斑马鱼脊髓感觉和运动神经元电生理记录的 in situ 脊髓制备
2017年4月18日
本文描述了对斑马鱼胚胎和幼鱼脊髓神经元进行电生理记录的方法。该制备方法可维持神经元 原位 并且通常涉及最少的解剖操作。这些方法可用于对多种脊髓神经元进行电生理学研究，从早期幼体阶段开始即可记录其初始的电兴奋性。
本实验的总体目标是实现对斑马鱼胚胎期和幼体期脊髓神经元的原位电生理学研究。电生理学分析方法可与斑马鱼模型中已有的强大遗传学和成像技术相互补充。尽管该方法最初是为研究 Rohon-Beard 神经元而开发的，但我们已逐步对其进行了改进，目前可应用于研究多种类型的脊髓神经元。
演示该实验操作的是研究助理Rosa Moreno博士，我有幸与她合作多年。开始此操作时，先从一个玻璃管中取出黑色胶头，并用另一个玻璃管上的白色橡胶接头替换。接下来，截取一段长约38厘米的软管。
然后，通过一个小型直型聚丙烯接头连接柔性管路。制备硅胶弹性体时，将基础剂和固化剂按四比一的比例加入塑料锥形管中。随后，充分混合硅胶弹性体的基础剂与固化剂。
将混合物倒入两个100毫米的培养皿中，其中一个培养皿中的深度约为1毫米，另一个约为2.5毫米。让硅胶弹性体在空气中固化4至5天。若需更快获得固化后的弹性体，可在60摄氏度下孵育。
随后，从厚度为1毫米的固化弹性体上裁剪出一块3.8厘米×6.3厘米的矩形，作为腔室的底部。从厚度为2.5毫米的固化硅胶上裁剪出一块3.8厘米×6.3厘米的矩形，再从此矩形中切出一个2.5厘米×5厘米的内部矩形，以制成腔室顶部的框架。
制作解剖记录培养皿时，将薄硅胶矩形片直接放置在载玻片上方，确保除去硅胶与玻璃之间的任何气泡。然后将硅胶矩形框放置在底层薄硅胶片的上方。在此步骤中，将胚胎放入含有两到三毫升任氏液的解剖培养皿中。
向孵育腔中加入 100 微升 0.4% 的三卡因溶液以固定胚胎。然后使用微玻璃管拉制仪从薄壁玻璃管上拉制出具有细长尖端的注射用微玻璃管。将拉制好的玻璃微管连接至胶体分配器的玻璃底座上。
在解剖显微镜下，使用镊子折断玻璃微量移液器的尖端，使其尖端直径约为 75 微米。然后，通过吹吸嘴施加负压，将 3 至 5 微升胶水吸入玻璃微量移液器中。将装有胶水的尖端移至解剖室。
然后将装有胶水的微量移液器尖端靠近胚胎头部，同时通过口管向微量移液器保持轻微的正压。当移液器尖端接近胚胎头部时，施加足够的正压，使少量胶水滴到底层腔室底部。使用解剖针推动胚胎朝向胶水滴，使头部与胶水接触。
将胚胎背侧朝上放置，按压头部以确保其与胶水充分接触。在胶水逐渐硬化的过程中，使用解剖针调整胚胎位置，使其腹侧朝下、背侧朝上。将解剖针浸入胶水滴中，然后在胚胎头部上方及横向上拖拽少量胶丝，以进一步固定其位置。
当头部牢固地连接到硅胶上且胶水完全凝固后，用另一支玻璃微量移液管在后脑水平横切胚胎以处死。使用一支新的玻璃微量移液管，在后脑后方位置的皮肤表面进行数次浅层切割。对于背侧固定的标本，将移液管垂直于头尾轴方向，在躯干两侧浅层刺破皮肤；对于侧向固定的标本，则在躯干暴露的一侧进行浅层穿刺。
为制造镊子可夹持的皮肤瓣，使用微量移液器在初始切口水平位置多次刮擦皮肤，方向与切口垂直。用镊子逐渐抬起皮肤瓣，并向尾侧牵拉皮肤。随后，在胚胎尾部附近滴加少量胶水。
使用这种胶水将尾部粘附到解剖室的底部。在胶水固化过程中，用解剖针调整躯干的位置，以确保躯干保持背侧朝上，并牢固地附着在解剖室上。完成初步解剖后，用林格氏液充分冲洗标本，以去除三卡因和碎片，并让标本静置五分钟。
接下来，将解剖液更换为细胞外记录液。如有需要，可在制备过程中加入固定剂。随后，将固定有胚胎的解剖培养皿转移至配备有40倍水浸长工作距离物镜的直立复式显微镜载物台上。
然后将一根空的硅酸盐厚壁玻璃微电极毛细管安装到前置放大器的电极夹持器上。将一段导管的一端连接至电极夹持器的通气口，另一端连接至一个三通旋塞阀。随后，将另一段导管的一端接上吹嘴，另一端连接至该三通旋塞阀。
随后，将微量移液器尖端移至脊髓最背侧的部分，轻轻刺穿脑膜。接着进行快速、短促的横向移动，以松解脑膜。当微量移液器尖端穿过脑膜后，向前推进并上提微量移液器，将脑膜从脊髓上剥离。
随后将微量移液器向头侧推进一至两个半节段，以暴露罗氏须细胞。根据我们的经验，罗氏须神经元比其他脊髓神经元更为脆弱。为了保持其健康状态，我们每次仅暴露一至两个罗氏须细胞。
通过电压钳记录技术，获得了受精后1天、2天和7天的胚胎及幼体中Rohon-Beard神经元的外向电流和内向电流。钳制电压为-80毫伏，通过去极化至+20毫伏的电压阶跃诱发电流。在电流钳模式下，向胚胎和幼体的Rohon-Beard神经元注入0.35纳安、持续1毫秒的电流，均可引发单个动作电位。
在没有电刺激的情况下，Rohon-Beard 神经元不表现出自发性放电。随着发育的进行，Rohon-Beard 神经元的静息电位逐渐变得更负。一旦掌握该方法，可在 10 分钟内完成胚胎的固定和解剖，以暴露 Rohon-Beard 神经元。
如实验方案中所述，了解决定胶水硬化速度的因素非常重要。本视频重点介绍了从斑马鱼脊髓神经元进行记录的关键步骤。
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概述
本文描述了对斑马鱼胚胎和幼鱼脊髓神经元进行电生理记录的方法。该制备方法可维持神经元 原位 且通常涉及最少的解剖操作，便于在早期发育过程中研究多种脊髓神经元。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 电生理学
- 发育生物学
背景
- 斑马鱼是研究脊髓神经元功能的有力模型。
- 电生理学方法可补充遗传学和成像技术。
- 该技术最初是为罗氏背根神经元开发的。
- 经过改进后，可用于研究多种类型的脊髓神经元。
研究目的
- 实现对脊髓神经元在体内的电生理学研究。
- 研究胚胎期和幼虫期神经元的电兴奋性。
- 为该领域的研究人员提供详细的实验方案。
使用的方法
- 使用硅胶弹性体制备解剖记录室。
- 用三卡因溶液固定胚胎。
- 解剖技术以暴露脊髓神经元。
- 使用微电极进行电生理记录的装置设置。
主要结果
- 成功在原位维持脊髓神经元以进行记录。
- 改进的方法可用于研究不同类型的脊髓神经元。
- 详细的实验操作步骤提高了研究人员的可重复性。
- 深入了解发育过程中脊髓神经元的电学特性。
结论
- 所述方法为研究脊髓神经元提供了可靠的框架。
- 电生理记录可提供有关神经元功能的宝贵数据。
- 该方法可应用于斑马鱼中多种类型的脊髓神经元。
常见问题
行业重要性概述
对斑马鱼脊髓神经元进行电生理记录，为研究早期发育过程中神经元的兴奋性和功能连接性提供了一个高分辨率的平台。该技术能够精确、定量地评估感觉神经元和运动神经元的特性，有助于在神经发育研究中实现机制层面的风险评估和靶点验证。通过整合遗传学、成像和功能检测等多种读数，该方法增强了对早期神经科学项目组合的预测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在遗传学上可操作的脊椎动物模型中直接测量神经元兴奋性和突触功能。
- 支持对神经发育障碍相关候选基因和通路进行功能验证。
- 通过将基因型与电生理表型关联，实现机制层面的风险评估。
- 为在疾病相关的神经环路中快速进行假设检验提供了平台。
筛选与检测方法开发
- 建立可重复、定量的原位神经元活性检测方法。
- 实现跨发育阶段和神经元类型的电生理实验方案的标准化。
- 支持针对神经兴奋性或突触传递的化合物筛选的高通量检测。
- 提供可靠数据，用于比较不同遗传或药理学干预的效果。
转化与临床前研究
- 将功能读数与疾病相关的神经通路相匹配，以推动转化生物标志物的开发。
- 在脊椎动物系统中实现从基因操作到功能验证的连续性。
- 通过提供靶点结合及功能影响的早期证据，降低转化风险。
- 能够建立具有高预测价值的神经发育表型的临床前模型。
流程与工作流整合
这种斑马鱼原位脊髓制备方法通过实现对神经回路的直接功能评估，架起了早期发现与临床前验证之间的桥梁。该方法可与遗传学、成像和药理学工作流程无缝整合，支持迭代式假设检验和靶点优先筛选。
- Discovery Biology：为研究基因或化学物质扰动对神经元兴奋性的功能影响提供平台。
- Screening：提供标准化、定量的电生理输出结果，适用于检测方法开发和化合物评估。
- Analytics：生成可重复的动作电位、突触电流和静息膜电位测量数据，用于比较分析。
- Translational Research：支持将功能终点与疾病相关的神经通路和生物标志物相对接。
- Enterprise Reuse：提供可重复使用且可灵活调整的系统，适用于多个项目中的多样化神经科学研究与开发应用。
运营与企业影响
- 科学价值：提高神经功能靶点验证和机制研究的预测可信度。
- 操作价值：增强早期研究中电生理检测的可重复性和标准化水平。
- 战略价值：通过提供神经靶点的定量功能性数据，改善“推进/终止”决策过程。
- 项目组合影响：实现对神经发育相关靶点和通路的风险调整后优先排序，推动其进一步开发。
实施注意事项
- 需要具备斑马鱼操作、解剖及电生理记录技术方面的专业知识。
- 需要专用仪器设备，包括微电极装置和高分辨率显微镜。
- 需要跨团队对实验方案进行标准化，以确保可重复性和数据可比性。
- 通过调整实验方案，可适用于不同发育阶段和多种神经元类型。
- 可能的局限性包括神经元的脆弱性以及组织制备过程中的技术变异性。
