通过共聚焦显微镜检测配体激活的G蛋白偶联受体的内化

本实验的总体目标是提供一种高效且易于解读的方法，用于检测哺乳动物细胞中表达的G蛋白偶联受体（GPCR）融合蛋白的亚细胞定位及内化情况。该方法有助于回答亚细胞蛋白定位研究领域中的关键问题，例如受体的内化与再循环。该技术的主要优势在于其操作简便且效率高。

因此，该方法可用于监测和定位G蛋白偶联受体（GPCRs），并可推广至其他系统，如胞质蛋白和核蛋白。根据文本方案复苏并传代HEK293细胞后，当细胞生长接近汇合时，弃去预温的培养基，加入2毫升磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻晃动培养皿以洗涤细胞。

弃去 PBS，加入 1 毫升胰蛋白酶 EDTA。为完全消化细胞，轻轻晃动培养皿后吸除溶液。随后，将培养皿置于 37 摄氏度水套式 CO2 培养箱中孵育 3 分钟。

在细胞孵育的同时，向六孔板的每个孔中加入2毫升平衡过的生长培养基，进行准备工作。当细胞从培养皿底部脱落时，向培养皿中加入1毫升平衡过的生长培养基。用移液器吹打混匀，并立即向已准备好的六孔板的每孔中转移0.1毫升细胞悬液。

轻轻吹打各孔中的悬液，并将细胞在37摄氏度和5% CO2条件下孵育。次日，确保细胞融合度达到85-95%。然后，向两个无菌的微量离心管中，向其中一个加入3微克质粒DNA和100微升低血清培养基。

同时，向另一支试管中加入9微升试剂一和100微升低血清培养基。将试管在室温下孵育5分钟。将稀释的质粒混合物与稀释的试剂一混合。

然后轻轻混匀溶液，在室温下孵育20分钟。吸除细胞培养基，每孔加入1.5毫升不含FBS的新鲜DMEM。随后将215微升DNA转染试剂混合物逐滴加入各孔中，并通过轻轻摇动培养板进行混匀。

将培养板置于37摄氏度、5%CO2条件下孵育4至8小时。随后，更换为含10%FBS的新鲜DMEM培养基。在进行任何实验前，继续孵育细胞24至48小时。

不同细胞系中的转染效率可能存在显著差异。因此，根据所使用的特定细胞类型，可能需要对基因沉默与稳定转染的条件进行优化。从六孔培养板中移除生长培养基。

然后，用1毫升PBS洗涤细胞单层。加入0.5毫升胰蛋白酶EDTA，轻轻晃动培养皿，吸除溶液。随后，将培养板在37°C条件下孵育3分钟。

孵育期间，将直径为15毫米的无菌盖玻片插入12孔板的每个孔中。用少量新鲜的完全培养基重悬细胞，并将所需数量的细胞转移至含有盖玻片的12孔板中。然后，将细胞孵育16至24小时。

孵育16至24小时后，当细胞生长接近汇合时，向每孔加入5 µM的膜探针dill，并将细胞放回孵育箱中孵育30分钟。移除平衡后的培养基，用冷的PBS洗涤细胞两次。然后，向每孔加入1 mL的4% PFA，在摇床上振荡15分钟以固定细胞。

用 PBS 洗涤固定后的细胞两次，然后向每个孔中加入 200 至 300 微升 DAPI，于室温孵育 10 分钟。再次用 PBS 洗涤细胞两次后，小心从板中取出盖玻片，并吸去多余的缓冲液。将盖玻片倒置在已滴加一滴封片剂的显微镜载玻片上。

然后，从载玻片上除去多余的封片介质。使用已生长至接近汇合的细胞，移除已平衡的生长培养基，并加入新鲜预热的DMEM。将细胞孵育1小时。

用不同浓度的配体处理细胞30分钟。并用10的负6次方摩尔浓度的配体处理细胞，处理时间如图中所示。用预冷的PBS洗涤细胞两次，然后每孔加入1毫升含4% PFA的PBS溶液，轻轻振荡细胞15分钟。

用 PBS 清洗细胞两次后，小心地将盖玻片从培养板的孔中取出，并按照本视频前面已演示的方法进行封片。进行共聚焦显微镜观察时，打开共聚焦显微镜的硬件设备，包括汞灯电源、计算机显微镜系统、扫描仪和激光器。启动软件，然后检查配置并选择相应的激光器。

根据说明书打开共聚焦显微镜系统的各个组件。将制备好的玻片放置在显微镜载物台上，使用载物台控制器将样品移至物镜下方。若使用油镜，需在盖玻片上滴加一滴雪松油，并将带有盖玻片的一面朝向物镜方向放置玻片。

在荧光下找到目标细胞，然后切换至扫描模式，选择发射荧光染料的激光功率和光谱范围。通过调节激光强度及其他参数获取高质量图像。该图展示了 pEGFP-N1 在 HEK293 细胞中的表达情况。

在细胞质和细胞核中均检测到GFP信号。此处展示了日本血吸虫促性腺激素释放激素受体（S-Japonica或SjGnRHR）在HEK293细胞中的亚细胞定位。EGFP标记的受体呈绿色，DiI染色用于显示细胞膜，呈红色。

受体可见定位于细胞膜。为观察SjGnRHRs的内化过程，细胞经不同浓度的促性腺激素释放激素处理。如图所示，受体的内化呈剂量依赖性，当配体浓度为10⁻⁶ M时，受体完全从细胞表面内化至胞内。

当用10⁻⁶ M配体处理不同时间后，激动剂刺激10分钟后即可检测到内化的SjGnRHRs，60分钟时出现显著的内化。如在HEK293细胞中的实验所示，在两次实验中，荧光标记的SjGnRHR-EGFP融合蛋白主要定位于细胞膜，并迅速且显著地内化进入细胞。在进行该操作时，重要的是要始终确保细胞处于无细菌、真菌和支原体污染的适宜条件下。

通过此操作步骤，还可进行细胞检测和固定等方法，以回答其他问题，例如蛋白质受体在第二次通过V区时的情况。随着每一项技术的发展，该方法为细胞生物学和生物化学领域的研究人员探索跨膜受体在不同细胞系中的定位与内化提供了途径。