质谱法和基于发光的-途径表征阶段我代谢能力的体外细胞培养

该程序的目的是确定培养细胞中细胞色素 P450 或 CYP 的活性。CYPs 是参与药物和毒物代谢的关键酶，它们的表达通常不会在体外保留。当细胞在体外培养时，CYP 酶的正常表达通常会丢失。

因此，许多体外模型可能会限制与理解药物和毒物代谢的相关性。该方法的主要优点是在评估培养细胞中的 CYP 活性时简单。使用探针底物和抑制剂，提出了不同的定量平台，包括质谱。

首先，按照文本方案中的说明获取带有细胞的低温小瓶。提供的方案使用肝细胞系作为示例。在无菌条件下工作时，小心打开冻存管以释放任何多余的压力，然后将冻存管中的内容物移液到一个 10 毫升的试管中，该试管中装有 9 毫升预热的 37 摄氏度 Williams'E 培养基。

在室温下以 400 x g 离心溶液 10 分钟。弃去上清液后，将细胞重悬于 5 mL 专有解冻培养基中，预热至 37 摄氏度并补充谷氨酰胺。按照文本方案中的说明对活细胞进行计数后，将细胞以每孔 60， 000 个活细胞的密度和最终体积为 0.5 毫升解冻培养基的密度接种在 24 孔胶原包被板中。

培养几天后，细胞形成亚汇合的小梁结构。最佳代谢活动通常在第 7 天到第 10 天之间观察到，并且在第 4 天最低。为了制备分化的气道上皮培养物，使用市售的完全分化原代气道上皮，这些原代气道上皮已在插入物上的气液界面生长。

使用无菌镊子轻轻地从琼脂糖基质中去除细胞插入物，并将其转移到预装有 700 μL 专有培养基的新板中。使用文本方案中引用的方法评估气道组织的完整性，例如跨上皮阻力或纤毛搏动频率。在实验之前，为气道细胞准备两个系列的细胞插入物，为肝细胞准备至少三个重复的孔。

将一个系列用于抑制实验，另一个系列仅用于代谢探针。准备第三个系列的细胞作为培养基空白对照。在实验当天，用 450 μL 新鲜培养基替换细胞培养基。

将 50 μL 含有 10x CYP 抑制剂的培养基添加到为抑制实验准备的一系列细胞中，并预孵育 30 分钟。接下来，用 450 μL 新鲜培养基替换抑制系列中的培养基，并加入 50 μL 含有 10x CYP 抑制剂和 10x 探针底物的培养基。向其他细胞中加入 50 μL 培养基和 10x 探针底物，然后将等量的培养基稀释的载体添加到空白细胞对照中。

细胞孵育 0 到 5 分钟后，将时间点 1,0 背景对照，将培养基收集在单独的标记管中，并冷冻培养基以备将来处理。然后将两个时间点的细胞在细胞培养箱中孵育 16 小时。在孵育期结束时，使用相同的方法收集培养基以定量代谢产物。

将 250 μL 孵育培养基转移到 1.5 mL 微管中，并加入 4-甲基伞形酮内标储备液，以达到 100 纳摩尔的最终浓度。通过添加 1 摩尔 HCl，一次 1 微升，将培养基的 pH 值调节到 4.5 到 5.0 之间。通过将 2 至 10 微升培养基移液到 pH 试纸上来验证 pH 值，然后加入 150 单位来自 Helix pamatia 的 β-葡糖醛酸酶芳基硫酸酯酶。

在 37 摄氏度下孵育 1 小时后，加入 250 μL 冷甲醇终止反应。使用 45 摄氏度的真空离心机蒸发溶剂。用 500 μL 30% 乙腈-水溶液复溶样品。

要进行基于质谱的定量，将 250 μL 的每种连续稀释标准品添加到琥珀色超高效液相色谱玻璃样品瓶中，以便在 UPLC-MS 自动进样器中进样。此外，将测试样品添加到琥珀色 UPLC 样品瓶中，并将其放入 UPLC 自动进样器中。随机化所有样品瓶后，根据要定量的特定探针，使用文本方案中详述的设置运行 UPLC-MS。

使用质谱仪定量工具中的定量、构建定量方法工具，从采集的合成标准品和内标生成校准曲线，然后使用定量向导选择要定量的样品批次和样品，并执行定量方法。要诱导 CYP1A1、CYP1B1，请使用文本协议中的板布局。将指定用于诱导的细胞与终浓度为 10 纳摩尔的 TCDD 在培养基中孵育 72 小时。

在此期间后，去除培养基，用 PBS 冲洗孔 3 次，并加入一些新鲜培养基。在使用发光报告基因探针孵育细胞之前，将指定的诱导细胞亚群与培养基中的 CYP1A1、CYP1B1 抑制剂预孵育 30 分钟。将终浓度为 50 微摩尔的致发光 propbe、荧光素 6'氯乙醚添加到非诱导、诱导和诱导的 plus 抑制剂细胞中。

孵育 4 小时，然后将 25 μL 培养基转移至白色不透明 96 孔板中，并加入制造商提供的 25 μL 荧光素检测试剂。在室温下孵育 20 分钟后，立即使用光度计读取板。这里介绍了由 CYP1A1、CYP1B1 催化的荧光素 6'氯乙醚脱烷基化产生的相对发光。

该实例显示在没有 TCDD 诱导的情况下没有酶活性。TCDD 诱导后，在肝细胞和呼吸细胞类型中观察到 CYP1A1、CYP1B1 活性。最后，添加 CYP1A1、CYP1B1 抑制剂 α-萘黄酮可降低或消除 CYP 活性。

为了评估肝和气道细胞类型中的 CYP2A6、2A13 活性，使用 UPLC LC-MS 测量酶通过香豆素羟基化产生的 7-羟基香豆素的量。与香豆素孵育 0 分钟时，仅检测到背景。16 小时后，观察到香豆素的羟基化，在两种细胞类型中形成 7-羟基香豆素。

最后，添加 CYP2A、2A13 抑制剂可防止 7-羟基香豆素的形成。一旦掌握，在大多数情况下，该技术的探针孵育和定量部分可以在几个小时到一天内完成。观看本视频后，您应该对如何使用不同细胞类型进行各种 1 期代谢测定有很好的了解，并根据需要使用抑制和/或诱导来确认酶的特异性。

在尝试此过程时，请务必记住，不同的细胞类型可能需要更长的孵育时间，并且必须包括可用作阳性对照的细胞类型。不要忘记，使用 TCDD 可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如全套个人防护设备。该技术的含义延伸到使用合适的体外模型进行新药的临床前评估以及消费品中使用的化学品和成分的风险评估。