电流，该电流迅速衰减至一个稳定的电流水平。

关闭光照后，光电流在数毫秒内衰减至零。降低细胞外氯离子浓度会完全消除外向光电流。改变细胞外氯离子浓度会引起反转电位的偏移，该偏移可通过电流-电压关系曲线推断得出。

通过多次测量结果评估反转电位，可以量化外部氯离子浓度变化所引起的显著反转电位偏移。值得注意的是，实测的反转电位与氯离子的计算能斯特电位直接对应，这证实了PsACR1具有高度的氯离子选择性。观看本视频后，您应能够充分理解如何对表达通道视紫红质的HEK细胞进行光诱导光电流的电生理记录。

一旦掌握，整个实验可在四天内完成，而光流记录则需要数小时。结合该实验方法，可进一步开展定点诱变和光谱学方法，以深入阐明通道视紫红质的结构特征及其细胞作用机制。通道视紫红质的表征与分子工程研究为神经科学领域的研究人员利用光来调控特定神经元的兴奋性奠定了基础。