Name: 斑马鱼原位脊髓制备用于脊髓感觉和运动神经元的电生理记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 学习斑马鱼原位脊髓制备技术，用于胚胎和幼体阶段感觉与运动神经元的电生理记录。该方法支持多种脊髓神经元类型的研究，为神经发育生物学提供可靠的实验方案。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助（RLM 获 F32 NS059120，ABR 获 R01NS25217 和 P30NS048154）。

作者声明不存在竞争性财务利益。

本文所述方法可在对斑马鱼胚胎脊髓进行最小程度解剖后，实现对其感觉神经元和运动神经元的电生理及形态学表征。神经元在至少1小时内保持健康状态，该时间为本记录实验的时间限制。实验中采用标准的全细胞记录模式以及核膜片记录模式对神经元进行记录；后一种方法可最大程度减少空间钳制问题，从而避免离子电流生物物理特性详细研究的受限9。
一个重要的挑战是实现胚胎或幼体在记录室中的牢固附着，以便去除皮肤并进行有限的解剖，从而暴露目标神经元。此外，样本还需在整个全细胞膜片钳记录过程中稳定固定于记录室中。本文介绍了一种利用兽用缝合胶将胚胎或幼体粘附于解剖/记录室的方法，该方法此前已被用于其他模式生物（例如，果蝇）的解剖63。根据我们培训他人的经验，最关键的步骤是精确控制微量胶水的施加。本文还讨论了一种胶水分配装置，该装置可通过施加负压或正压，将胶水吸入或推出微移液管尖端。使用缝合胶可将胚胎和幼体牢固地固定在记录室中，并可根据需要以背侧朝上或侧向的方式进行定位，从而为多种神经元提供不同的操作通路。...

George Streisinger 首次将 Danio rerio（通常称为斑马鱼）用作脊椎动物发育遗传学研究的模式系统10。该模型具有多项优势，包括：（1）动物饲养相对简单且成本低廉；（2）体外受精，便于从最早发育阶段起获取胚胎；（3）胚胎透明，可直接且反复观察细胞、组织和器官的形成过程。
在随后的几十年中，多项进展进一步增强了斑马鱼模型的研究能力。特别是正向遗传筛选和全基因组测序工作，在鉴定对多种发育过程至关重要的突变和基因方面发挥了关键作用11,12,13,14,15,16。Gateway克隆技术使得转基因方法得以常规应用17,18。近年来基因组编辑技术的进步，以转录激活样效应因子核酸酶（TALENs）和成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-Cas9核酸酶为代表，实现了对突变的靶向引入，以及基因敲除和基因敲入等策略19,20,21,22。这些方法的结合使斑马鱼成为研究特定行为及多种人类疾病遗传机制的有力模型23,24,25,26,27。
本研究聚焦于发育调控以及电活动在神经元发育中的作用，重点研究脊髓。斑马鱼模型为脊髓研究提供了多项优势。首先，斑马鱼在胚胎期和幼体期较易获取，因此可以在神经元数量较少、神经环路较简单的发育阶段研究脊髓功能28,29。此外，斑马鱼脊髓包含多种类型的神经元，与其他脊椎动物相似，这一点已通过一系列具有特征性和区分性的转录因子表达模式得到证实30,31,32,33,34,35。
在斑马鱼中，旨在揭示脊髓神经环路功能机制（尤其是与运动功能相关的环路）的大多数研究，理所当然地集中于幼体阶段36,37,38,39,40,41,42,43。然而，构成脊髓运动神经网络的许多神经元早在胚胎发育早期（受精后约9–10小时，hpf）即开始分化44,45,46,47,48,49,50,51。鉴于此，了解脊髓神经元的形态学和电生理特性在胚胎期至幼体期之间如何产生和变化，对于全面理解运动环路的形成与功能具有重要意义。
此处描述的解剖方法可用于对脊髓神经元进行膜片钳记录，并已成功应用于胚胎期（约17–48小时受精后，hpf）和幼体期（约3–7天受精后，dpf）。该方法通过最小化解剖操作，仅暴露目标神经元即可实现记录。本方案与大多数已发表的斑马鱼脊髓神经元记录方法不同之处在于，使用兽用缝合胶而非细钨针将胚胎或幼体固定于记录槽中。两种不同方法的可选性（即， 缝合胶与钨针在斑马鱼胚胎或幼鱼固定用于电生理分析方面提供了不同的选择，使研究人员能够根据特定实验目标选用合适的方法。
首先，描述了获取并记录初级感觉神经元——罗氏-比尔德细胞（Rohon-Beard cells）群体活动的操作步骤。这些神经元的胞体位于脊髓背侧。罗氏-比尔德细胞存在于多种脊椎动物中，于发育早期即发生分化，并介导胚胎期的触觉反应6,44,47,48。
其次，详细描述了获取和记录脊髓运动神经元的实验方法。斑马鱼脊髓运动神经元在两波神经发生过程中产生。较早产生的初级运动神经元出现在原肠胚形成末期（约9–16 hpf），每个半节段仅存在3–4个初级运动神经元45,46,49。相比之下，较晚产生的次级运动神经元数量更多，其发生过程持续较长时间，始于约14 hpf45,50。在躯干中段节段，次级运动神经元的生成大多在51 hpf时完成50。次级运动神经元被认为是羊膜动物运动神经元的对应物46。有趣的是，上脊髓神经元通过多巴胺调节幼虫的运动行为，以及胚胎和幼龄幼虫时期次级运动神经元的生成过程50,51。初级和次级运动神经元各自包含多种不同的亚型。每种初级运动神经元亚型均发出一条周围轴突，支配特定的肌群，从而形成典型且可识别的轴突投射路径。通常情况下，次级运动神经元沿初级运动神经元先前建立的轴突通路延伸。因此，在轴突投射路径方面，初级与次级运动神经元相似，唯一的区别在于初级运动神经元的轴突更粗、胞体更大45。
第三，讨论了记录几种类型中间神经元的方法。然而，在这些情况下，需要有限地去除其他脊髓细胞，因此相较于记录Rohon-Beard细胞或运动神经元，脊髓的完整性较低。

<table><tbody><tr><td>真空滤器/储存瓶，0.22 mm 孔径</td><td>Corning</td><td>431096</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器，0.2 mm</td><td>Whatman</td><td>6780-2502</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td>氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-bungarotoxin</td><td>Tocris</td><td>11032-79-4</td><td></td></tr><tr><td>河豚毒素</td><td>Tocris</td><td>4368-28-9</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-549 肼盐</td><td>Molecular Probes</td><td>A-10438</td><td>荧光染料</td></tr><tr><td>Spin-X 离心管滤器</td><td>Corning</td><td>8161</td><td></td></tr><tr><td>玻璃显微镜载玻片</td><td>Fisher</td><td>12-550C</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 硅橡胶弹性体试剂盒</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td>硅橡胶弹性体</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0038</td><td>内径和外径分别为 0.78 和 1.0 mm（薄壁玻璃毛细管）</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-1000-100</td><td>内径和外径分别为 1.13 和 1.55 mm（厚壁玻璃毛细管）</td></tr><tr><td>微型带倒钩聚丙烯接头&amp;nbsp;</td><td>Cole-Palmer</td><td>6365-90</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond 组织粘合剂&amp;nbsp;</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>&amp;nbsp;Model P-97&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>放大器</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>前置放大器</td><td>Molecular Devices</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>电动显微操作器&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 软管</td><td>Fisher</td><td>14-169-1B</td><td>内径 1/16 英寸，外径 1/8 英寸，壁厚 1/32 英寸（柔性实验室软管）</td></tr><tr><td>电极夹持器</td><td>Molecular Devices</td><td>1-HC-U</td><td></td></tr><tr><td>Pharmaseal 三通旋塞阀&amp;nbsp;</td><td>Baxter</td><td>K75</td><td></td></tr><tr><td>数据采集卡</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 FS plus</td><td></td></tr><tr><td>40X/0.80W Achroplan 物镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>数据采集与分析软件&amp;nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>PClamp 10 - Clampex 和 Clampfit&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微移液管拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>Model P-97</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;解剖与记录溶液（单位：mM）&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>除细胞内溶液外，所有溶液经滤膜（0.22 mm 滤杯）过滤后，室温（RT）保存可稳定约 2–3 个月。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞内溶液经（0.2 mm 注射器滤器）过滤后，分装成小份，于 -20 &amp;deg;C 冻存，使用当天单独解冻。&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖/Ringer&amp;rsquo;s 溶液</td><td></td><td></td><td>145 NaCl，3 KCl，1.8 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，10 HEPES；pH 7.4（用 NaOH 调节）</td></tr><tr><td>移液管（细胞内）记录溶液</td><td></td><td></td><td>135 KCl，10 EGTA-酸，10 HEPES；pH 7.4（用 KOH 调节）。</td></tr><tr><td>浴液（细胞外）记录溶液/电压钳与电流钳</td><td></td><td></td><td>125 NaCl，2 KCl，10 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，5 HEPES；pH 7.4（用 NaOH 调节）。</td></tr><tr><td>Alexa-594 肼盐储备液。&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>用 ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 配制 13.2 mM 储备液，分装（约 100 &amp;micro;l），-20 &amp;deg;C 保存。使用时，用移液管溶液将储备液稀释 132 倍，终浓度为 100 mM。稀释后，用离心管滤器过滤含 Alexa-594 的移液管溶液&amp;nbsp;。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;固定剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.4% 氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（Tricaine）</td><td></td><td></td><td>用 0.2 M Tris（pH 9）配制 0.4% 储备液（0.4 g Tricaine/100 mL 0.2 M Tris）</td></tr><tr><td colspan="4">用 NaOH 调节 pH 至 7，-20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td colspan="4">使用时，用胚胎培养基将储备液稀释约 25 倍。</td></tr><tr><td>250 mM &amp;alpha;-bungarotoxin</td><td></td><td></td><td>用 ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 配制 250 mM 储备液（1 mg/500 mL），分装成 100 &amp;micro;L 份，-20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td colspan="4">使用时，用细胞外溶液稀释 2,500 倍，终浓度为 100 nM。</td></tr><tr><td>1 mM 河豚毒素</td><td></td><td></td><td>用 ddH2O 配制 1 mM 储备液（1 mg/3 mL），分装成 100 &amp;micro;L 份，-20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td colspan="4">使用时，用细胞外溶液稀释 2,000 倍，终浓度为 500 nM。</td></tr></tbody></table>

斑马鱼脊髓感觉和运动神经元电生理记录的 in situ 脊髓制备

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

斑马鱼最初被引入作为发育生物学模型，现已在许多其他领域得到广泛应用。大量饲养这种快速发育生物的便利性，以及胚胎期良好的光学通透性，是该模型最初受到青睐的主要优势。在过去的二十年中，由于其适用于大规模诱变筛选且易于进行转基因操作，该模型的应用进一步取得成功。近年来，基因编辑技术的出现进一步拓展了这一模型的应用潜力。
在神经发育研究中，斑马鱼胚胎和幼鱼是一种可应用多种方法的模型。本文重点介绍可用于研究神经元基本特性——电兴奋性的方法。我们用于斑马鱼脊髓神经元电生理研究的制备方法，涉及使用兽用缝合胶将样本固定在记录室中。其他记录斑马鱼胚胎和幼鱼电活动的方法则通常采用细钨针将样本固定于记录室1,2,3,4,5。钨针通常用于将样本以侧向位置固定，尽管也有将其用于背侧朝上固定幼鱼的报道4。而缝合胶则可用于两种方向的胚胎和幼鱼固定。使用胶固定的优点在于可进行最小限度的解剖，从而在无需酶处理的情况下暴露脊髓神经元，避免由此引起的组织损伤。然而，对于幼鱼而言，仍需进行短暂的酶处理以去除脊髓周围包裹的肌肉组织。本文所述方法已被用于研究多个发育阶段的运动神经元、中间神经元和感觉神经元的固有电生理特性6,7,8,9。

我们已成功从17小时受精龄胚胎至7天龄幼鱼的Rohon-Beard神经元记录到信号（图 5A 和 5B）。当记录罗恩-贝尔德细胞时，将标本背侧朝上固定。这种固定方式可根据这些细胞表浅的背侧位置和较大的胞体尺寸对其进行明确识别。此外，通过这些神经元典型的超极化静息膜电位可进一步确认其身份图5, 插图表格)6,54此外，由于罗恩-贝尔德神经元是初级感觉神经元，缺乏突触输入。因此，在无电刺激的情况下，采用电流钳模式记录时，膜电位不应发生任何变化图 5B'）。自从首次在斑马鱼中对Rohon-Beard细胞进行记录以来6，多种转基因品系（例如，Tg(islet2b:gfp)、Tg(ngn:gfp)，以及 Tg(isletss:gfp)</em...

本文描述了对斑马鱼胚胎和幼鱼脊髓神经元进行电生理记录的方法。该制备方法可维持神经元 原位 并且通常涉及最少的解剖操作。这些方法可用于对多种脊髓神经元进行电生理学研究，从早期幼体阶段开始即可记录其初始的电兴奋性。

斑马鱼最初被用作发育研究模型，现已在许多其他领域得到广泛应用。其易于大量饲养、胚胎发育迅速……

本实验方案的总体目标是实现对斑马鱼胚胎期和幼体期脊髓神经元进行原位电生理学研究。电生理学分析方法可与斑马鱼模型中已有的强大遗传学和成像技术相互补充。尽管该方法最初是为研究 Rohon-Beard 神经元而开发的，但我们已逐步对其进行了改进和拓展，目前可应用于多种类型的脊髓神经元研究。演示该实验操作的是研究助理 Dr.Rosa Moreno，我有幸与她合作多年。开始此操作时，先从一个玻璃管中取出黑色橡胶头，并用另一个玻璃管上的白色橡胶接头替换。接下来，截取一段长约 38 厘米的软管。然后，通过一个小型的直型聚丙烯接头连接软管。准备硅胶弹性体时，将基础剂与固化剂按4:1的比例加入塑料锥形管中。随后，将硅胶基础剂与固化剂充分混合。将混合物倒入两个100毫米的培养皿中，其中一个培养皿中的深度约为1毫米，另一个约为2.5毫米。让硅胶弹性体在空气中暴露固化4至5天。若需更快获得固化弹性体，可在60摄氏度下孵育。随后，从一毫米厚的固化弹性体上裁剪出一个3.8厘米×6.3厘米的矩形，作为腔室的底部。从2.5毫米厚的固化硅胶上裁剪出一个3.8厘米×6.3厘米的矩形，再从此矩形中切出一个2.5厘米×5厘米的内部矩形，以形成腔室顶部的框架。制作解剖记录室时，将薄硅胶矩形片直接放置在载玻片上方，注意去除硅胶与玻璃之间的任何气泡。然后将硅胶矩形框放置在薄硅胶底层的上方。在此步骤中，将一个胚胎放入含有两到三毫升林格氏液的解剖室中。加入 100 微升 0.4% 的三卡因溶液至孵育腔中，以固定胚胎。随后使用显微拉针仪从薄壁玻璃毛细管上拉制出具有细长尖端的注射微量移液管。将拉制好的玻璃微量移液管固定在胶水分配器的玻璃底座上。在解剖显微镜下，使用镊子折断玻璃微量移液管的尖端，使其尖端直径约为 75 微米。接着，通过吹吸管施加吸力，将 3 至 5 微升胶水吸入玻璃微量移液管中。然后将装有胶水的尖端移至解剖室。然后，通过口管向装有胶水的微量移液器施加轻微的正压，同时将移液器尖端靠近胚胎头部。当移液器尖端接近胚胎头部时，施加足够的正压，使少量胶水滴到底部腔室表面。使用解剖针将胚胎移向胶水滴，使胚胎头部与胶水接触。将胚胎背侧朝上放置，按压头部以确保其与胶水充分接触。随着胶水逐渐凝固，使用解剖针调整胚胎位置，使其腹侧朝下、背侧朝上。将解剖针浸入胶水滴中，然后在胚胎头部上方及横向上拖拉少量胶丝，以进一步固定其位置。当头部牢固地连接到硅胶上且胶水完全凝固后，用另一支玻璃微量移液管在后脑水平横切胚胎以处死。使用一支新的玻璃微量移液管，在后脑后方位置的皮肤表面进行数次浅层切割。对于背侧固定的标本，将移液管垂直于头尾轴方向，在躯干两侧浅层刺破皮肤；对于侧向固定的标本，则在躯干暴露的一侧进行浅层穿刺。为使镊子能够夹起皮肤瓣，使用微量移液器在初始切口水平并垂直于切口的方向反复刮擦皮肤数次，以形成皮肤瓣。用镊子逐渐抬起皮肤瓣，并向尾侧牵拉皮肤。随后，在胚胎尾部附近滴加少量胶水。使用这种胶水将尾部固定在解剖室的底部。在胶水硬化过程中，用解剖针调整躯干的位置，以确保躯干保持背侧朝上，并牢固地附着在解剖室上。完成初步解剖后，用林格氏液充分冲洗标本，以去除三卡因和碎片，并让标本静置五分钟。接下来，将解剖液替换为细胞外记录液。如有需要，向制备样本中添加固定剂。随后，将装有固定胚胎的解剖皿转移至配备40倍水浸长工作距离物镜的直立复式显微镜载物台上。然后将一根空的厚壁硅酸盐玻璃微电极安装到记录电极架的电极夹持器上。将一段导管的一端连接到电极架的通气口，另一端连接到三通旋塞阀。随后，将吹嘴连接到另一段导管的一端，并将该导管的另一端连接到三通旋塞阀。随后，将微量移液器尖端移至脊髓最背侧的部分，轻轻刺穿硬脑膜。通过快速、短促的横向移动松解硬脑膜。待微量移液器尖端穿过硬脑膜后，向前推进并上提移液器，以将硬脑膜从脊髓上剥离。随后将微量移液器向前脑方向移动，越过一至两个半节段，以暴露Rohon-Beard细胞。根据我们的经验，Rohon-Beard神经元比其他脊髓神经元更为脆弱。为保持其良好状态，我们每次仅暴露一至两个Rohon-Beard神经元。通过电压钳记录了一、二和七天受精后胚胎及幼体中 Rohon-Beard 神经元的外向电流和内向电流。钳制电位为 -80 毫伏，通过去极化至 +20 毫伏的电压阶跃诱发电流。在电流钳模式下，向胚胎和幼体的 Rohon-Beard 神经元注入 0.35 纳安、持续 1 毫秒的电流，可引发单个动作电位。在没有电刺激的情况下，Rohon-Beard神经元不会出现自发性放电。随着发育的进行，Rohon-Beard神经元的静息电位逐渐变得更负。一旦掌握该方法，可在10分钟内完成胚胎的固定和解剖，以暴露Rohon-Beard神经元。如方案中所述，了解决定胶水硬化速度的因素至关重要。本视频重点介绍了从斑马鱼脊髓神经元进行记录的关键步骤。

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