一种用于蛋白质和细胞图案化的多功能方法

本实验的总体目标是利用大多数生物实验室中常见的简易台面工具，将细胞或底物分布到复杂、细长且封闭的微通道中，从而实现细胞或底物的图案化。该方法有助于解答生物学领域中关于细胞间以及细胞与蛋白质间相互作用的关键问题。该技术的主要优势在于操作简便，且仅需大多数生物实验室中普遍配备的工具即可完成。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为该方法需要针对研究者所选用的细胞和底物优化孵育条件。该方法的可视化演示至关重要，因为PDMS印章和溶液的正确放置能显著提高实验的可重复性。首先，使用计算机辅助设计（CAD）绘图工具绘制微通道的布局图。

然后，将图纸打印到白纸上。接着，使用异丙醇清洁一张足够大的玻璃载片以容纳该设计，再用气枪将载片吹干。

将胶带贴附到清洁的玻璃载片上，注意不要夹入气泡。然后，将玻璃载片的四周用胶带固定在绘有设计图案的纸上，使胶带面朝上。使用手术刀以纸上的设计为参照，在玻璃载片的胶带上进行切割。

切割完成后，从玻璃载玻片不需要的区域撕下胶带。接着，用异丙醇冲洗玻璃载玻片，以去除任何残留的粘合剂。然后使用气枪吹干表面。

图案化并清洗后，将玻片置于65摄氏度的烘箱中烘烤30分钟。然后，用橡胶滚轮轻轻滚压胶带表面以去除气泡，并将玻片置于培养皿中冷却至室温。首先，将10份PDMS弹性体与1份固化剂混合，并充分搅拌该混合物。

然后，将混合物放入真空室中脱气，直至无气泡残留。将混合物倾倒至胶带模具上，形成一层厚度为2 mm的液层，并对模具进行脱气处理，直至所有气泡消失。冷却后，使用解剖刀在距离微结构至少5 mm处切割PDMS层。

然后，使用镊子将固化的PDMS从模具上剥离。使用1 mm的活检打孔器在微通道网络的末端打一个进样孔。接着，用胶带清洁PDMS铸件，以去除器件表面的灰尘颗粒。

用70%乙醇溶液冲洗PDMS微通道装置进行灭菌，随后用无菌去离子水冲洗，并在紫外光下照射30分钟。使用镊子将无菌的PDMS模具放置在无菌的玻璃盖玻片上，并用镊子尖端轻轻施加压力。接着，在微通道的入口处滴加一滴溶于四硼酸钠缓冲液中的多聚赖氨酸（poly d lysine）溶液。

将培养皿置于真空环境中10分钟。在此期间，观察通道中以气泡形式逸出的空气。释放真空，观察底物溶液流入微通道。将培养皿在37 °C下孵育1小时。

然后，使用无菌镊子小心剥离PDMS印章，并用去离子水清洗图案三次。加入1% BSA溶液至玻璃盖玻片上，以减少非特异性粘附，并将样品在37°C下孵育过夜。第二天，吸除BSA溶液。

开始细胞间接图案化时，按照随附的文字实验方案所述，用无血清培养基制备细胞悬液。将细胞悬液加入已图案化的培养皿中，完全浸没图案化区域。随后，将培养皿置于37°C培养箱中孵育15分钟，使细胞附着于图案化基底。

孵育结束后，吸除培养皿中多余的细胞悬液，并用 PBS 轻柔振荡洗涤图案化细胞三次，每次十秒，以去除未贴壁的细胞。随后向图案化细胞培养物中加入适量的培养基，并将细胞置于37°C、含二氧化碳缓冲的培养箱中孵育。对于细胞的直接图案化，首先使用70%乙醇溶液冲洗微流控装置进行灭菌，再用去离子水冲洗。

随后，将装置浸泡在1% BSA溶液中过夜，以防止细胞非特异性地黏附到PDMS表面。在室温下干燥装置，然后将其固定于经组织培养处理的培养皿底部。在入口处加入4至8微升细胞悬液，用量以完全填充微通道为宜，并完全覆盖孔洞。

然后，将培养皿放入真空室中抽真空10分钟。释放真空后，观察细胞悬液流入微通道。将培养皿置于二氧化碳缓冲培养箱中，在37摄氏度下孵育，最长孵育时间为1小时。

然后，将培养皿从培养箱中取出，使用镊子小心地将PDMS从培养皿上剥离。用PBS清洗图案，然后向培养皿中加入细胞培养基。操作完成后，将细胞放回培养箱中。

图中显示的是在聚-D-赖氨酸（PDL）和层粘连蛋白表面图案化培养的胚胎大鼠皮层神经元。细胞的位置表明其普遍附着于图案化区域，并沿PDL和层粘连蛋白条带生长。此处以更高放大倍数展示的是C2C12成肌细胞。

该细胞类型也能黏附于图案化区域，并融合形成多核的肌管。该技术还已被改进用于直接进行细胞图案化，此处以成纤维细胞为例展示。这种直接细胞图案化方法对细胞存活无任何不良影响。

完成此操作后，可进一步采用荧光显微镜等其他方法，以回答涉及蛋白质定位或细胞-基质相互作用的更多科学问题。在实施该操作时，需特别注意将细胞悬液或基质溶液液滴准确放置，使其完全覆盖嵌片表面，这是实验成功的关键。该技术建立后，为神经科学领域的研究人员探索视网膜生物学中感光细胞轴突导向机制开辟了道路。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用负压法结合透气性 PDMS 微流控装置对细胞和基底进行图案化。感谢观看，祝您的实验顺利成功。