3: DNA 甲基化分析

DNA 甲基化是 DNA 的一种化学修饰，会影响不同细胞环境下的基因表达。许多研究人员对这个过程的机制和功能感兴趣，因为异常的 DNA 甲基化与癌症等疾病有关。

在本视频中，我们将介绍 DNA 甲基化背后的原理和检测方法。然后，我们将探索其中一种方法、亚硫酸氢盐分析的一般方案以及该技术的一些应用。

首先，让我们看一下什么是 DNA 甲基化以及如何检测它。

在这个生化过程中，细胞在其 DNA 中的胞嘧啶碱基上添加了一个称为甲基的化学标签。大多数甲基化胞嘧啶存在于同一 DNA 链中的鸟嘌呤碱基旁边，这些相邻的核苷酸和连接它们的磷酸二酯键被称为 CpGs。尽管大多数脊椎动物 CpG 是甲基化的，但那些未甲基化的 CpG 往往在 CpG 岛中紧密相连出现。靠近活性表达基因的启动子和各种其他调节序列元件。

DNA 甲基化的变化如何促进基因调控仍然是一个深入研究的主题。CpG 岛的甲基化似乎对于表观遗传过程中的稳定、长期基因沉默很重要，例如基因组印记，这是某些基因的亲本特异性表达，以及 X 染色体失活，即雌性哺乳动物每个细胞中两条 X 染色体中的一条沉默。由于 CpG 岛的异常甲基化而导致的关键基因抑制也被证明会导致细胞生长不受控制，从而导致癌症。从机制上讲，DNA 甲基化可能通过阻止转录因子与启动子结合，或通过募集修饰组蛋白并将染色质重塑为转录非允许状态的蛋白质来促进基因沉默。

有几种方法可以检测 DNA 的甲基化状态。

一种技术，HELP 检测，涉及两种称为 HpaII 和 MspI 的限制性核酸内切酶，它们分别仅切割未甲基化或甲基化和未甲基化的 CCGG 序列。通过比较这两种酶产生的消化模式，可以推断 DNA 的甲基化状态。

另一种方法称为甲基化 DNA 免疫沉淀或 ？MeDIP，？使用与甲基化胞嘧啶结合的抗体来富集甲基化 DNA 序列。

最后，亚硫酸氢盐分析用于区分 DNA 中的甲基化胞嘧啶和未甲基化胞嘧啶，方法是进行将未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的化学反应。转换后，可以进行 PCR、测序并与参考基因组进行比较。未甲基化的胞嘧啶是存在于参考文献中，但在亚硫酸氢盐分析和 PCR 后被胸腺嘧啶取代的那些。通过对亚硫酸氢盐处理的 DNA 进行质谱分析，研究人员还可以创建甲基化警句，？它们线性表示基因组中的不同 CpG，并描述每个 CpG 的甲基化程度。如果研究人员希望比较不同细胞类型之间的甲基化模式，这种警句特别有用。

现在让我们深入了解一下亚硫酸氢盐分析的方案。

首先，将氢氧化钠添加到基因组 DNA 的制备物中，然后在 95°C 下孵育。这会使 DNA 变性，使其碱基可用于后续的化学反应。然后将焦亚硫酸钠引入变性 DNA 混合物中，将发生两个化学反应步骤。在第一步磺化过程中，将亚硫酸盐基团添加到未甲基化的胞嘧啶中以形成胞嘧啶磺酸盐。然后，在水力脱氨过程中，从胞嘧啶磺酸盐中去除一个氨基以生成尿嘧啶磺酸盐。

为了促进化学反应的第一阶段，DNA 制备物上覆盖有矿物油，这可以防止蒸发并有助于维持焦亚硫酸钠的浓度。然后将反应在 55？C 在黑暗中。在此步骤中，还将防止氧化的试剂（例如喹醇）添加到混合物中。

为了收集含有尿嘧啶磺酸盐且不含矿物油的修饰 DNA，将混合物离心并回收最低的液体层。然后纯化该溶液中的 DNA。

接下来，将氢氧化钠添加到 DNA 混合物中，然后在 37°C 下孵育。这样做是为了诱导脱磺化，正如您可能已经猜到的那样，它从尿嘧啶磺酸盐中去除亚硫酸盐基团，形成尿嘧啶并完成化学反应。

最后，加入乙酸铵中和混合物，并通过乙醇沉淀收集 DNA。一旦亚硫酸氢盐转化的 DNA 被纯化，它就会进行 PCR 和测序。

现在我们已经讨论了亚硫酸氢盐分析的基本技术，让我们看看一些实验应用。

一些研究人员使用亚硫酸氢盐分析来研究基因组印迹。在这里，研究人员将两种具有遗传差异的拟南芥菌株杂交，以便区分母系和父系 DNA。然后比较所得胚胎和相关胚乳或支撑胚胎的组织中的甲基化模式。使用这种方法，科学家们发现蛋白质编码基因 MEA 的母系等位基因中的 CpG 在胚胎中往往被甲基化，但在胚乳中未被甲基化，这表明组织特异性印记。

其他研究人员正在使用这种技术来了解环境或社会因素如何改变甲基化模式。在这里，小鼠幼崽与它们的母亲分开以诱导压力，随后它们的脑组织被隔离。在对亚硫酸氢盐处理的 DNA 进行测序后，科学家们确定激素编码基因 AVP 的甲基化模式在分离的特定大脑区域中发生了变化。幼崽，表明早期生活经历长期生物学效应的可能分子机制。

最后，许多研究人员正在尝试优化亚硫酸氢盐分析，以促进单个独特细胞之间的甲基化模式的比较。在这里，研究人员修改了亚硫酸氢盐分析方法，以便所有步骤都对嵌入琼脂糖中的单个小鼠卵母细胞进行，这有助于防止 DNA 丢失。使用这种方法，研究人员能够通过寻找具有多种甲基化模式的样本来轻松识别被其他细胞污染的单卵母细胞样本。

您刚刚观看了 JoVE 关于甲基化敏感分析的视频。在这里，我们讨论了 DNA 甲基化在基因调控中的作用、研究人员用于识别基因组中甲基化区域的方法、亚硫酸氢盐分析的通用方案，最后是该技术的一些应用。一如既往，感谢您的观看！