Name: 体外和活体评估移植受体的 T、B 和髓细胞抑制活性和体液反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 48 s
Description: 学习移植免疫耐受诱导方案，通过体外和体内实验评估调节性T细胞、B细胞及髓细胞的抑制功能，利用大鼠心脏移植模型研究免疫调节机制并优化治疗策略。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作是在 Labex IGO 项目（n&#176;法国国家研究局（ANR）管理的“未来投资”政府项目（ANR-11-LABX-0016-01）以及同样由“未来投资”政府项目资助、法国国家研究局（ANR）管理的IHU-Cesti项目（ANR-10-IBHU-005）。IHU-Cesti项目还获得了南特都市区和卢瓦尔河地区大区政府的支持。

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

将总脾细胞过继性转移至新移植的受体是检测某种治疗是否诱导或增强调节性细胞存在的有效方法。宿主经照射后产生的短暂性淋巴细胞减少可促进细胞在转移后的存活以及耐受的建立。此外，亚致死剂量照射为具有耐受原性特性的细胞在免疫重建过程中转化为新的调节性细胞提供了时间，这一现象称为传染性耐受34。通常在观察到耐受现象时，首先研究的是特征明确的CD4+CD25highFoxp3+CD127low Treg细胞。然而，转移阴性组分（即去除CD4+ Treg的脾细胞）有时可突破已知调节性细胞的范畴，从而鉴定出新的细胞群体1,2,3,4。在AdCD40Ig诱导的耐受模型中，将去除CD4+ </su...

大鼠心脏同种异体移植是一种可靠的器官移植模型，可用于评估耐受诱导治疗、解析耐受诱导与维持的机制，并具有诱导功能完整且具主导性的调节性细胞的潜力。以下方案描述了一种完全错配的异位心脏移植，即将Lewis 1W供体大鼠（LEW.1W，RT1u）的心脏移植至Lewis 1A受体大鼠（LEW.1A，RT1a）体内。在此移植组合中，急性排斥反应发生迅速（约7天），可通过触诊腹部评估移植物搏动情况来简便判断排斥状态。本文提出三种在大鼠中诱导心脏同种异体移植物耐受的方案。在这些模型中，耐受由不同类型的调节性细胞诱导和/或维持。首先，使用编码CD40Ig的腺病毒（AdCD40Ig）阻断CD40-CD40L相互作用，可诱导产生CD8+ Treg细胞，这类细胞在过继转移至二次移植受体后能够诱导耐受1。此外，在AdCD40Ig处理的受体中通过抗CD8α抗体耗竭CD8+细胞，可诱导产生Breg细胞和RegMCs2。对CD8+ Treg细胞特性的深入分析揭示了多种免疫调节分子的关键作用，其中包括白细胞介素-34（IL-34）和纤维素样白细胞介素-2（FGL-2）3,4,5,6。其中，IL-34的过表达（通过AAV载体）通过诱导RegMCs生成Treg细胞，而FGL-2的过表达则诱导Breg细胞，表明调节性细胞之间存在复杂的调控网络。
由于慢性排斥反应发展缓慢且持续时间较长，因此需要进行深入分析以区分耐受与慢性排斥反应。通常通过免疫组织化学方法评估移植物的细胞浸润、纤维化、血管壁增厚以及补体C4d的沉积情况7。尽管组织学方法需要牺牲动物或进行移植物活检，本文中我们描述了一种简便的方法，用于评估耐受性同种异体移植物的不同特征：通过流式细胞术（此处使用荧光激活细胞分选技术，FACS）检测血液样本中调节性细胞的出现及其功能，以及抗供体特异性抗体反应。
在停止治疗后维持对同种异体移植物的耐受性通常与诱导调节性细胞有关8。近几十年来，针对CD4+ Treg的研究一致将其关键标志物定义为Foxp3+、CD25high和CD127-9,10,11。类似地，CD8+ Treg也被赋予多种标志物，如CD122+、CD28-、CD45RClow、PD1+和Helios+1,12,13,14,15,16,17。此外，随着时间推移，GITR、CTLA4以及细胞因子（IL-10、TGFβ、IL-34、IL-35、FGL-2）的表达也被认为与Treg表型相关3,4,6,13,18,19,20,21。然而，新出现的调节性细胞群体，如Breg、RegMC或NKTreg，尚缺乏明确的特异性标志物。事实上，Breg主要被报道为未成熟的CD24+细胞，CD27表达具有不确定性，并有时产生IL-10、TGFβ或颗粒酶B22,23,24。髓系细胞谱系的复杂性要求联合使用多种标志物来界定其调节性或促炎性表型，例如CD14、CD16、CD80、CD86、CD40、CD209a或CD16325,26。最后，已有研究报道某些标志物可用于识别NKTreg，如CD11b+、CD27+、TGFβ+，但仍需更多研究以进一步明确其表型特征27,28,29,30,31,32。因此，必须提供抑制功能的证据，以支持对新型生物标志物、新型免疫调节介质的鉴定，并拓展至新型细胞治疗的应用范围。
我们提出两种互补的方法来评估细胞的抑制活性。首先，体外方法包括将抑制性细胞与经同种异体供体抗原呈递细胞（APCs）刺激并标记的效应T细胞按不同比例共培养6天，随后分析反映供体特异性免疫抑制的效应T细胞增殖情况。经处理的大鼠来源的细胞可直接与未经处理的正常大鼠或未经治疗的移植大鼠来源的细胞（或任何其他调节性细胞群体）在一系列抑制细胞：效应细胞比例下比较其抑制活性。此外，该方法无需进行任何移植操作，结果可在6天内获得。其次，体内方法包括将来自经处理大鼠的待测调节性细胞转移至新近经照射处理的移植受体中。通常情况下，来自未经处理的正常大鼠的B细胞、髓系细胞或T细胞在过继转移后往往无法抑制急性排斥反应或延长移植物存活时间，而来自经处理受体、具有增强抑制活性的细胞则具备这些特性1,2,3,4,33。建议通过照射受体诱导淋巴细胞减少，以确保过继转移的细胞不受血液稳态的影响，并更有效地调控抗供体免疫应答。对于这两种方法，使用体外同种异体第三方APCs，或体内将抑制性细胞过继转移至接受第三方心脏移植的受体中，均可用于分析抗供体特异性。尽管体内方法需要大量细胞，但数量稀少的细胞亚群的抑制活性更易于通过体外方法进行评估33。
也可通过检测体液免疫反应来评估耐受状态以及对供体抗原特异性抗体反应的控制情况。事实上，免疫耐受的特征表现为受体对供体不产生体液免疫反应，但仍保留针对新抗原产生体液免疫反应的能力，同时维持免疫记忆应答。首先，同种异体抗体检测的基本原理是将供体细胞类型与移植后受体的血清共同孵育，通过受体抗体对供体细胞的识别来进行检测。其次，可通过在完全弗氏佐剂中乳化的钥孔戚血蓝蛋白（Keyhole Limpet Hemocyanin, KLH）刺激长期耐受受体，以评估其对外源性抗原的体液免疫应答。免疫后第4天和第13天分别可采用酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA）检测针对抗原的特异性IgM和IgG抗体的存在34。第三，可通过在移植前7天（-7天）和移植后3天（+3天）注射异种红细胞（RBCs），并在移植后8天和17天采集受体血清进行红细胞染色，以评估免疫记忆应答的保留情况。上述所有方法均可利用特异性二抗鉴定免疫球蛋白亚型，并通过FACS染色在1.5小时内快速获得结果，或通过ELISA在数小时内完成检测。
最后，这些方案旨在用于移植模型的表征，在一定程度上也可应用于自身免疫疾病模型。该方法的原理可推广至所有物种。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;动物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEW.1W 和 LEW.1A 大鼠</td><td>Janvier Labs，法国</td><td></td><td>8 周龄，&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BN 第三方供体大鼠</td><td>Janvier Labs，法国</td><td></td><td>8 周龄，&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AdCD40Ig</td><td>法国南特 INSERM UMR 1089 病毒载体核心实验室</td><td></td><td>自制质粒</td></tr><tr><td>IL34-AAV</td><td>法国南特 INSERM UMR 1089 病毒载体核心实验室</td><td></td><td>自制质粒</td></tr><tr><td>FGL2-AAV</td><td>法国南特 INSERM UMR 1089 病毒载体核心实验室</td><td></td><td>自制质粒</td></tr><tr><td>抗 TCRab</td><td>欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株</td><td>R7/3 克隆</td><td>自制培养、纯化及荧光偶联</td></tr><tr><td>抗 CD25</td><td>欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株</td><td>OX39 克隆</td><td>自制培养、纯化及荧光偶联</td></tr><tr><td>抗 CD8</td><td>欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株</td><td>OX8 克隆</td><td>自制培养、纯化及荧光偶联</td></tr><tr><td>抗 CD45RA</td><td>欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株</td><td>OX33 克隆</td><td>自制培养、纯化及荧光偶联</td></tr><tr><td>抗 CD161</td><td>欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株</td><td>3.2.3 克隆</td><td>自制培养、纯化及荧光偶联</td></tr><tr><td>抗 CD11b/c</td><td>欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株</td><td>OX42 克隆</td><td>自制培养、纯化及荧光偶联</td></tr><tr><td>抗 TCRgd</td><td>欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株</td><td>V65 克隆</td><td>自制培养、纯化及荧光偶联</td></tr><tr><td>抗 CD45RC</td><td>欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株</td><td>OX22 克隆</td><td>自制培养、纯化及荧光偶联</td></tr><tr><td>抗 CD4</td><td>欧洲细胞培养物保藏中心（Salisbury，英国）杂交瘤细胞株</td><td>OX35 克隆</td><td>自制培养、纯化及荧光偶联</td></tr><tr><td>抗 CD45R</td><td>BD Biosciences，加利福尼亚州山景城</td><td>#554881，His24 克隆</td><td></td></tr><tr><td>抗大鼠 IgG-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC，巴尔的摩，美国</td><td>#112-096-071</td><td></td></tr><tr><td>抗大鼠 IgG1</td><td>Serotec</td><td>#MCA 194</td><td></td></tr><tr><td>抗大鼠 IgG2a</td><td>Serotec</td><td>#MCA 278</td><td></td></tr><tr><td>抗大鼠 IgG2b</td><td>Serotec</td><td>#MCA 195</td><td></td></tr><tr><td>抗大鼠 IgM-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC，巴尔的摩，美国</td><td>#115-095-164</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素 HRP</td><td>BD Biosciences，加利福尼亚州山景城</td><td>#554066</td><td></td></tr><tr><td>KLH</td><td>Sigma Aldrich，圣路易斯，美国</td><td>#9013-72-3</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;Scientific Inc，美国</td><td></td><td>无钙镁磷酸盐缓冲液，&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma，圣路易斯，美国</td><td>#9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>TMB 显色试剂盒</td><td>BD Biosciences，加利福尼亚州山景城</td><td>#555214</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; CFSE 细胞增殖试剂盒</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;Scientific Inc，美国</td><td>#C34554</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基 1X</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;Scientific Inc，美国</td><td>#31870-025</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;Scientific Inc，美国</td><td>#15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 缓冲液</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;Scientific Inc，美国</td><td>#15630-056</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;Scientific Inc，美国</td><td>#11140-035</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;Scientific Inc，美国</td><td>#11360-039</td><td></td></tr><tr><td>2-β-巯基乙醇</td><td>Sigma，圣路易斯，美国</td><td>#M3148</td><td></td></tr><tr><td>Cell Proliferation Dye eFluor&amp;reg; 450 细胞染料</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;Scientific Inc，美国</td><td>#65-0842-85</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Sigma，圣路易斯，美国</td><td>#G3126</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;Scientific Inc，美国</td><td>#D1306</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 D</td><td>Roche Diagnostics，德国</td><td>#11088882001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma，圣路易斯，美国</td><td>#E5134</td><td></td></tr><tr><td>0.9% NaCl</td><td>Fresenius Kabi</td><td>#B230561</td><td></td></tr><tr><td>磁性 Dynabeads</td><td>Dynal, Invitrogen</td><td>#11033</td><td>羊抗小鼠 IgG</td></tr><tr><td>One Comp eBeads</td><td>Ebiosciences，圣地亚哥，美国</td><td>#01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>参照机构指南</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>参照机构指南</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纳布啡</td><td>参照机构指南</td><td></td><td></td></tr><tr><td>土霉素</td><td>参照机构指南</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td>参照机构指南</td><td></td><td></td></tr><tr><td>美洛昔康</td><td>参照机构指南</td><td></td><td></td></tr><tr><td>完全弗氏佐剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>隆朋</td><td>参照机构指南</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乳酸林格液</td><td>参照机构指南</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>参照机构指南</td><td></td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解液</td><td></td><td></td><td>将 8.29 g NH4Cl（Sigma，圣路易斯，美国 A-9434）、1 g KHCO3（Prolabo 26 733.292）和 37.2 mg EDTA（Sigma，圣路易斯，美国 E5134）溶于 800 ml H2O 中，调节 pH 至 7.2–7.4，加水定容至 1 L。</td></tr><tr><td>胶原酶 D</td><td></td><td></td><td>将 1 g 胶原酶溶于 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS 中</td></tr><tr><td>PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%)</td><td></td><td></td><td>向 1 ml PBS 1X 中加入 5 ml EDTA 0.1 M（Sigma，圣路易斯，美国 E5134）和 20 ml FCS</td></tr><tr><td>CFSE（Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen）</td><td></td><td></td><td>将 50&amp;micro;g（=1 管）CFDA SE（组分 A）溶于 90&amp;mu;l DMSO（组分 B）中，配制成 10 mM 储存液。然后将储存液用 PBS 1X 稀释 20,000 倍，得到 0.5&amp;mu;M 溶液</td></tr><tr><td>共培养完全培养基</td><td></td><td></td><td>500 ml 完全 RPMI-1640 培养基，含 5 ml 青霉素（80 单位/ml）-链霉素（80 mg/ml）、5 ml L-谷氨酰胺、5 ml 非必需氨基酸（100X）、5 ml 丙酮酸钠（100 mM）、5 ml HEPES 缓冲液（1 M）、2.5 ml β-巯基乙醇（7 ml 2-巯基乙醇原液稀释于 10 ml RPMI 中）、10% FCS</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>BD Biosciences，加利福尼亚州山景城</td><td>#227261</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>BD Biosciences，加利福尼亚州山景城</td><td>#188271</td><td></td></tr><tr><td>筛网</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning 塑料培养皿</td><td>VWR，佩萨克</td><td>#391-0439</td><td></td></tr><tr><td>100&amp;micro;m 和 60&amp;micro;m 组织滤网</td><td>Sefar NITEX，海登，瑞士</td><td>#03-100/44 和 #03-60/35</td><td></td></tr><tr><td>共培养用 96 孔圆底板</td><td>&amp;nbsp;Falcon 圆底组织培养板，无菌，Corning</td><td>#353077</td><td></td></tr><tr><td>FACS 染色用 96 孔 V 底板</td><td>ThermoScientifique，丹麦</td><td>#249570</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 用 96 孔平底板</td><td>Nunc Maxisorb</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脾脏研磨用注射器</td><td>BD Biosciences，加利福尼亚州山景城</td><td>#309649</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 阅读仪</td><td>SPARK 10M，Tecan，瑞士</td><td>SPARK 10M，Tecan，瑞士</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴锅&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X 射线辐照仪</td><td>Lincolshire，英国</td><td>Faxitron CP160</td><td></td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences，加利福尼亚州山景城</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Aria II</td><td>BD Biosciences，加利福尼亚州山景城</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁力架</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;Scientific Inc，美国</td><td>12302D</td><td></td></tr></tbody></table>

体外 与 体内 评估移植受者t细胞、b细胞及髓系细胞的抑制活性与体液免疫应答

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

移植领域的主要关注点是通过诱导调节性细胞来实现特异性耐受。对耐受机制的理解需要可靠的模型。本文描述了通过阻断共刺激信号或通过基因转移上调免疫调节分子而在大鼠中建立的心脏同种异体移植物耐受模型。这些模型中的每一种均允许 体内 调节性细胞（如调节性T细胞（Tregs）、调节性B细胞（Bregs）或调节性髓系细胞（RegMCs））的生成。在本文中，我们描述了两种互补的实验方案，用于鉴定和定义 体外 和 体内 调节性细胞活性，以确定其在耐受诱导与维持中的作用. 首先，一个 体外 抑制性实验能够以剂量依赖的方式快速鉴定出对效应免疫应答具有抑制能力的细胞，并可用于进一步分析，如细胞因子检测或细胞毒性测定。其次，将耐受处理受者体内的细胞过继转移至新近经照射并接受移植物的受者体内，可凸显这些细胞在调控移植物定向免疫应答以及/或者诱导新生调节性细胞（称为传染性耐受）方面的耐受诱导特性。这些方法不限于具有已知表型标志物的细胞，可推广应用于任何细胞群体。此外，可通过使用第三方供体细胞或移植物来评估调节性细胞对供体特异性的同种反应性（该目标是本领域的重要研究方向） 体外 或 体内最后，为了确定这些调节性细胞特异性的耐受诱导能力，我们提供了评估受体体液抗供体抗体反应，以及受体针对新抗原或既往已知抗原产生体液免疫应答能力的实验方案。所述的耐受模型可用于进一步表征调节性细胞，鉴定新的生物标志物和免疫调节分子，并可适用于啮齿类动物或人类的其他移植模型及自身免疫性疾病研究。

抗原呈递细胞分选后抑制活性的评估（图1），效应T细胞和调节性T细胞同时图2），或单独地（图4），以及其他任何假定的调节性细胞（图3），可以完成 体内 通过直接注射调节性细胞 体外 通过CFSE荧光强度的测定（图5）。受者对供者体液免疫反应的状态（图6）或外源性抗原（图7 和 8）也可以进行评估 体外 随后 体内 如图所示进行免疫。
<img alt="显示细胞分...

在此，我们介绍一种诱导移植耐受的方案，并对其进行评估 体外 和 体内 受者不同细胞亚群的抑制能力以及受者对供者或外源性抗原的免疫状态。

体外 与 体内 评估移植受者T细胞、B细胞及髓系细胞的抑制活性与体液免疫应答

移植领域的主要关注点是通过诱导调节性细胞来实现特异性免疫耐受。对耐受机制的理解……

移植耐受的诱导通常与调节性细胞群体的出现相关，表现为对供体抗原缺乏免疫应答，但对异源抗原的免疫力得以保留。我们采用多种实验方案，用于体外和体内评估任意调节性细胞亚群的抑制能力，以及宿主体液免疫应答的状态。使用异氟烷-O2 吸入麻醉，并在五分钟后补充 1% 氧化亚氮，对供体 Lewis 1W 大鼠进行麻醉。将动物置于仰卧位，用聚维酮碘消毒腹部，进行开胸手术。夹闭下腔静脉和上腔静脉，结扎后切断。然后切断肺动脉和主动脉，将移植物保存在冷的0.9% NaCl溶液中。使用异氟烷-O2吸入并辅以1% N2O，麻醉8至12周龄、体重150克的Lewis 1A受体大鼠。将动物置于仰卧位，用聚维酮碘消毒腹部，行头侧至耻骨的剖腹手术。外翻肠管，夹闭腹部血管。在移植的主动脉与腹主动脉之间行末端侧吻合术。在肺动脉与下腔静脉之间松开并移除血管夹。缝合肌肉层和皮肤，并用碘伏进行消毒。皮下注射美洛昔康，肌肉注射土霉素和布托啡诺，并将动物置于加热灯下，直至动物苏醒。为减轻同种异体排斥反应，继续使用所选药物进行处理。取未经过处理的 Lewis 1W 大鼠的脾脏，并将其保存在冰冷的 1× PBS 中。将脾脏转移至培养皿中，吸除 PBS，并用 5 mL Collagenase D 灌注。为增强酶的作用效果，将脾脏切成小块，并在 37 °C 下孵育 15 分钟。加入500微升0.1摩尔的EDTA。将脾组织块转移至筛网中，用无菌研杵研磨脾组织以分散细胞。转移至离心管中，并用50毫升PBS洗涤细胞。在430 G下离心10分钟。弃去上清液。去除红细胞和血小板。将脾细胞沉淀重悬于10 mL低渗溶液中，在室温下孵育5分钟。然后用 PBS 洗涤，以 190 ×g 离心 10 分钟，弃去上清液。通过 100 µm 细胞滤器过滤去除胶原纤维。计数细胞，并用含 2% CS 和 0.5 mmol/L EDTA 的 PBS 调整细胞浓度至 5×10⁷ 个细胞/mL。在4°C条件下，加入抗TCRα/β和抗TCRγ/δ抗体标记T细胞，抗CD45RA抗体标记B细胞，抗CD161抗体标记NK细胞，孵育15分钟。用PBS-FCS-EDTA洗涤，430 ×g离心10分钟。洗涤磁性Dynabeads，每10⁶个脾细胞使用35 µL Dynabeads，加入30 mL PBS-FCS-EDTA。将样品置于磁力架上一分钟，弃去上清液，重复此步骤三次。用10倍体积的PBS-FCS-EDTA重悬Dynabeads。弃去离心后细胞的上清液。将脾细胞与Dynabeads在4°C下混合10分钟并同时进行振荡，以去除不需要的细胞。然后将试管置于磁铁上1分钟，将上清液转移至新试管中。重复两次。计数细胞，并用 PBS-FCS-EDTA 将细胞浓度调整至 5 × 10⁷ 个细胞/mL。使用标记抗体分选 pDCs。加入抗-CD45RA抗体以标记B细胞，加入

in-vitro-vivo-assessment-t-b-myeloid-cells-suppressive-activity

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

体外和活体评估移植受体的 T、B 和髓细胞抑制活性和体液反应

Tregs 是免疫系统的强效抑制细胞。由于缺乏定义 Tregs 的特异性表面标志物，因此对 Tregs 的定义主要基于其功能。本文描述了一种优化的 体外...

人类 体外 抑制作为识别免疫失衡早期状态的筛选工具

小鼠骨髓移植是一种广泛使用的技术，用于研究调控人类移植物抗宿主病的免疫学机制。体内监测T细胞迁移模式的能力，使得能够对移植物抗宿主病过程中T细胞反应的发生与发展进行详细分析。...

移植物抗宿主病的诱导 在体 内 使用MHC匹配的小鼠模型监测T细胞

我们介绍了一种有价值的诊断检测方法，该方法有可能用于决定在移植后撤除免疫抑制剂，而不会增加移植物排斥的风险。该检测利用迟发型超敏反应的原理，能够准确评估受者针对供体产生的特异性效应免疫应答和调节性免疫应答。...

抗原特异性调节的跨体迟发型超敏反应检测

详细监测T细胞反应的能力 体内 对于深入理解免疫应答机制具有重要意义。本文描述了荧光靶标阵列（FTAs）在一种 体内 评估T细胞功能的检测方法...

体内T细胞应答评估用荧光靶标阵列的应用 In vivo

本文介绍了一种利用成像流式细胞术在混合T细胞群体中检测同种反应性的方法。...

使用成像流式细胞术测量T细胞同种异体反应性

本文介绍了一种标准免疫学技术（CFSE标记的OT-I增殖）的应用，旨在快速监测佐剂介导的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在体内的生成。in...

快速 体内 评估佐剂在疫苗开发中诱导细胞毒性T淋巴细胞的能力

本方案详细描述了用于表达免疫调节剂的溶瘤病毒的生成及其体外表征的工作流程，以编码双特异性T细胞衔接器的麻疹病毒为例。该方法可应用于其他载体平台和转基因，从而加速新型免疫病毒治疗药物的临床转化开发。...

用于肿瘤靶向免疫调节的副粘病毒：体外设计与评估

本文介绍了一种基于流式细胞术的体内杀伤实验方法，可用于研究细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对模型肿瘤抗原应答中的免疫优势现象。我们提供了该精巧实验方法在机制研究和药物疗效评估中应用的示例。...

定制体内细胞毒性实验以研究肿瘤特异性CD8+ T细胞应答中的免疫显性

移植物抗宿主病是异基因骨髓移植后的主要并发症。树突状细胞在移植物抗宿主病的发病机制中起着关键作用。本文介绍了一种新型骨髓移植平台，用于研究树突状细胞在移植物抗宿主病发生以及移植物抗白血病效应中的作用。...

用于研究树突状细胞在移植物抗宿主病中作用的骨髓移植平台

该研究揭示了皮肤在通过表皮（EC）免疫调节小鼠免疫反应中的作用。使用蛋白质抗原进行表皮免疫可抑制接触性超敏反应中的免疫应答，或在与病原体相关分子模式联合使用时逆转皮肤诱导的免疫抑制。表皮免疫作为一种有效的无针免疫治疗策略，展现出良好的应用前景。...

经皮诱导免疫调节的小鼠模型

体外调节性T细胞功能分析：聚焦增殖与分化

学习移植免疫耐受诱导方案，通过体外和体内实验评估调节性T细胞、B细胞及髓细胞的抑制功能，利用大鼠心脏移植模型研究免疫调节机制并优化治疗策略。

体外与体内评估移植受者T细胞、B细胞及髓系细胞的抑制活性与体液免疫应答

探索更多视频

体外 与 体内 评估移植受者T细胞、B细胞及髓系细胞的抑制活性与体液免疫应答

探索更多视频

体外与体内评估移植受者T细胞、B细胞及髓系细胞的抑制活性与体液免疫应答