DNA甲基化分析
CpG二核苷酸上的甲基化是一种DNA化学修饰，被认为在调控基因表达中发挥重要作用。特别是位于启动子及其他基因调控元件附近的甲基化位点簇，即“CpG岛”的甲基化，可能参与基因的稳定沉默，例如在基因组印记和X染色体失活等表观遗传过程中。同时，异常的CpG甲基化已被证实与癌症相关。
在本视频中，将介绍DNA…
DNA甲基化是一种对DNA的化学修饰，可在不同细胞环境中影响基因表达。许多研究人员关注这一过程的机制和功能，因为异常的DNA甲基化已被证实与癌症等疾病相关。
在本视频中，我们将介绍DNA甲基化的基本原理以及检测该修饰的方法。随后，我们将探讨其中一种方法——亚硫酸氢盐分析的一般实验流程，并介绍该技术的一些应用。
首先，让我们了解一下什么是DNA甲基化以及如何检测它。
在这一生化过程中，细胞会向其DNA中的胞嘧啶碱基添加一种称为甲基的化学标记。大多数甲基化的胞嘧啶位于同一条DNA链上紧邻鸟嘌呤碱基的位置，这些相邻的核苷酸及其连接它们的磷酸二酯键被称为“CpG”。尽管大多数脊椎动物的CpG位点是甲基化的，但未甲基化的CpG倾向于聚集在活跃表达基因的启动子区域附近的CpG“岛”以及其他多种调控序列元件中。
DNA甲基化变化如何参与基因调控仍是当前深入研究的课题。CpG岛的甲基化似乎在表观遗传过程中发挥重要作用，例如基因组印记（即某些基因按亲本来源特异性表达）以及X染色体失活（雌性哺乳动物每个细胞中两条X染色体之一的沉默），这些过程均涉及稳定的长期基因沉默。由于CpG岛异常甲基化导致关键基因被抑制，已被证实可促进细胞不受控制地增殖，从而引发癌症。从机制上看，DNA甲基化可能通过阻止转录因子与启动子结合，或招募能够修饰组蛋白并将染色质重塑为转录非许可状态的蛋白质，从而参与基因沉默。
目前有多种方法可用于检测DNA的甲基化状态。
其中一种技术是HELP分析法，该方法使用两种限制性内切酶——HpaII 和 MspI，它们分别仅切割未甲基化的CCGG序列，或同时切割甲基化和未甲基化的CCGG序列。通过比较这两种酶产生的消化图谱，可以推断出DNA的甲基化状态。
另一种方法称为甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP），利用能特异性结合甲基化胞嘧啶的抗体来富集甲基化DNA片段。
最后，亚硫酸氢盐分析法通过化学反应将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，从而区分DNA中甲基化与未甲基化的胞嘧啶。经过该转化后，可对亚硫酸氢盐处理的DNA进行PCR扩增、测序，并与参考基因组进行比对。那些在参考序列中存在但在亚硫酸氢盐处理及PCR后被胸腺嘧啶取代的位点，即为未甲基化的胞嘧啶。此外，研究人员还可对亚硫酸氢盐处理后的DNA进行质谱分析，生成“甲基化表观图谱”（methylation epigrams），以线性方式展示基因组中不同CpG位点及其各自的甲基化程度。这类图谱在研究人员希望比较不同细胞类型之间甲基化模式时尤为有用。
现在让我们深入探讨亚硫酸氢盐分析的实验方案。
首先，向基因组DNA样品中加入氢氧化钠，并在95°C下孵育。这一步可使DNA变性，使其碱基暴露，便于后续的化学反应。然后将亚硫酸氢钠加入变性的DNA混合物中，此时将发生两个化学反应步骤。在第一步磺化反应中，亚硫酸盐基团被添加到未甲基化的胞嘧啶上，形成胞嘧啶磺酸盐。随后在水解脱氨反应中，胞嘧啶磺酸盐的氨基被去除，生成尿嘧啶磺酸盐。
为了促进这些初始化学反应阶段的进行，需在DNA样品上层覆盖矿物油，以防止蒸发并维持亚硫酸氢钠的浓度。反应混合物随后在55°C避光孵育。在此过程中，还需向混合物中加入抗氧化剂（如对苯二酚），以防止氧化。
为了收集含有尿嘧啶磺酸盐且不含矿物油的修饰后DNA，需对混合物进行离心，并回收最下层的液体。然后对该溶液中的DNA进行纯化。
接下来，向DNA混合物中加入氢氧化钠，并在37°C下孵育。此步骤旨在诱导脱磺酸反应——正如您所推测的，该反应可去除尿嘧啶磺酸盐中的亚硫酸盐基团，生成尿嘧啶，从而完成整个化学反应。
最后，通过加入乙酸铵中和混合物，并采用乙醇沉淀法回收DNA。待亚硫酸氢盐转化后的DNA纯化完成后，即可进行PCR扩增和测序。
在讨论了亚硫酸氢盐分析的基本技术之后，让我们来看一些实验应用。
一些研究人员利用亚硫酸氢盐分析来研究基因组印记现象。在此研究中，研究人员将两种具有遗传差异的拟南芥（Arabidopsis）品系进行杂交，以便区分母源和父源DNA。随后比较了所产生胚胎及其相关胚乳（即支持胚胎发育的组织）中的甲基化模式。通过该方法，科学家发现，在蛋白编码基因MEA的母源等位基因中，CpG位点在胚胎中倾向于被甲基化，而在胚乳中则未被甲基化，表明存在组织特异性的基因组印记。
其他研究人员正利用该技术探究环境或社会因素如何改变甲基化模式。在此项研究中，新生小鼠幼崽被与其母亲分离以诱导应激状态，随后分离其脑组织。在对经亚硫酸氢盐处理的DNA进行测序后，科学家发现，在“被分离”幼崽的特定脑区中，编码激素的基因AVP的甲基化模式发生了改变，提示早期生活经历可能通过这一分子机制产生长期生物学效应。
最后，许多研究人员正致力于优化亚硫酸氢盐分析方法，以促进对单个独特细胞之间甲基化模式的比较。在此项研究中，研究人员改进了亚硫酸氢盐分析流程，使所有步骤均在嵌入琼脂糖中的单个小鼠卵母细胞上完成，从而有助于防止DNA丢失。利用该方法，研究人员能够通过检测是否出现多种甲基化模式，轻松识别出被其他细胞污染的单卵母细胞样本。
您刚刚观看了 JoVE 关于甲基化敏感性分析的视频。在本视频中，我们讨论了 DNA 甲基化在基因调控中的作用、研究人员用于鉴定基因组中甲基化区域的方法、亚硫酸氢盐分析的通用实验方案，以及该技术的一些应用。一如既往，感谢您的观看！
DNA甲基化是一种对DNA的化学修饰，可在不同细胞环境中影响基因表达。许多研究人员关注这一过程的机制和功能，因为异常的DNA甲基化已被证实与癌症等疾病相关。
在本视频中，我们将介绍DNA甲基化的基本原理以及检测该修饰的方法。随后，我们将探讨其中一种方法——亚硫酸氢盐分析的一般实验流程，并介绍该技术的一些应用。
首先，让我们了解一下什么是DNA甲基化以及如何检测它。
在这一生化过程中，细胞会向其DNA中的胞嘧啶碱基添加一种称为甲基的化学标记。大多数甲基化的胞嘧啶位于同一条DNA链上紧邻鸟嘌呤碱基的位置，这些相邻的核苷酸及其连接它们的磷酸二酯键被称为“CpG”。尽管大多数脊椎动物的CpG位点是甲基化的，但未甲基化的CpG倾向于聚集在活跃表达基因的启动子区域附近的CpG“岛”以及其他多种调控序列元件中。
DNA甲基化变化如何参与基因调控仍是当前深入研究的课题。CpG岛的甲基化似乎在表观遗传过程中发挥重要作用，例如基因组印记（即某些基因按亲本来源特异性表达）以及X染色体失活（雌性哺乳动物每个细胞中两条X染色体之一的沉默），这些过程均涉及稳定的长期基因沉默。由于CpG岛异常甲基化导致关键基因被抑制，已被证实可促进细胞不受控制地增殖，从而引发癌症。从机制上看，DNA甲基化可能通过阻止转录因子与启动子结合，或招募能够修饰组蛋白并将染色质重塑为转录非许可状态的蛋白质，从而参与基因沉默。
目前有多种方法可用于检测DNA的甲基化状态。
其中一种技术是HELP分析法，该方法使用两种限制性内切酶——HpaII 和 MspI，它们分别仅切割未甲基化的CCGG序列，或同时切割甲基化和未甲基化的CCGG序列。通过比较这两种酶产生的消化图谱，可以推断出DNA的甲基化状态。
另一种方法称为甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP），利用能特异性结合甲基化胞嘧啶的抗体来富集甲基化DNA片段。
最后，亚硫酸氢盐分析法通过化学反应将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，从而区分DNA中甲基化与未甲基化的胞嘧啶。经过该转化后，可对亚硫酸氢盐处理的DNA进行PCR扩增、测序，并与参考基因组进行比对。那些在参考序列中存在但在亚硫酸氢盐处理及PCR后被胸腺嘧啶取代的位点，即为未甲基化的胞嘧啶。此外，研究人员还可对亚硫酸氢盐处理后的DNA进行质谱分析，生成“甲基化表观图谱”（methylation epigrams），以线性方式展示基因组中不同CpG位点及其各自的甲基化程度。这类图谱在研究人员希望比较不同细胞类型之间甲基化模式时尤为有用。
现在让我们深入探讨亚硫酸氢盐分析的实验方案。
首先，向基因组DNA样品中加入氢氧化钠，并在95°C下孵育。这一步可使DNA变性，使其碱基暴露，便于后续的化学反应。然后将亚硫酸氢钠加入变性的DNA混合物中，此时将发生两个化学反应步骤。在第一步磺化反应中，亚硫酸盐基团被添加到未甲基化的胞嘧啶上，形成胞嘧啶磺酸盐。随后在水解脱氨反应中，胞嘧啶磺酸盐的氨基被去除，生成尿嘧啶磺酸盐。
为了促进这些初始化学反应阶段的进行，需在DNA样品上层覆盖矿物油，以防止蒸发并维持亚硫酸氢钠的浓度。反应混合物随后在55°C避光孵育。在此过程中，还需向混合物中加入抗氧化剂（如对苯二酚），以防止氧化。
为了收集含有尿嘧啶磺酸盐且不含矿物油的修饰后DNA，需对混合物进行离心，并回收最下层的液体。然后对该溶液中的DNA进行纯化。
接下来，向DNA混合物中加入氢氧化钠，并在37°C下孵育。此步骤旨在诱导脱磺酸反应——正如您所推测的，该反应可去除尿嘧啶磺酸盐中的亚硫酸盐基团，生成尿嘧啶，从而完成整个化学反应。
最后，通过加入乙酸铵中和混合物，并采用乙醇沉淀法回收DNA。待亚硫酸氢盐转化后的DNA纯化完成后，即可进行PCR扩增和测序。
在讨论了亚硫酸氢盐分析的基本技术之后，让我们来看一些实验应用。
一些研究人员利用亚硫酸氢盐分析来研究基因组印记现象。在此研究中，研究人员将两种具有遗传差异的拟南芥（Arabidopsis）品系进行杂交，以便区分母源和父源DNA。随后比较了所产生胚胎及其相关胚乳（即支持胚胎发育的组织）中的甲基化模式。通过该方法，科学家发现，在蛋白编码基因MEA的母源等位基因中，CpG位点在胚胎中倾向于被甲基化，而在胚乳中则未被甲基化，表明存在组织特异性的基因组印记。
其他研究人员正利用该技术探究环境或社会因素如何改变甲基化模式。在此项研究中，新生小鼠幼崽被与其母亲分离以诱导应激状态，随后分离其脑组织。在对经亚硫酸氢盐处理的DNA进行测序后，科学家发现，在“被分离”幼崽的特定脑区中，编码激素的基因AVP的甲基化模式发生了改变，提示早期生活经历可能通过这一分子机制产生长期生物学效应。
最后，许多研究人员正致力于优化亚硫酸氢盐分析方法，以促进对单个独特细胞之间甲基化模式的比较。在此项研究中，研究人员改进了亚硫酸氢盐分析流程，使所有步骤均在嵌入琼脂糖中的单个小鼠卵母细胞上完成，从而有助于防止DNA丢失。利用该方法，研究人员能够通过检测是否出现多种甲基化模式，轻松识别出被其他细胞污染的单卵母细胞样本。
您刚刚观看了 JoVE 关于甲基化敏感性分析的视频。在本视频中，我们讨论了 DNA 甲基化在基因调控中的作用、研究人员用于鉴定基因组中甲基化区域的方法、亚硫酸氢盐分析的通用实验方案，以及该技术的一些应用。一如既往，感谢您的观看！
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is DNA methylation and where does it occur in the genome?
DNA methylation is a chemical modification where cells add a methyl group to cytosine bases in DNA. Most methylated cytosines occur next to guanine bases, forming CpG dinucleotides. Although most vertebrate CpGs are methylated, unmethylated CpGs tend to cluster together in CpG islands near gene promoters and regulatory elements, where they remain accessible for gene expression.
Q2: How does DNA methylation contribute to gene silencing?
DNA methylation silences genes through two mechanisms: it can prevent transcription factors from binding to promoters, or it can recruit proteins that modify histones and remodel chromatin into a transcriptionally non-permissive state. This stable silencing is particularly important in epigenetic processes such as genomic imprinting and X-chromosome inactivation, where genes are silenced based on their parent of origin or chromosome copy.
Q3: What are the main methods for detecting DNA methylation?
Three primary detection methods exist: the HELP assay uses restriction enzymes HpaII and MspI to compare digestion patterns of methylated versus unmethylated DNA; MeDIP uses antibodies to enrich methylated DNA sequences; and bisulfite analysis chemically converts unmethylated cytosines to uracil, allowing methylation status to be determined through PCR and sequencing.
Q4: What happens to DNA during the bisulfite analysis chemical reaction?
Bisulfite analysis involves two key chemical steps: sulfonation adds a sulfite group to unmethylated cytosines, forming cytosine sulfonate; then hydrolytic deamination removes an amino group to generate uracil sulfonate. Desulfonation subsequently removes the sulfite group, converting uracil sulfonate to uracil. This process leaves methylated cytosines unchanged, enabling distinction between methylated and unmethylated bases.
Q5: How is bisulfite-converted DNA analyzed after chemical treatment?
After bisulfite conversion and purification, the modified DNA is subjected to PCR and sequencing. Unmethylated cytosines appear as thymines in the sequenced product, while methylated cytosines remain as cytosines. Researchers can also use mass spectrometry to create methylation epigrams, which linearly represent different CpGs and depict the degree of methylation at each site, facilitating comparison between cell types.
Q6: How have researchers used bisulfite analysis to study genomic imprinting?
Researchers crossed Arabidopsis strains with genetic differences to distinguish maternal and paternal DNA, then compared methylation patterns in embryos and endosperm tissue. They found that CpGs in the maternal allele of the MEA gene were methylated in embryos but unmethylated in endosperm, demonstrating tissue-specific imprinting patterns that bisulfite analysis can reveal.
Q7: What role does aberrant DNA methylation play in cancer development?
Aberrant methylation of CpG islands can silence critical genes, leading to uncontrolled cell growth and cancer. Unlike normal epigenetic silencing, this abnormal methylation disrupts the balance of gene expression necessary for proper cell function. Understanding these methylation patterns through techniques like bisulfite analysis helps researchers identify molecular mechanisms underlying cancer and develop potential therapeutic strategies.