Name: Résoudre les complexes protéiques purifiés par affinité de Blue native PAGE et le profilage de corrélation des protéines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Découvrez la purification d'affinité des complexes protéiques suivie de blue native PAGE et spectrométrie de masse. Cette méthode simple offre une excellente résolution pour analyser les interactions protéiques en protéomique.

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<ol><li>Goudreault, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PP2A+phosphatase+high+density+interaction+network+identifies+a+novel+striatin-interacting+phosphatase+and+kinase+complex+linked+to+the+cerebral+cavernous+malformation+3+%28CCM3%29+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).</li>
<li>Leitner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+native+protein+structures+by+chemical+cross-linking%2C+mass+spectrometry%2C+and+bioinformatics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).</li>
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<li>Sinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+cross-linking+and+mass+spectrometry+to+map+three-dimensional+protein+structures+and+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions.</a> Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).</li>
<li>Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+supported+determination+of+protein+complex+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry supported determination of protein complex structure.</a> Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).</li>
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<li>Kao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+cross-linking+strategy+for+fast+and+accurate+identification+of+cross-linked+peptides+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).</li>
<li>Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterisation+and+reconstitution+of+cell+death+signalling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes.</a> Methods. 61 (2), 98-104 (2013).</li>
<li>Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+activator+Mirk%2FDyrk1B+is+sequestered+by+p38alpha%2Fbeta+MAP+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase.</a> J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).</li>
<li>Havugimana, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+soluble+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A census of human soluble protein complexes.</a> Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).</li>
<li>Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+native+protein+complexes+and+protein+isoform+variation+using+size-fractionation-based+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).</li>
<li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).</li>
<li>Liu, F., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+architecture+of+protein+assemblies+and+protein+interaction+networks+by+cross-linking+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry.</a> Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Heide, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexome+profiling+identifies+TMEM126B+as+a+component+of+the+mitochondrial+complex+I+assembly+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex.</a> Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).</li>
<li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+953+human+proteins+from+a+mitochondrial+HEK293+fraction+by+complexome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling.</a> PLoS One. 8 (7), 68340(2013).</li>
<li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS%2FMS+as+an+alternative+for+SDS-PAGE+in+blue+native+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes.</a> Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).</li>
<li>Remmerie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+tobacco+BY-2+protein+complexes+with+BN+PAGE%2FLC-MS%2FMS+and+clustering+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods.</a> J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).</li>
<li>Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+proteasome+using+Blue+Native+PAGE+and+label-free+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry.</a> Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).</li>
<li>Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Two+Distinct+Nucleosome+Remodeling+and+Deacetylase+%28NuRD%29+Complex+Assemblies+in+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+the+MaxQuant+computational+platform+for+SILAC-based+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).</li>
<li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+regulatory+factor+recruits+the+nucleosome+remodeling+complex+to+wingless+integrated+%28Wnt%29+signaling+gene+promoters+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells.</a> J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).</li>
<li>Lauberth, S. M., Rauchman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+12-amino+acid+motif+in+Sall1+recruits+the+nucleosome+remodeling+and+deacetylase+corepressor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex.</a> J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).</li>
<li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sall4+controls+differentiation+of+pluripotent+cells+independently+of+the+Nucleosome+Remodelling+and+Deacetylation+%28NuRD%29+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex.</a> Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).</li>
<li>Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+WDR5+interaction+%28Win%29+motif+recognition+in+human+SET1+family+histone+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).</li>
<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+chromatin-associated+protein+complexes+revealed+by+label-free+quantitative+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics.</a> Nucleic Acids Res. 41 (1), 28(2013).</li>
<li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+DNA+shearing+in+standard+affinity+purification+allows+simultaneous+identification+of+both+soluble+and+chromatin-bound+interaction+partners%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners.</a> J Proteomics. 100, 55-59 (2014).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schagger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+Blue+native%2FSDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates%3A+a+proteomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li>
<li>Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+profiling+of+protein+assemblies+by+cross-linking+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry.</a> Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons ici l&#39;utilisation de la purification par affinité suivie par électrophorèse sur gel natif bleu en combinaison avec la spectrométrie de masse quantitative pour résoudre des complexes de protéines. Cette approche offre une méthode pour démêler les listes d&#39;interaction des protéines unidimensionnels dans des assemblages de protéines fonctionnelles. Nous démontrons la méthode basée sur l&#39;utilisation des protéines marquées épitope. Toutefois, si une lignée cellulaire exprimant une protéine étiquetée n&#39;est pas disponible, une alternative pourrait être d&#39;utiliser des anticorps contre la protéine d&#39;intérêt, à condition qu&#39;il y est un peptide disponible pour obtenir une élution compétitive native. La quantité de matière première et de la quantité de perles pourrait devoir être modifiée en fonction du niveau d&#39;expression de la protéine cible. Nous effectuons généralement ce protocole avec 2-5 x 10 8 cellules matériau de départ, ce qui est suffisant même pour des protéines ayant des niveaux bas d&#39;expression. La composition du tampon de lyse doit être choisie de manière empirique pour obtenirprès de compléter solubilisation de l&#39;appât. Cela peut être difficile pour certains types de protéines, en particulier chromatine de liaison ou des protéines membranaires. D&#39; autres options comprennent l&#39; augmentation de la quantité de sel, à condition que le complexe de protéine à l&#39;étude est stable à teneur élevée en sel, ou en utilisant la sonication et / ou un traitement à la nuclease pour des protéines de liaison de la chromatine 20, 29. Dans le cas de protéines membranaires, de détergent ou de commutation à DDM digitonine 30 peut être souhaitable. Dans le cas des protéines de liaison d&#39; ADN, il est utile d&#39;inclure une nuclease telle que la Benzonase au cours de l&#39;étape de purification 20. L&#39;élimination complète des acides nucléiques assure que les interactions entre les protéines détectées se produisent et ne sont pas médiées par ADN. Un élément essentiel à considérer lors de l&#39;utilisation de cette approche est la stabilité du complexe sous enquête. La procédure est longue et peut impliquer preserving la protéine complexe pendant la nuit. Nous avons obtenu un bon succès avec deux complexes de remodelage de la chromatine (D. Bode et M. Pardo, données non présentées), mais cela doit être évaluée. L&#39;étape de purification par affinité peut être réduite si nécessaire. Des techniques alternatives qui permettent le fractionnement natif, comme la chromatographie d&#39;exclusion stérique, ont été largement utilisés depuis plus de 50 ans pour caractériser des complexes de protéines. Nous et d&#39; autres ont montré que la résolution native est bleu PAGE supérieure à celle obtenue par chromatographie d&#39;exclusion de taille 20, 31, 32, 33. Un autre avantage de bleu natif PAGE est qu&#39;il ne nécessite pas de systèmes de chromatographie, qui sont coûteux, mais utilise plutôt protéines équipement électrophorétique qui est très répandu dans les laboratoires. En termes de mains sur le temps, cette méthode ne comporte pas plus de travail que le GELC-MS / MS traditionnel unPPROCHE ou le fractionnement par chromatographie en phase hors ligne. Cependant, comme la plupart des techniques de fractionnement font, il a une limite à leur résolution. Complexes qui sont très homogènes ou à proximité de la masse et la forme peuvent être au-delà de la résolution offerte par native bleu PAGE, et par conséquent le protocole tel que rapporté ici pourrait ne pas réussir universellement dans la résolution de complexes distincts avec des sous-unités partagées. Il est encourageant, nous avons réussi à séparer deux complexes tétramères très similaires partageant trois sous-unités (M. Pardo, manuscrit en préparation). Étant donné que la spectrométrie de masse est devenue de plus en plus sensibles à des quantités, même infimes de interacteurs et des contaminants non spécifiques peuvent être détectés dans les échantillons AP-MS. L&#39;approche présentée ici pourrait aider à la discrimination interacteurs réelle de la contamination de fond dans la purification d&#39;affinité en focalisant l&#39;attention sur les protéines avec des pics de migration qui coïncident avec les pics de migration d&#39;appât à poids moléculaire plus élevé que celui deles protéines monomères. Plusieurs groupes ont utilisé des techniques de fractionnement de protéines suivie par le profilage de corrélation pour délimiter des complexes de protéines à l&#39; échelle cellulaire sans la nécessité d&#39; un isolement préalable 10, 11, 12, 34. Toutefois, cela peut entraîner l&#39;échec de détecter les interactions sous-stoechiométriques. L&#39;incorporation d&#39;une étape d&#39;enrichissement par la purification d&#39;affinité peut aider à surmonter cela. L&#39;approche décrite ici devrait être généralement utile pour explorer la topologie des complexes de protéines et dévoilez les multiples complexes d&#39;une protéine donnée participe à l&#39;intérieur du même contexte cellulaire. La stratégie est simple et prête à des laboratoires qui peuvent ne pas disposer d&#39;un équipement de fractionnement chromatographique coûteux à résoudre des complexes de protéines.

Dans les cellules, la plupart des protéines remplissent leurs fonctions par des interactions transitoires protéine-protéine ou par la formation d&#39;assemblages de protéines stables. La caractérisation des interactions protéine est cruciale pour la compréhension des processus cellulaires pleinement. La purification par affinité en combinaison avec la spectrométrie de masse (AP-MS) est l&#39;une des stratégies les plus couramment appliqués pour identifier les interactions entre protéines natives. Des améliorations significatives dans les capacités des instruments obtenus au cours de la dernière décennie ont fait de cette approche extrêmement puissante. Il est important de noter que les interactions identifiées par des expériences AP-MS comprennent un mélange d&#39;associations directes et indirectes entre les appâts et proies. De plus, souvent des protéines participent à plusieurs complexes différents dans le même contexte cellulaire, ce qui pourrait avoir des rôles biologiques différents, et donc les interacteurs qui sont identifiés par AP-MS peuvent représenter un mélange d&#39;assemblages protéiques distincts ou des entités fonctionnelles. Il est impossible de tirerces informations topologiques a priori à partir des listes monodimensionnels de protéines produites par de simples expériences AP-MS. Cependant, la technique peut être davantage exploité pour définir l&#39;architecture des complexes de protéines en le combinant avec une ou plusieurs méthodes pour résoudre ces assemblées. Afin de résoudre la topologie des interactions des protéines identifiées par AP-MS, plusieurs stratégies ont été appliquées. Une approche consiste à effectuer des expériences itératives AP-MS en utilisant les identifiés dans proies série d&#39;expériences précédentes comme appâts 1. Bien que très instructif, c&#39;est une tâche intensive de la main-d&#39;œuvre à la fois expérimentale et analytique. La réticulation des protéines en combinaison avec la spectrométrie de masse est de plus en plus utilisée pour dériver des informations topologiques sur les complexes protéiques 2, 3, 4, 5. Cependant, computatiol&#39;analyse finale des peptides réticulés reste une tâche difficile et est donc le goulot d&#39;étranglement dans le flux de travail. L&#39;avènement des réactifs de reticulation MS-clivables devrait faciliter la cartographie des résidus d&#39;acides aminés qui sont à proximité immédiate dans des protéines interagissant 6, 7. Une autre alternative consiste à combiner une purification par affinité avec des techniques de séparation antérieur orthogonaux 8, 9. Fractionnement chromatographique par filtration sur gel ou échange d&#39;ions, ou un fractionnement en gradient de saccharose ont également été utilisés récemment en combinaison avec la spectrométrie de masse quantitative pour décrire les complexes multiprotéiques à un niveau de l&#39; échelle du système, sans passer par l&#39;étape d&#39;isolement complexe 10, 11, 12, 13. électrophorèse bleu gel de polyacrylamide natif (BN-PAGE) a été largement appliquée àétudier les interactions des protéines natives, généralement celles impliquant des complexes de protéines de la membrane mitochondriale 14. Cette technique de séparation a également été récemment utilisé en combinaison avec une quantification de protéine sans marquage et le profilage de corrélation, non seulement sur des complexes mitochondriaux 15, 16, 17, mais aussi pour démêler les autres complexes de protéines à partir de cellules entières 18, 19. Nous avons supposé que la combinaison de purification d&#39;affinité avec les approches de fractionnement natives ultérieures et MS quantitative devrait fournir une stratégie utile pour résoudre des assemblages de protéines multiples contenant une protéine particulière. Nous décrivons ici un procédé qui combine purification d&#39;affinité basée epitope générique par électrophorèse sur gel de Polyacrylamide natif bleu des complexes isolés, suivie par sp de masse quantitativeectrometry et de protéines de profilage de corrélation, pour résoudre les multiples ensembles d&#39;une protéine peut être impliquée. Nous utilisons des cellules souches embryonnaires de souris où une protéine d&#39;intérêt fusionné à un marqueur d&#39;épitope est exprimé à partir du locus endogène pour atteindre près de l&#39;abondance physiologique et assurer natif efficace isolement complexe. Cette approche se défait les multiples interactions d&#39; une protéine exerce, de les résoudre en ensembles distincts en fonction de leurs profils de corrélation, tout en ne nécessitant pas plus de travail que GELC-MS 20 classique.

<table><tbody><tr><td>Protéine G Dynabeads</td><td>Life Technologies</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps FLAG M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20, qualité protéique, solution à 10 %</td><td>Millipore</td><td>655206</td><td></td></tr><tr><td>Diméthyl pimelimidate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>80490</td><td></td></tr><tr><td>0,2 M Tampon de triéthanolamine, pH 8,2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0449</td><td></td></tr><tr><td>3x FLAG peptide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 5K NMWCO, PES</td><td>Sartorius</td><td>VS0112</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 3-12 % Bis-Tris gel</td><td>Life Technologies</td><td>BN1001</td><td></td></tr><tr><td>20x NativePAGE Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>20x NativePAGE Cathode Additive</td><td>Life Technologies</td><td>BN2002</td><td></td></tr><tr><td>4x Tampon de chargement d’échantillon NativePAGE</td><td>Life Technologies</td><td>BN2003</td><td></td></tr><tr><td>NativeMARK</td><td>Life Technologies</td><td>LC0725</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 5 % G-250 échantillon additif&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>BN2004</td><td></td></tr><tr><td>Nunc à fond conique à 96 puits, polypropylène</td><td>Thermo</td><td>249944</td><td></td></tr><tr><td>Multiscreen HTS Système de filtration à 96 puits</td><td>Thermo</td><td>MSDVN6550</td><td></td></tr><tr><td>Nunc à 96 puits naturel</td><td>Thermo</td><td>276002</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (chlorhydrate de Tris(2-carboxyéthyl)phosphine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacétamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile, grade HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0627/17</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine, grade de séquençage</td><td>Roche</td><td>11418475001</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant (logiciel)</td><td>N.A.</td><td>N.A.</td><td>http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant</td></tr><tr><td>Perseus (logiciel)</td><td>N.A.</td><td>N.A.</td><td>http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus</td></tr></tbody></table>

résoudre les complexes protéiques purifiés par affinité de blue native page et le profilage de corrélation des protéines

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

La plupart des protéines agissent en association avec d’autres ; il est donc crucial de caractériser ces unités fonctionnelles afin de bien comprendre les processus biologiques. La purification d’affinité couplée à la spectrométrie de masse (AP-MS) est devenue la méthode de choix pour identifier les interactions protéine-protéine. Cependant, les études AP-MS conventionnelles fournissent des informations sur les interactions protéiques, mais l’information organisationnelle est perdue. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une stratégie pour démêler les assemblages fonctionnels distincts dans lesquels une protéine pourrait être impliquée, en résolvant les complexes protéiques purifiés par affinité avant leur caractérisation par spectrométrie de masse. Les complexes protéiques isolés par purification par affinité d’une protéine d’appât à l’aide d’une étiquette d’épitope et d’une élution compétitive sont séparés par électrophorèse native bleue. La comparaison des profils de migration des protéines par le biais du profilage de corrélation à l’aide de la spectrométrie de masse quantitative permet d’attribuer des protéines en interaction à des entités moléculaires distinctes. Cette méthode est capable de résoudre des complexes protéiques de poids moléculaires proches qui pourraient ne pas être résolus par les techniques chromatographiques traditionnelles telles que la filtration sur gel. Avec un peu plus de travail que l’AP-geLC-MS/MS conventionnel, nous démontrons que cette stratégie peut dans de nombreux cas être adéquate pour obtenir des informations topologiques complexes protéiques en même temps que l’identification des interactions protéiques.

Le flux de travail de la purification d&#39; affinité de protéine native bleu profil de corrélation par la stratégie de spectrométrie de masse (ABC-MS) est représentée à la figure 7. des complexes de protéines natives autour d&#39;une protéine d&#39;intérêt sont isolés par purification par affinité en utilisant des anticorps contre un marqueur épitopique (dans ce cas FLAG) et une élution compétitive. Les complexes sont résolus par BN-PAGE, et toute voie de gel est excisé en 48 sections, et préparées pour fusil de chasse LC-MS / MS. Des informations quantitatives MS est utilisée pour générer un profil de migration pour chaque protéine identifiée dans la séparation native bleu. Les protéines qui interagissent pour former un complexe affichage distincts profils de migration des pics similaires avec superposables. Quand une protéine d&#39;intérêt participe à plus d&#39;un assemblage, des pics multiples sont observés dans son profil de migration, étant donné les sous-ensembles se trouvent dans le pouvoir de résolution du gel natif bleu. Une comparaison systématique des migles profils de rations peuvent être obtenues par corrélation de la protéine en utilisant le profilage classification hiérarchique. Le dendrogramme et les intensités des pics pour toutes les fractions sont visualisées dans une carte de chaleur, ce qui facilite l&#39;identification de protéines interagissant qui appartiennent à des complexes protéiques distincts (Figure 8). Nous avons utilisé cette stratégie pour analyser les partenaires d&#39; interaction de MTA2, une sous - unité de base de la chromatine NuRD remodelage 20 complexe. Comme le montre la figure 9, le profil de migration des deux pics MTA2 affiche d&#39;intensités distinctes entre 700 kDa et 1,2 MDa, avec le pic de masse inférieure affichant une plus grande abondance. D&#39; autres sous - unités de noyau de NuRD, y compris MTA1 / 3, HDAC1 / 2 et Mbd3, ont montré motif de séparation identique, bien que les pics pour certaines des sous - unités, à savoir Chd4, Gatad2a / b et Rbbp4 / 7, ont la distribution de l&#39; abondance inverse (Figure 9A, B). En revanche, le profil de CDK2ap1, un facteur de régulation qui recrute le complexe NuRD de promoteurs de gènes Wnt 23, affiche uniquement le pic de masse plus élevée (figure 9C), et ainsi fait Sall4, un répresseur transcriptionnel qui a également été montré pour se lier NuRD 20, 24, 25. Ainsi, le fractionnement d&#39;affinité des protéines associées à MTA2 purifiées par natif bleu PAGE a été en mesure de résoudre deux formes différentes du complexe NuRD. ABC-MS permet également l&#39;identification de nouveaux interacteurs tout en les attribuant à des entités de protéines particulières. Grâce à l&#39; examen des protéines des grappes et des intensités des fractions représentées dans un thermo-plan , nous avons détecté une forte corrélation entre les sous - unités NuRD et WDR5, une sous - unité régulatrice du complexe méthyltransférase MLL 26, avec WDR5 présentant deux pics de migration qui coïncident avec les deux NuRD pEaks (figure 8), ce qui suggère une nouvelle interaction entre WDR5 et NuRD. Nous avons confirmé cette interaction par co-immunoprécipitation et co-migration en chromatographie d&#39;exclusion de taille 20. Le choix du calcul de la distance métrique dans la classification hiérarchique influencera la forme des grappes et donc les corrélations. Nous vous recommandons de tester les différents paramètres pour obtenir la meilleure adéquation avec la connaissance de l&#39;interaction existante de la protéine ou complexe d&#39;intérêt. En général , nous avons obtenu de meilleurs résultats avec la mesure de distance de Manhattan (L1) 20. Corrélation de Pearson ou métriques de distance euclidiennes ont également été rapportés pour identifier des complexes basés sur des techniques de fractionnement alternatif 10, 11, 12. le quantative données MS obtenues à partir des fractions natives bleues peuvent également être utilisés pour déterminer la stoechiométrie des complexes protéiques. La valeur iBAQ (quantification absolue en fonction de l&#39; intensité) fournit une mesure de l&#39; abondance relative des protéines identifiées 27, 28. Les valeurs iBAQ pour les membres complexes de protéines dans toutes les fractions à l&#39;intérieur d&#39;un pic de profil de migration sont normalisées par rapport à celle de la protéine d&#39;appât pour obtenir des quantités relatives. Les iBAQs normalisés à travers un pic de profil pour un élément complexe protéique donné doit suivre une courbe horizontale, et les valeurs de tendance sont le reflet de la stoechiométrie des protéines en interaction par rapport à la protéine appât. Pour une représentation plus détaillée des calculs stoechiométriques, voir 20. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig7.jpg" /> Figure 7: flux de travail schématique résumant l&#39;ABC-MS stratégie. Ce chiffre est modifié de 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig7large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig8.jpg" /> Figure 8. Classification hiérarchique des profils de migration BN-PAGE de interacteurs MTA2. protéines associées MTA2-ont été regroupés en fonction de la similitude de leurs profils de migration. Seul un sous-ensemble de la carte de chaleur contenant le complexe est représenté NuRD (ci-joint dans la zone bleue). La boîte jaune met en évidence la forte corrélation de WDR5 avec le complexe NuRD. Les poids moléculaires ont été annotées estimées à partir des distances de migration des standards protéiques dirigés dans le même gel. Cette recherche a été publiée dans Proteomics moléculaire et cellulaire 20 la Société américaine de biochimie et de Mo<html> Biologie léculaire. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig8large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 9" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig9.jpg" /> Figure 9. Profil de migration BN-PAGE de sous - unités et des protéines associées NuRD. A) les sous - unités MTA2 et NuRD présents à un motif d&#39;intensité similaire. B) les sous - unités MTA2 et NuRD avec le motif d&#39;intensité inverse. C) MTA2 et Cdk2ap1, qui est présent seulement dans le poids moléculaire plus élevé entité NuRD. Les poids moléculaires ont été annotées estimés à partir du profil de migration des standards de protéines. Cette recherche a été publiée dans Molecular and Cellular Proteomics 20 la Société américaine de biochimie et de biologie moléculaire._blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. <img alt="fichier supplémentaire" src="/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.jpg" /> Données supplémentaires: ensemble de données échantillon. fichier proteingroups.txt MaxQuant dérivés contenant des identifications de protéines et des valeurs de quantification d&#39;une expérience ABC-MS. Cette recherche a été publiée dans Molecular and Cellular Proteomics 20 la Société américaine de biochimie et de biologie moléculaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.txt" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Ici, nous présentons des protocoles pour la purification par affinité des complexes de protéines et leur séparation par PAGE native bleu, suivie par le profilage de corrélation de la protéine en utilisant le marqueur libre spectrométrie de masse quantitative. Cette méthode est utile pour résoudre interactomes dans des complexes protéiques distincts.

Résoudre les complexes protéiques purifiés par affinité de Blue native PAGE et le profilage de corrélation des protéines

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

L'objectif général de cette stratégie expérimentale est de résoudre les assemblages fonctionnels distincts dans lesquels une protéine peut être impliquée, grâce à la fractionnement par électrophorèse native bleue sur gel de polyacrylamide de complexes protéiques purifiés par affinité et au profilage de corrélation par spectrométrie de masse. Cette méthode peut aider à ajouter des informations organisationnelles aux listes de protéines générées par des expériences de spectrométrie de masse en masse après purification par affinité. Les principaux avantages de ce protocole sont sa simplicité d'exécution, sa bonne résolution et le fait qu'il nécessite peu de travail supplémentaire par rapport à la spectrométrie CMSMS conventionnelle sur gel.Ce protocole est optimisé pour la purification de complexes protéiques à partir de 200 à 500 millions de cellules exprimant des niveaux endogènes d'une protéine marquée par un FLAG. Après décongélation du culot cellulaire, comme décrit dans le protocole écrit, ajouter cinq millilitres de tampon de lyse glacé contenant du DTT et des inhibiteurs de protéases à la suspension cellulaire et agiter doucement pour homogénéiser. Incuber la suspension sur glace pendant 10 minutes.Transférez la suspension cellulaire dans un homogénéisateur refroidi. Lys ez les cellules avec 20 à 30 mouvements à l’aide du piston ajusté, jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de viscosité apparente, puis transférez l’homogénat dans des tubes de microcentrifugeuse froids. Après centrifugation des tubes, transférez le lysat clarifié dans un tube froid propre, en laissant environ 50 microlitres de lysat dans le tube d’origine.Conserver un aliquot de 35 microlitres de lysat pour mesurer la concentration en protéines et suivre la purification. Ensuite, éliminer le tampon des billes préparées précédemment. Resuspendre les billes dans un millilitre de lysat, puis mélanger avec le reste du lysat.Incuber le mélange sur une roue rotative à quatre degrés Celsius pendant une à deux heures. Rassembler les billes sur le côté du tube à l’aide d’un aimant. Prélever un aliquot de 30 microlitres de surnageant et jeter le reste.Resuspendre les billes dans 0,5 millilitre de tampon IPP150 en pipettant quatre à six fois. Ensuite, transférer la suspension dans un tube froid de 1,5 millilitre. Puis, laver les billes trois fois avec 0,5 millilitre de tampon natif d'élution FLAG.Avec le dernier lavage, transférez les billes dans un nouveau tube froid. Éliminez complètement le tampon. Remettez en suspension les billes dans 100 microlitres de peptide 3X5 à 200 microgrammes par millilitre dans du tampon d'élution natif.Incubez ensuite à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes avec une rotation douce. Recueillez les billes à l’aide de l’aimant et transférez le surnageant dans un nouveau tube froid. Répétez cette étape deux fois avant de recueillir tous les éluats.Concentrer l'éluate jusqu'à 25 microlitres dans une unité de filtration centrifuge par centrifugation à 10 000 ×g à quatre degrés Celsius. Préparer l'échantillon en ajoutant un tampon de charge natif 4X et un additif d'échantillon à 0,5 % G-250 à l'éluate concentré de 25 microlitres. Charger l'échantillon et les marqueurs de poids moléculaire natifs, en laissant un puits vide entre eux.Ensuite, chargez 10 à 20 microlitres de tampon de charge natif 1X dans tous les puits vides. Remplissez soigneusement la chambre cathodique avec 200 millilitres de tampon cathodique bleu foncé natif PAGE 1X, sans perturber les échantillons. Remplissez la chambre anodique avec 550 millilitres de tampon anodique natif PAGE 1X.Faire migrer le gel à 150 volts pendant 30 minutes. Après l'arrêt de la migration, retirer le tampon cathodique bleu foncé à l’aide d’une pipette sérologique et le remplacer par du tampon cathodique bleu clair 1X. Après avoir poursuivi la migration pendant 60 minutes, ouvrir la cassette du gel et éliminer l’une des plaques de la cassette.Le gel reste attaché à l'autre plaque de cassette. Placer le gel dans un récipient contenant suffisamment de solution de fixation pour le recouvrir et incuber pendant 30 minutes avec agitation douce. Ensuite, retirer la solution de fixation et la remplacer par de l'eau avant de numériser le gel.Pour préparer l'échantillon pour la spectrométrie de masse, placez d'abord une plaque de 96 puits à fond conique sur une autre plaque de 96 puits afin de recueillir les déchets. Percez le fond des puits de la plaque à fond conique à l'aide d'une aiguille de calibre 21. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de 50 % acétonitrile, 0,25 % acide formique dans les puits de la plaque perforée.Incuber la pile de plaques dans un agitateur pendant 10 minutes. Ensuite, centrifuger la plaque à 500 × g pendant une minute, afin que le liquide passe par les trous dans la plaque de collecte des déchets. Après avoir répété deux fois les étapes de lavage, remplir les puits de la plaque 96 puits perforée avec 150 microlitres de bicarbonate d'ammonium 50 millimolaire.Ensuite, placez le gel sur une surface propre. Découpez la bande contenant l'échantillon en 48 tranches identiques. Coupez chaque tranche en deux ou trois morceaux plus petits, sauf les cinq dernières tranches situées en haut du gel.Placer chaque tranche successivement dans un puits d'une plaque 96 puits dont l'extrémité perforée a été préalablement lavée. Ajouter 50 microlitres d'acétonitrile dans chaque puits et incuber la plaque sous agitation pendant 30 à 60 minutes. Après élimination du liquide par centrifugation, ajouter 200 microlitres de TSEB à deux millimètres et de bicarbonate d'ammonium à 50 millimolaire dans chaque puits.Incuber la plaque avec agitation pendant 30 minutes à température ambiante avant d'éliminer le liquide par centrifugation comme précédemment. Déshydrater les morceaux de gel en ajoutant 200 microlitres d'acétonitrile pur et incuber avec agitation à température ambiante pendant 20 minutes, jusqu'à ce que les morceaux de gel deviennent blancs et opaques. Après avoir éliminé l'acétonitrile, ajouter 150 microlitres de trypsine dans du bicarbonate d'ammonium froid dans chaque puits.Incuber la plaque avec agitation à 37 degr&eacute;s Celsius pendant deux heures. Ensuite, placer une plaque propre &agrave; fond conique sous la plaque contenant le gel, en veillant &agrave; l'orientation correcte des plaques. Puis, recueillir le liquide contenant les peptides par centrifugation &agrave; 200 fois G pendant une minute.Placer la plaque contenant les peptides dans un évaporateur centrifuge et évaporer le liquide tout en effectuant l'étape suivante. Ajouter 150 microlitres de 50 % acétonitrile, 0,25 % acide formique aux morceaux de gel. Incuber sous agitation à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.Recueillir le liquide dans la plaque partiellement sèche par centrifugation à 200 fois G pendant une minute. Continuer à faire évaporer la plaque contenant les peptides tout en effectuant l'étape suivante. Transférer les solutions de peptides vers la plaque de filtration centrifuge lavée.Placer une plaque propre à fond conique en dessous pour recueillir les peptides et centrifuger l'empilement de plaques comme précédemment. Évaporer le liquide dans la plaque à fond conique jusqu'à ce que les puits soient complètement secs. Une fois secs, la plaque peut être recouverte d'un couvercle en silicone et stockée à moins 20 degrés Celsius jusqu'à l'analyse par spectrométrie de masse et l'analyse des données, comme décrit dans le protocole textuel.Des résultats représentatifs issus du regroupement hiérarchique des profils de migration en électrophorèse native bleue des protéines Mta2 et des protéines copurifiées sont présentés ici sous forme de dendrogramme et de carte thermique représentant les intensités protéiques. Le profil de migration de Mta2 montre deux pics, indicatifs de deux complexes distincts. Certaines sous-unités du complexe NuRD présentent un profil similaire, avec une abondance maximale dans l'assemblage de poids moléculaire inférieur.En revanche, d'autres sous-unités de NuRD sont plus abondantes dans l'assemblage NuRD de poids moléculaire plus élevé. D'autre part, l'interacteur de Mta2, Cdk2ap1, n'est présent que dans l'assemblage NuRD de poids moléculaire plus élevé. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours et demi.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder tous les échantillons et réactifs sur de la glace afin d'éviter la dissociation des complexes protéiques. Cette procédure peut être appliquée à toute protéine d'intérêt, à condition qu'elle puisse être récupérée à partir du milieu d'affinité par élution compétitive dans des conditions natives. Après cette procédure, d'autres méthodes comme la co-immunoprécipitation inverse ou séquentielle peuvent être réalisées afin de valider les sous-complexes identifiés.

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