Name: 图案蛋白质和细胞的通用的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学习使用低压真空技术将细胞和底物填充到微流控通道中的通用方法。该技术利用PDMS印章和简单实验工具，可在微通道中形成复杂的蛋白质和细胞图案，用于研究细胞间相互作用。

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本研究的经费由新泽西州脊髓研究委员会（NJCSCR）（资助FHK）、CSCR14IRG005基金（资助BLF）、美国国立卫生研究院（NIH）R15NS087501基金（资助CHC）以及F.M. Kirby基金会（资助ETA）提供。

注意：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。本实验方案中使用的某些化学品具有毒性且可能致癌。操作有毒或酸/碱性物质时，请务必采取所有适当的安全措施（如通风橱、手套箱）并穿戴个人防护装备（护目镜、手套、实验服、长裤、封闭式鞋履）。
1. 使用光刻技术制备软光刻用主模具
<ol>
	<li>使用计算机辅助设计（CAD）绘图工具绘制微通道的布局。</li>
	<li>使用激光掩模写入器将布局打印到空白掩模板上。</li>
	<li>用丙酮冲洗一片4英寸硅片，随后用异丙醇冲洗，并用氮气枪吹干，确保硅片表面无残留溶剂。</li>
	<li>将硅片置于加热板上，在200 °C下烘烤5分钟以进行脱水处理。</li>
	<li>选择适用于所需微通道高度的负性光刻胶。例如，使用负性光刻胶SU-8 50，以获得高度为50 µm的微通道。</li>
	<li>让硅片冷却至室温，然后将其对准并固定在匀胶机的卡盘上。</li>
	<li>将4 mL（每英寸硅片直径对应1 mL）负性光刻胶滴加至硅片中心。</li>
	<li>使用匀胶机进行两步旋转涂覆。首先，以100 rpm/s的加速度在500 rpm下旋转10秒进行铺展；然后，以300 rpm/s2的加速度在2,000 rpm下旋转30秒，以在硅片上形成厚度为50 µm的光刻胶涂层。</li>
	<li>根据制造商说明，在加热板上分两步对硅片进行前烘。对于50 µm厚的光刻胶涂层，先在65 °C下预烘6分钟，然后立即升温至95 °C，继续后烘20分钟。</li>
	<li>让硅片冷却至室温，然后将其装载到光刻机台上。</li>
	<li>使用掩模对准器将掩模与硅片对准，并按照制造商说明，以1.5 mW/cm2的强度照射紫外光146秒，使光刻胶层接受总计220 mJ/cm2的紫外剂量，适用于50 µm厚的光刻胶层。</li>
	<li>在加热板上分两步对硅片进行曝光后烘烤。对于50 µm厚的光刻胶涂层，先在65 °C下预烘1分钟，然后立即升温至95 °C，继续后烘5分钟。</li>
	<li>将硅片浸入SU-8显影液中，并轻轻摇动，直至硅片上的图形清晰可见。对于50 µm厚的光刻胶，显影时间约为6分钟。</li>
	<li>用异丙醇和乙醇冲洗掉多余的显影液，然后用氮气枪吹干硅片。</li>
	<li>将硅片置于加热板上，在150 °C下进行坚膜烘烤15分钟。</li>
	<li>将硅片放入干燥器中，并加入25 µL硅烷化试剂三氯(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)硅烷。 
	注意：该硅烷化试剂具有腐蚀性，必须在酸/碱通风橱中操作，并佩戴适当的个人防护装备（护目镜、手套、实验服、长裤、封闭式鞋）。</li>
	<li>抽真空5分钟，并在不释放真空的条件下使硅片暴露于硅烷蒸气中30分钟。</li>
	<li>将硅片转移至合适尺寸的培养皿中。</li>
</ol>
2. 使用胶带制备软光刻用主模具
<ol>
	<li>使用 CAD 绘图工具绘制微通道的布局，并将图纸打印在白纸上。</li>
	<li>用异丙醇清洁足够容纳设计图案的玻璃载片，然后用气枪吹干。</li>
	<li>将胶带粘附到已清洁的玻璃载片上，注意避免夹入气泡。</li>
	<li>将带有设计图案的纸张用胶带固定在玻璃载片四周，使胶带面朝上。</li>
	<li>以纸上的设计图为参考，使用手术刀切割玻璃载片上的胶带，然后撕去玻璃载片上不需要胶带的区域。</li>
	<li>用异丙醇冲洗玻璃载片，再用气枪吹干，随后将载片放入烘箱中，在 65 °C 下烘烤 30 分钟。</li>
	<li>用橡胶滚轮轻轻滚压胶带表面以去除气泡，并让载片冷却至室温。</li>
</ol>
3. PDMS 装置的软光刻制备
<ol>
	<li>按10:1（w:w）的比例混合PDMS弹性体与其固化剂，充分搅拌混合物，然后将混合物置于真空腔中脱气，直至混合物中无气泡出现。</li>
	<li>将混合物倒入培养皿中的硅烷化硅胶模具或胶带模具内，形成约2 mm厚的PDMS层，并继续脱气至所有气泡消失。</li>
	<li>在65 °C烘箱中固化PDMS 2小时。</li>
	<li>使用手术刀在微结构特征至少5 mm以外处切割PDMS层，然后用镊子将固化的PDMS从模具上剥离。</li>
	<li>在微通道任意位置使用1 mm活检打孔器打一个进样孔，优选位于微通道网络末端，如图2a和图4b所示。</li>
	<li>用胶带清洁PDMS复制件，以去除吸附在器件表面的灰尘颗粒。通过用70%乙醇溶液冲洗，随后用无菌去离子（DI）水冲洗，并暴露于紫外线下30分钟，对PDMS微通道器件（PDMS复制件）进行灭菌处理。</li>
	<li>将无菌PDMS器件保存在无菌培养皿中，待用。</li>
</ol>
4. 底物图案化
<ol>
	<li>使用镊子将无菌的PDMS模具放置在无菌的玻璃盖玻片或培养皿上，并用镊子尖端轻轻按压。 
	注意：PDMS模具与玻璃盖玻片或培养皿之间形成一种贴合但可逆的密封，从而构成微通道，无需使用任何粘合剂。</li>
	<li>在入口处滴加一滴（20 - 40 µL）基质溶液，完全覆盖入口孔。通过在微通道入口处加入20 µL溶于四硼酸钠缓冲液中的多聚-D-赖氨酸（PDL）溶液，实现PDL图案化。</li>
	<li>将培养皿置于约254 mmHgA的真空环境中（相当于生物实验室常用的真空压力）10分钟，并观察通道中有气泡逸出。</li>
	<li>释放真空，观察基质溶液流入微通道。</li>
	<li>在适当的条件下孵育培养皿，以促进基质附着。孵育条件见表1和表2（根据所用基质不同而有所差异）。对于PDL图案化，需在37 °C下孵育1小时。</li>
	<li>使用无菌镊子小心剥离PDMS印章，并用去离子水将玻璃盖玻片上的图案清洗三次。</li>
	<li>向培养皿中加入1%牛血清白蛋白（BSA）溶液，覆盖整个培养皿或玻璃盖玻片，并在37 °C下过夜孵育。 
	注意：此步骤可减少未包被区域的非特异性附着。</li>
	<li>吸除1% BSA溶液，此时图案化的基质已准备就绪，可供使用。</li>
</ol>
5. 细胞的间接图案化
<ol>
	<li>在无血清培养基中制备细胞悬液。细胞类型和细胞密度见表1。</li>
	<li>将细胞悬液加入图案化培养皿中，并完全浸没图案化区域。</li>
	<li>将培养皿置于37 °C培养箱中孵育15分钟，使细胞附着于图案化基底上。</li>
	<li>吸除培养皿中多余的细胞悬液，并用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻振荡洗涤图案化区域3次，每次10秒，以去除未贴壁的细胞。</li>
	<li>向图案化细胞培养物中加入适当的培养基，并在37 °C的CO2培养箱中继续孵育图案化细胞。</li>
</ol>
6. 细胞的直接图案化
注意：该技术是步骤5中所述间接细胞图案化方法的一种替代方案。然而，与步骤5不同的是，该技术可在有或无基底包被的组织培养表面进行细胞图案化。
<ol>
	<li>用70%乙醇溶液冲洗微流控装置，再用去离子水冲洗，以对其进行灭菌。</li>
	<li>将装置在1% BSA溶液中浸泡过夜，以防止细胞黏附到PDMS表面。</li>
	<li>在室温下干燥装置，并将其固定在经组织培养处理的培养皿底部。</li>
	<li>在无血清培养基中制备细胞悬液。细胞类型和细胞密度见表2。</li>
	<li>在入口处滴加4–8 µL细胞悬液（足以充满微通道），完全覆盖入口孔。</li>
	<li>将培养皿放入真空环境中10分钟，观察通道中有气泡逸出。随后释放真空，观察细胞悬液流入微通道。</li>
	<li>根据表2中所述的孵育条件（取决于所图案化的细胞类型），将培养皿置于孵育箱中以促进细胞黏附。向培养皿中加入PBS，使PDMS装置完全浸没。</li>
	<li>用镊子小心地将PDMS从培养皿上剥离，用PBS清洗图案区域。向培养皿中加入细胞培养基，并将细胞培养物放入孵育箱中继续培养。</li>
</ol>

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作者声明不存在竞争性财务利益。

尽管传统光刻技术是制备软光刻模具的一种成熟方法，但大多数实验室难以获得使用该技术所需的设备、材料和专业技能。对于无法获取这些资源的实验室，我们提出了一种利用胶带制作模具的方法，可用于制备具有相对简单结构的微流控装置。该方法使任何实验室均可利用 readily available 的工具自行制作并使用微流控装置开展科研工作。通过低成本的台式乙烯基切割机，胶带制作法可得到进一步改进31。台式切割机可提高制作的重复性、分辨率以及图案复杂度。传统光刻、台式切割机和胶带制作这几种方法各有其能力与局限性，研究人员必须仔细评估哪种方法能够满足自身需求。
在固化的PDMS中，二甲基硅氧烷的长聚合物链形成一种具有纳米孔结构的晶格，从而产生可被空气分子填充的空腔区域27。这种透气特性对我们的微流控通道填充方法至关重要。当将其置于低压环境中时，PDMS本体材料以及微通道内部的空气分子会被去除25。随后当PDMS暴露于大气压下时，PDMS本体材料和微通道会在一段时...

在组织工程和生物传感领域，能够控制蛋白质和细胞在二维及三维空间中的排列方式对于模拟生理微环境、调控细胞行为以及构建功能性生物结构至关重要。 &#181;微米尺度在过去的四十年中变得愈发重要1,2,3蛋白质和细胞的精确空间排列使研究人员能够研究细胞与含有相同或不同类型细胞的基底之间的相互作用，引导细胞生长，并固定生物分子以构建生物传感器。4,5,6,7,8,9.
目前用于蛋白图案化的技术包括光图案化和微接触印刷。光图案化利用对光敏感的材料，在暴露于紫外光（UV）时发生交联。将紫外光照射到光掩模（由透光区域和阻挡紫外光透过的暗区组成）上，可在特定区域引发交联，从而用于后续固定生物材料或细胞10,11。尽管该方法精度高，可精确控制培养表面的拓扑结构，但其应用仅限于可通过紫外辐射进行图案化的UV敏感型生物分子12。微接触印刷是另一种广泛使用的特定蛋白图案化方法13,14。在该方法中，先将聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章用多种表面修饰试剂处理，然后浸入选定的生物分子基质溶液中，再轻轻按压到玻璃盖玻片或其他表面上，从而将生物分子“印刷”到培养表面。然而，该方法受限于可转移材料的类型以及生物分子在PDMS印章表面的润湿性15。
直接对细胞进行图案化可能更为困难，通常依赖于复杂的方法，例如可切换的基底、基于掩模的方法，或利用特定细胞黏附分子进行图案化16,17。这些方法在细胞图案化方面存在局限性，原因包括缺乏兼容的细胞黏附基底、操作过程难以适用于敏感的生物细胞、图案重复性差以及操作步骤复杂。例如，在使用可切换基底时，需要为每种细胞类型专门设计定制的基底，以使其能够在不因暴露于工艺中所用的紫外光和热而降解的前提下，切换对特定细胞类型的黏附性17,18,19,20。基于掩模的图案化方法在细胞图案化方面具有较高的灵活性；然而，制造适用于特定厚度要求的聚二甲基硅氧烷（PDMS）掩模仍存在困难16,21。将细胞直接注入PDMS微流控通道具有一些优势，例如：1）微流控通道易于制备；2）适用于多种不同类型的细胞和基底。然而，由于PDMS具有疏水性，在未使用等离子体清洗或其他减少气泡的方法时，注射过程中容易捕获气泡，导致在玻璃或塑料表面稳定地形成图案化细胞变得困难21。
本研究在毛细管微模塑技术22,23,24,25,26的基础上进一步拓展，报道了一种将蛋白质和细胞悬液注入微通道的方法。该方法实现了基底的图案化，以及特定细胞类型的直接和间接图案化。该技术利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）的透气性，克服了PDMS高疏水性的问题，并在基底或细胞注入过程中有效消除气泡的产生27。本文展示了该技术在多种不同基底和细胞类型中的应用。文章还重点介绍了使用传统光刻法以及一种简单、低成本的胶带法制作软光刻模具的过程，后者在资源有限的条件下尤为适用28,29。

<table><tbody><tr><td>CorelDRAW X4 CAD 绘图工具</td><td>Corel Corporation, Canada</td><td>X4 版本 14.0.0.701</td><td>用于绘制微流控装置布局的 CAD 工具</td></tr><tr><td>HP 激光打印机</td><td>Hewlett Packard, CA</td><td>1739629</td><td>用于打印微流控装置布局，以用于胶带粘附技术</td></tr><tr><td>Bel-Art 干燥器</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>08-594-16B</td><td>用于对 PDMS 混合物进行脱气处理</td></tr><tr><td>Scotch 胶带（压敏胶带）</td><td>3M 产品, MN</td><td>Tape 600</td><td>用于制作胶带母模</td></tr><tr><td>PDMS Sylgard 184</td><td>Dow Corning, MI</td><td>1064291</td><td>浇铸用聚合物</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>08-772-23</td><td>用于盛放用于 PDMS 浇铸的模具</td></tr><tr><td>不锈钢手术刀（#3 手柄）配刀片（#11）</td><td>Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan</td><td>2976#11</td><td>用于切割 PDMS</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Ted Pella, CA</td><td>5627-07</td><td>用于在剥离过程中操作 PDMS 铸件</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>12-546-2</td><td>用作图案化基底的表面</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>12-544-4</td><td>用作图案化基底的表面</td></tr><tr><td>橡胶滚轮</td><td>Dick Blick 美术材料公司, IL</td><td>40104-1004</td><td>用于将胶带贴附在玻璃上而不夹入气泡</td></tr><tr><td>激光掩模写入仪</td><td>Heidelberg Instruments, Germany</td><td>DWL66fs</td><td>用于制造光刻工艺中使用的石英掩模</td></tr><tr><td>EVG 掩模对准器（光刻紫外曝光工具）</td><td>EV Group, Germany</td><td>EVG 620T(B)</td><td>用于将光刻胶暴露于紫外光下</td></tr><tr><td>Headway 旋涂机</td><td>Headway Research Inc, TX</td><td>PWM32-PS-CB15PL</td><td>用于在硅片上旋涂光刻胶</td></tr><tr><td>光刻胶 SU-8 50</td><td>MicroChem, MA</td><td>Y131269</td><td>用于模具制造的负性光刻胶</td></tr><tr><td>SU-8 显影液</td><td>MicroChem, MA</td><td>Y020100</td><td>光刻胶显影剂</td></tr><tr><td>十三氟-1,1,2,2-四氢辛基-1-三氯硅烷</td><td>UCT Specialties, PA</td><td>T2492-KG</td><td>用于模具表面涂层，防止 PDMS 粘附</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>190764</td><td>清洗溶剂</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>24102</td><td>灭菌溶剂</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（PDL）</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>P0899-10MG</td><td>PDL 溶液用四硼酸钠缓冲液配制成 0.1 mg/mL</td></tr><tr><td>层粘连蛋白（Laminin）</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>L2020</td><td>层粘连蛋白分装为 10 &amp;micro;L 等份，并在使用前用 PBS 稀释至 20 &amp;micro;g/&amp;micro;L</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>BP1605100</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>C2C12 成肌细胞系</td><td>ATCC, VA</td><td>CRL-1722</td><td>用于展示 C2C12 的图案化能力</td></tr><tr><td>PC12 细胞系</td><td>ATCC, VA</td><td>CRL-1721</td><td>用于展示 PC12 的图案化能力</td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源</td><td>BD Biosciences</td><td>40236</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, MA</td><td>11965-084</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>马血清，热灭活</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>26050-070</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>鬼笔环肽-四甲基罗丹明异硫氰酸酯（TRITC）</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>P1951</td><td>用于细胞标记</td></tr><tr><td>Calcein-AM 活死细胞检测试剂盒</td><td>Invitrogen, MA</td><td>L-3224</td><td>细胞活力检测</td></tr><tr><td>活检打孔器</td><td>Ted Pella, CA</td><td>15110-10</td><td>在 PDMS 上打孔</td></tr></tbody></table>

一种用于蛋白质和细胞图案化的多功能方法

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

底物和细胞图案化技术在细胞生物学中被广泛用于研究细胞间以及细胞与底物间的相互作用。传统的图案化技术仅适用于简单形状、小面积区域以及特定的生物材料。本文介绍一种利用负压将细胞悬液和底物溶液导入复杂、细长且封闭（盲端）的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道的方法。该方法使研究人员能够对多种底物进行图案化，包括纤连蛋白、胶原蛋白、抗体（Sal-1）、聚-D-赖氨酸（PDL）和层粘连蛋白。通过对底物进行图案化，可间接实现多种细胞的图案化。我们已测试了C2C12成肌细胞、PC12神经细胞系、胚胎大鼠皮层神经元以及两栖动物视网膜神经元。此外，我们还证明，通过在细胞悬液上短暂施加低真空，该技术可直接在微流控通道内实现成纤维细胞的图案化。细胞活力检测结果表明，低真空处理不会显著降低细胞活力。本文还讨论了该方法针对不同类型细胞和底物的应用改进方案。该技术使研究人员能够在无需特殊材料或设备的情况下，在任意配备真空系统的实验室中实现细胞和蛋白质的特定图案化。

该方法利用尺寸小至10 µm的封闭式微流控通道，可在母模制备完成后，使用几乎所有生物实验室常见的设备实现蛋白质的图案化以及细胞的间接图案化。此技术可与采用传统软光刻工艺制备的PDMS微流控通道联用，也可与采用胶带成型法（adhesive tape fabrication）制备的PDMS微流控通道联用（图1）28,29。我们此前已证明该方法可用于光感受器轴突导向研究中的神经元细胞间接图案化4,30，目前进一步验证了其在多种不同来源细胞类型中的应用。在聚-D-赖氨酸（PDL）和层粘连蛋白（laminin）表面图案化的胚胎大鼠皮层神经元表现出对图案区域的良好黏附性，并沿PDL和层粘连蛋白条带生长（图3A）。C2C12成肌细胞系同样黏附于图案化区域，并融合形成多核肌管（<stron...

本报告介绍了一种简单且易于操作的技术，利用低压真空将细胞和底物填充至微流控通道中，用于生物学研究。

底物和细胞图案化技术在细胞生物学中被广泛用于研究细胞间以及细胞与底物间的相互作用。传统的图案化……

本实验的总体目标是利用大多数生物实验室中常见的简易台面工具，将细胞或底物分布到复杂、细长且封闭的微通道中，从而实现细胞或底物的图案化。该方法有助于解答生物学领域中有关细胞间以及细胞与蛋白质间相互作用的关键问题。该技术的主要优势在于操作简便，且仅需大多数生物实验室中普遍配备的常规设备。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为该方法需要针对研究者所选用的细胞和底物优化孵育条件。此方法的可视化演示至关重要，因为 PDMS 印模和溶液的正确放置能显著提高实验的可重复性。首先使用 CAD 绘图工具绘制出微通道的布局图。然后，将图纸打印到白纸上。接着，使用异丙醇清洁一张足够容纳设计图案的玻璃载玻片，再用气枪将载玻片吹干。将粘性胶带贴在清洁的玻璃载片上，注意避免产生气泡。然后，将玻璃载片的四周用胶带固定在印有设计图案的纸张上，使胶带面朝上。使用手术刀以纸上的设计为参照，切割玻璃载片上的胶带。切割完成后，从玻璃片不需要的区域撕下胶带。接着，用异丙醇冲洗玻璃片，以去除任何残留的粘合剂。然后使用气枪吹干表面。图案化并清洗后，将玻片置于65 °C的烘箱中烘烤30分钟。然后用橡胶滚轮在表面轻轻滚压胶带，以去除气泡，并将玻片置于培养皿中冷却至室温。首先，按10份PDMS弹性体与1份固化剂的比例混合，并充分搅拌。然后，将混合物放入真空室中脱气，直至无气泡残留。将混合物倾倒至胶带模具上，形成一层约2 mm厚的液层，并对模具进行脱气处理，直至所有气泡消失。待冷却后，使用手术刀在距离微结构特征至少5 mm处切割PDMS层。然后，使用镊子将固化的PDMS从模具上剥离。用1 mm的活检打孔器在微通道网络的末端打一个进样孔。接着，用胶带清洁PDMS铸件，以去除器件表面的灰尘颗粒。用70%乙醇溶液冲洗PDMS微通道装置进行灭菌，随后用无菌去离子水冲洗，并在紫外线下照射30分钟。用镊子将无菌的PDMS模具放置在无菌的玻璃盖玻片上，并用镊子尖端轻轻施加压力。接着，在微通道的入口处滴加一滴溶于四硼酸钠缓冲液中的多聚赖氨酸（poly d lysine）溶液。将培养皿置于真空环境中10分钟。在此期间，观察通道中以气泡形式排出的空气。解除真空后，观察底物溶液流入微通道。将培养皿在37摄氏度下孵育1小时。然后，使用无菌镊子小心剥离PDMS印章，并用去离子水洗涤图案三次。加入1% BSA溶液至玻璃盖玻片上，以减少非特异性粘附，并在37摄氏度下孵育样品过夜。次日，吸除BSA溶液。为开始细胞的间接图案化，按照随附的文字方案所述，用无血清培养基制备细胞悬液。将细胞悬液加入已图案化的培养皿中，完全浸没细胞悬液中的图案化区域。随后，将培养皿置于37°C培养箱中孵育15分钟，使细胞附着于图案化基底上。孵育后，从培养皿中吸除多余的细胞悬液，并用 PBS 轻轻振荡洗涤图案化细胞三次，每次十秒，以去除未贴壁的细胞。随后，向图案化细胞培养物中加入适量的培养基，并将细胞在 37 摄氏度、含二氧化碳缓冲的培养箱中继续孵育。对于细胞的直接图案化，首先用 70% 乙醇溶液冲洗微流控装置进行灭菌，再用去离子水冲洗。随后，将装置浸泡在1% BSA溶液中过夜，以防止细胞非特异性黏附至PDMS表面。室温下干燥装置，然后将其固定于经组织培养处理的培养皿底部。在入口处加入4至8微升细胞悬液，用量足以充满微通道，并完全覆盖孔洞。然后，将培养皿放入真空室中抽真空10分钟。释放真空后，观察细胞悬液流入微通道。将培养皿置于37摄氏度、含二氧化碳缓冲环境的培养箱中孵育，最长孵育时间为1小时。然后，将培养皿从培养箱中取出，用镊子小心地将PDMS从培养皿上剥离。用PBS洗涤图案，随后向培养皿中加入细胞培养基。操作完成后，将细胞重新放回培养箱中。此处展示的是在聚-D-赖氨酸（PDL）和层粘连蛋白表面图案化培养的胚胎大鼠皮层神经元。细胞的位置表明其普遍附着于图案化区域，并沿PDL和层粘连蛋白条带生长。此处以更高倍数展示的是C2C12成肌细胞。该细胞类型也能黏附于图案化区域，并融合形成多核的肌管。该技术还已被改进用于细胞的直接图案化，此处以成纤维细胞为例展示。这种直接细胞图案化方法对细胞存活无任何不良影响。完成此操作后，可进一步开展荧光显微镜等其他方法，以回答涉及蛋白质定位或细胞-基质相互作用的其他科学问题。在实施该操作时，需注意将细胞或基质溶液的液滴准确放置，使其完全覆盖整个嵌片，这是实验成功的关键。该技术建立后，为神经科学领域的研究人员探索视网膜生物学中感光神经元轴突导向机制开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用负压法结合透气性PDMS微流控装置对细胞和基底进行图案化。感谢观看，祝您的实验顺利。

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科研

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Bioengineering

生物工程

图案蛋白质和细胞的通用的方法

我们展示了一种将细胞放置在基底特定位置的简单方法。该方法通过将含有填充细胞的微孔的硅胶芯片翻转至基底上来实现细胞图案化。该方法为调控细胞间的可扩散信号和邻近细胞信号提供了一种新途径。...

利用生物翻转芯片对胚胎干细胞进行图案化

微接触印刷技术被广泛用于在材料表面图案化蛋白质及其他分子。我们演示了该过程的基本步骤，即将纤连蛋白图案印制到玻璃表面。...

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利用水相双相系统同时对多种细胞群体进行图案化。这种快速且简便的细胞图案化方法利用了葡聚糖和聚乙二醇水溶液之间的相分离特性以及两种聚合物溶液之间的界面张力。...

使用水相两相系统进行细胞共培养图案化

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在光刻定义的聚对二甲苯-C：SiO 上进行细胞图案化2 底物

本方法中，我们采用光聚合与点击化学技术，在聚乙二醇（PEG）水凝胶表面构建蛋白质或多肽图案，以提供固定的生物活性信号，用于研究细胞响应 体外.

利用光化学方法在水凝胶上图案化生物活性蛋白质或多肽以用于生物应用

本文介绍的方法结合微图形化技术与定量成像，以揭示哺乳动物细胞培养物中的空间组织结构。该技术易于在标准的细胞生物学实验室中建立，为体外研究模式形成提供了一个可操作的实验系统。...

利用微图形技术和定量成像技术绘制哺乳动物细胞的自组织空间结构

我们的总体目标是理解细胞如何感知引导轴突定向生长的胞外信号。在此，我们描述了一种光诱导蛋白质吸附技术，该方法可用于生成特定的细胞外基质成分微图案，以研究调控轴突发育和路径选择的具体事件。...

利用PRIMO微图案系统研究细胞对细胞外基质蛋白响应的光诱导蛋白质分子吸附

本文介绍一种利用DNA编程黏附技术在单细胞分辨率下对细胞进行微图案化的实验方案。该方案采用台式光刻平台在玻璃载片上构建DNA寡核苷酸的图案，随后使用 commercially available...

使用DNA进行细胞简单、经济且模块化图案化的技术

本文介绍的实验方案可实现微图案的自动化制备，从而标准化哺乳动物细胞的细胞形态，用于研究细胞内的细胞骨架结构。该技术操作简便，可使用市售的成像系统进行搭建，无需标准细胞生物学实验室难以获得的专用设备。...

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我们介绍了一种对标准细胞牵引力测量方法的改进，该方法基于微接触印刷技术，通过在软性水凝胶上对细胞外基质蛋白点阵进行单步减法图案化，实现更简单且更一致的微岛图案制备，这对于控制细胞簇形态至关重要。...

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