基于质谱与发光检测的方法表征I相代谢能力 体外 细胞培养

本实验的目的是测定培养细胞中细胞色素P450（cytochrome P450s，简称CYPs）的活性。CYPs是参与药物和毒物代谢的关键酶类，其表达在体外培养条件下通常难以维持。当细胞在体外培养时，CYP酶的正常表达往往丧失。

因此，许多体外模型在理解药物和毒物代谢方面的相关性可能存在局限性。该方法的主要优势在于评估培养细胞中CYP活性时操作简便。通过使用探针底物和抑制剂，介绍了包括质谱法在内的不同定量平台。

首先，按照文本方案获取装有细胞的冻存管。本方案以肝细胞系为例。在无菌条件下操作，小心打开冻存管以释放可能存在的多余压力，然后将冻存管中的内容物转移至含有9毫升预热至37摄氏度的Williams'E培养基的10毫升离心管中。

在室温下以400 × g离心溶液10分钟。弃去上清液后，将细胞重悬于5 mL预热至37°C并添加了谷氨酰胺的专用解冻培养基中。按照文本方案中所述计数活细胞，随后将细胞以每孔60,000个活细胞的密度接种至24孔胶原蛋白包被的培养板中，每孔终体积为0.5 mL解冻培养基。

培养数天后，细胞会形成亚融合的骨小梁样结构。通常在第7至10天观察到最佳的代谢活性，而在第4天时最低。为制备已分化的气道上皮培养物，应使用商品化的、已在插入式培养小室的气-液界面处完全分化的原代气道上皮细胞。

使用无菌镊子轻轻将细胞小室从琼脂糖基质中取出，并转移至预先加入 700 微升专用培养基的新培养板中。采用文本方案中引用的方法（如跨上皮电阻或纤毛搏动频率）评估气道组织的完整性。实验前，为气道细胞准备两组细胞小室，为肝细胞准备相应孔板，每组至少设置三个重复。

将一组用于抑制实验，另一组仅用于代谢探针。另准备一组细胞作为培养基空白对照。实验当天，将细胞培养基更换为450 µL新鲜培养基。

向已准备好的用于抑制实验的细胞系列中加入 50 微升含有 10 倍浓度 CYP 抑制剂的培养基，并预孵育 30 分钟。接着，将抑制组细胞中的培养基更换为 450 微升新鲜培养基，并加入 50 微升含有 10 倍浓度 CYP 抑制剂和 10 倍浓度探针底物的培养基。向其他细胞中加入 50 微升含有 10 倍浓度探针底物的培养基，然后向空白对照细胞中加入等量的、用培养基稀释的溶剂。

对于第一个时间点（0至5分钟）以及零背景对照，孵育细胞后，将培养基收集到分别标记的离心管中，并将培养基冷冻以备后续处理。随后，将第二个时间点的细胞在细胞培养箱中继续孵育16小时。孵育结束后，采用相同方法收集培养基，用于代谢产物的定量分析。

取250微升孵育液转移至1.5毫升微量离心管中，加入4-甲基伞形酮内标储备液，使其终浓度为100纳摩尔。逐滴加入1摩尔盐酸（每次1微升），将孵育液pH值调节至4.5至5.0之间。取2至10微升孵育液滴加到pH试纸上检测pH值，确认后加入150单位来自Helix pomatia的β-葡萄糖醛酸酶-芳基硫酸酯酶。

在37摄氏度孵育一小时后，加入250微升冷甲醇以终止反应。在45摄氏度下使用真空离心浓缩仪蒸发溶剂。用500微升30%乙腈-水溶液重新溶解样品。

为了进行基于质谱的定量分析，将每种系列稀释标准品各250微升加入棕色超高效液相色谱玻璃小瓶中，用于UPLC-MS自动进样器进样。同时将待测样品加入棕色UPLC小瓶中，并置于UPLC自动进样器中。在对所有小瓶进行随机化处理后，根据文本方案中详述的参数设置运行UPLC-MS，具体参数取决于待定量的目标探针。

使用质谱仪定量工具中的“定量、建立定量方法”工具，根据获得的合成标准品和内标品生成校准曲线，然后使用定量向导选择待定量的样品批次和样品，并执行定量方法。为诱导CYP1A1和CYP1B1，采用文本方案中所述的板式布局。将指定用于诱导的细胞在培养基中与10纳米浓度的TCDD共同孵育72小时。

在此孵育期结束后，移除培养基，用 PBS 洗涤孔板三次，并加入新鲜培养基。在将细胞与发光报告探针孵育之前，先将指定的诱导细胞亚群在培养基中与 CYP1A1、CYP1B1 抑制剂预孵育 30 分钟。随后，向未诱导、诱导以及诱导加抑制剂的细胞中加入发光探针 luciferin 6'chloroethyl ether，终浓度为 50 微摩尔（50 µM）。

孵育4小时后，取25微升培养基转移至白色不透明的96孔板中，并加入生产商提供的25微升荧光素检测试剂。室温孵育20分钟后，立即使用发光仪读取数据。此处展示的是由CYP1A1和CYP1B1催化的荧光素6'氯乙基醚去烷基化反应所产生的相对发光量。

该示例显示，在无TCDD诱导的情况下，无酶活性。经TCDD诱导后，肝细胞和呼吸系统细胞类型中均观察到CYP1A1、CYP1B1活性。最后，加入CYP1A1、CYP1B1抑制剂α-萘黄酮可降低或消除CYP活性。

为了评估CYP2A6和2A13在肝细胞和气道细胞类型中的活性，采用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC LC-MS）检测酶催化香豆素羟基化生成的7-羟基香豆素的含量。在与香豆素孵育0分钟时，仅检测到背景信号。孵育16小时后，在两种细胞类型中均观察到香豆素的羟基化反应，并生成7-羟基香豆素。

最后，加入CYP2A、2A13抑制剂可阻止7-羟基香豆素的生成。一旦掌握，该技术中的探针孵育和定量部分通常可在数小时至一天内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用不同细胞类型开展多种Ⅰ相代谢酶活性检测，并根据需要通过抑制或诱导实验验证酶的特异性。

在进行该实验操作时，需要注意不同细胞类型可能需要更长的孵育时间，因此必须包含一种可作为阳性对照的细胞类型。切勿忘记，TCDD具有极高的危险性，在操作过程中应始终采取充分的预防措施，例如穿戴完整的个人防护装备。该技术的应用意义在于为新型药物的临床前评估，以及消费品中所用化学品和成分的风险评估，提供合适的体外模型。