原子力显微镜研究核苷酸切除修复中的DNA损伤识别

本原子力显微镜实验的总体目标是解析DNA修复蛋白与DNA损伤位点之间的相互作用，并区分不同蛋白质复合物与DNA的相互作用方式。该方法有助于回答DNA修复领域中的关键科学问题，例如特定的DNA修复系统如何实现对DNA中靶标损伤位点的识别。该技术的主要优势在于，我们能够直接观察并分析参与DNA损伤识别过程的各种复合物类型。

演示该实验步骤的是Nicolas Wirth，他在本科研究期间应用了这一方法。首先，通过在质粒中产生单链DNA缺口来制备合适的DNA底物；接着，用修饰过的单链DNA寡核苷酸填补缺口；最后，使用适当的限制性内切酶将质粒DNA线性化。

在这些实验中，双链DNA底物长度约为1,000个碱基对，包含一个DNA损伤位点以及一个用于蛋白质加载的未配对区域，称为DNA泡。接下来，通过先用移液器将10x反应缓冲液和水加入微型反应管中，制备用于原子力显微镜（AFM）分析的蛋白质-DNA样品，然后加入待研究的DNA和蛋白质。

例如，此处加入100纳摩尔的DNA样本以及各1微摩尔的真核生物核苷酸切除修复蛋白XPD和p44。然后将反应体系置于37摄氏度的加热块中孵育30分钟。孵育结束后，短暂离心收集样品。

接下来，准备一个云母基底用于放置样品。使用手术刀从较大的云母条上切割出一块一厘米乘一厘米的云母片。然后，使用一段粘性胶带剥离云母的顶层，以暴露出一个干净、平坦且具有解剖学光滑表面的基底。

用原子力显微镜沉积缓冲液将蛋白质-DNA样品稀释50至100倍，并立即取20微升稀释后的样品滴加到云母表面。稀释倍数取决于样品浓度。样品滴加到云母表面后，立即用几毫升过滤的去离子水冲洗3到4次，并吸去多余液体。

使用温和的氮气流吹干样品。最后，用胶带将样品边缘固定在显微镜载玻片上。将样品置于原子力显微镜（AFM）载物台中央，并使用磁性垫片将显微镜载玻片固定在载物台上。

然后，将原子力显微镜（AFM）探针插入探针 holder 中。在夹具下拧紧螺丝，用手拧紧即可，将探针固定在 holder 内。固定后，将探针 holder 插入 AFM 测量头中。

使用定位螺丝将样品移至中心位置。将原子力显微镜（AFM）测量头放置在样品上方，确保测量头的支脚稳定地置于载物台的凹槽内。接着，调整AFM激光束，使其对准悬臂背面，以获得最佳信号强度。

在AFM视频窗口中观察反射信号，粗略调整激光位置。对于此款AFM型号，转动AFM测量头右侧和后侧的旋钮，调节AFM激光的X和Y方向位置，使其对准悬臂末端中心。随后，通过两个旋钮微调激光位置，以优化探测器的总和信号。

通过调节探测器阵列上下两个二极管信号的差值为零，将原子力显微镜（AFM）激光反射引导至探测器中心。对于该型号的AFM，执行此步骤时需旋转测量头左侧的螺丝。接下来，在软件中进入主控面板的调谐窗口，以确定悬臂的共振频率。

选择与驱动悬臂振荡的压电元件（Piezo）输入电压为一伏相对应的振幅，然后将振荡频率设置为比共振频率低约5%。接着执行自动频率调谐，并将振荡相位归零。在开始成像前，让系统静置约一小时以达到热平衡，从而避免漂移。

当准备开始成像时，在软件主面板中设置一个保护性的设定点，并通过选择“engage”来准备将探针接近样品表面。手动降低AFM探头的前轮，直至达到保护设定点。然后，小心地进一步降低前轮，直到Z传感器信号完全向左伸展。

启动振动振荡台并关闭声学隔离罩。接着，在原子力显微镜（AFM）软件中使用滚轮调节，逐步降低设定值，使AFM针尖与样品实现精细接触。为在排斥状态下进行轻敲模式成像，需继续降低设定值，直至相位信号略低于自由状态下的相位水平。

然后，开始扫描样品。在扫描面积为 4 微米 × 4 微米或 8 微米 × 8 微米的区域时，分别采用 2,048 或 4,096 的像素分辨率，并以每秒 2.5 微米的扫描速度进行扫描；随后点击“Do Scan”按钮。通过 AFM 软件直接目视检查图像，预先筛选出相关的蛋白质-DNA 复合物。

对于XPD样品，可能存在的复合物包括XPD-p44-DNA，以及由于XPD与p44分子质量不同而导致尺寸明显不同的XPD-DNA和p44-DNA。通过分析窗口中的截面工具，使用截面窗口光标测量DNA上各个蛋白质峰截面的高度和直径，以测定其体积。利用这些数值，结合简单的数学模型计算峰体积，从而验证复合物的类型。

最后，使用一系列已知分子量的蛋白质对原子力显微镜（AFM）系统进行校准，以将这些体积转换为蛋白质及蛋白质复合物的近似分子量。若需确定其他特征，例如DNA片段长度、蛋白质复合物在DNA上的位置及其靶位点特异性或DNA条带角度，请参阅配套的文字版实验方案。图中显示的是一张原子力显微镜图像，包含三种不同类型的DNA结合复合物，可根据其不同大小加以区分。

一类复合物仅包含解旋酶激活辅助因子p44，二类复合物仅包含XPD蛋白，三类复合物则同时包含XPD和p44，因为XPD对损伤位点的识别需要p44激活其解旋酶活性，且只有三类复合物表现出损伤识别能力。为了鉴定不同的损伤识别机制，测量了原核和真核NER解旋酶在DNA损伤位点（以红色标示）两侧的DNA泡状区域中，蛋白质沿5′或3′方向加载至DNA底物上的位置。在蛋白质定位分布图中，DNA损伤识别表现为在损伤位点处因结合增强而形成的峰。

原核生物NER解旋酶UVRB及其真核生物对应物XPD在识别环丁烷嘧啶二聚体（CPD）损伤时表现出不同的策略，提示其对DNA链具有不同的偏好性。具体而言，UVRB在被易位的链上识别CPD损伤，而XPD则优先在相反的、非易位的链上识别该损伤。一旦掌握，包括分析在内，该方法可在数小时至数天内完成。

为了能够准确解读原子力显微镜（AFM）图像中的特征，并根据所研究的生物体系及科学问题精心设计DNA底物，使用高纯度的蛋白质和DNA样品至关重要。此外，整体性方法（如凝胶电泳、电泳迁移率变动或DNA切口实验）当然与这些AFM实验高度互补；这些方法有助于回答其他问题，例如DNA结合亲和力或DNA损伤切除活性。该技术是一种相对快速且简便的方法，可直接观察蛋白质-DNA复合物，这些复合物为我们提供了生物体系中发生过程的清晰图景。

当然，这种方法不仅有助于理解DNA修复过程，还可应用于其他蛋白质-DNA体系。观看本视频后，您将能够较好地掌握如何制备您感兴趣的蛋白质-DNA体系样品，如何利用原子力显微镜（AFM）对其进行成像，以及如何提取有用参数以解释您的实验数据。