Name: 配体激活的G蛋白偶联受体内在化的检测通过共聚焦显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学习使用共聚焦显微镜检测哺乳动物细胞中G蛋白偶联受体的内在化过程。该方法利用HEK293细胞系和荧光标记技术，可清晰观察受体的亚细胞定位与动态变化，为研究受体信号转导和循环机制提供可靠工具。

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本文作者感谢谢佳燕教授在技术协助和设备使用方面提供的支持。本研究由国家自然科学基金（41406137）提供经费支持。

1. 细胞制备
<ol>
	<li>细胞复苏
	<ol>
		<li>将冻存的人胚胎肾293（HEK293）细胞从液氮罐中取出，迅速放入37 °C水浴中，持续振荡1 - 2分钟。</li>
		<li>向一个10 cm细胞培养皿中加入10 mL预平衡的生长培养基（DMEM培养基，含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液），轻柔地将解冻后的细胞加入该培养基中。</li>
		<li>将细胞置于37 °C、水套式CO2培养箱中孵育，环境为含95%空气和5% CO2的湿润气氛，孵育时间为2 - 4小时。</li>
		<li>2 - 4小时后，检查细胞是否已贴壁。更换预平衡的生长培养基，并继续培养24 - 48小时。 
		注意：更换培养基有助于去除二甲基亚砜（DMSO），从而保护细胞免受损伤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞传代
	<ol>
		<li>培养24 - 48小时后，当细胞生长接近融合状态时，弃去原有培养基，用2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞，轻轻晃动培养皿。</li>
		<li>弃去PBS，加入1 mL胰蛋白酶-EDTA溶液（生理盐水配制，含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA）。为充分消化细胞，轻轻晃动培养皿后吸除胰蛋白酶-EDTA溶液，将培养皿放入37 °C水套式CO2培养箱中孵育3分钟。 
		注意：在此期间，准备三个新的10 cm细胞培养皿，每个皿中加入10 mL预平衡的生长培养基。</li>
		<li>在光学显微镜下观察细胞是否已从皿底脱落。向培养皿中加入2 mL预平衡的生长培养基，用移液器吹打混匀，立即吸取0.6 mL细胞悬液分别接种至三个新培养皿中。再次轻柔吹打混匀，将细胞置于37 °C、5% CO2条件下继续孵育。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞接种
<ol>
	<li>24 - 48 小时后，当传代细胞生长至接近汇合时，弃去预温的生长培养基，并用 2 mL PBS 洗涤细胞。轻轻晃动培养皿。</li>
	<li>弃去 PBS，加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液。为完全消化细胞，小心晃动培养皿，吸除胰蛋白酶-EDTA 溶液，然后将培养皿放入 37 °C、带水套的 CO2 培养箱中孵育 3 分钟。 
	注意：在此期间，向 6 孔板的每个孔中加入 2 mL 预温的生长培养基，以完成准备工作。</li>
	<li>在显微镜下观察，若发现细胞已从培养皿底部脱落，向培养皿中加入 1 mL 预温的生长培养基。用移液器吹打混匀，立即吸取 0.1 mL 细胞悬液（根据细胞生长密度调整体积）加入已准备好的 6 孔板的每孔中（即含 2 mL 预温生长培养基的无细胞 6 孔板）。轻轻吹打混匀，将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下培养。</li>
</ol>
3. 细胞转染
<ol>
	<li>转染方法1：使用脂质体试剂 
	注意：请参见材料表中的转染试剂1。
	<ol>
		<li>次日，确保细胞融合度达到85 - 95%。</li>
		<li>取3 µg质粒DNA（500 ng/µL）和100 µL低血清培养基加入无菌微量离心管中，轻轻混匀。室温孵育5分钟。</li>
		<li>在另一无菌微量离心管中加入9 µL试剂1和100 µL低血清培养基，轻轻混匀。室温孵育5分钟。</li>
		<li>将稀释后的质粒混合物与稀释后的试剂1混合（总体积 = 215 µL）。轻轻混匀，室温孵育20分钟。</li>
		<li>吸除细胞培养板中的培养基，每孔加入1.5 mL不含FBS的新鲜DMEM培养基。</li>
		<li>将215 µL DNA-转染试剂混合物逐滴加入每孔中，并通过轻轻摇晃培养板混匀。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2条件下孵育4 - 8小时，然后更换为含10% FBS的新鲜DMEM培养基。</li>
		<li>在进行任何实验前，继续在37 °C、5% CO2条件下孵育细胞24 - 48小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转染方法2：使用脂质体试剂 
	注意：请参见材料表中的转染试剂2。
	<ol>
		<li>在无菌微量离心管中加入2 µg质粒DNA（500 ng/µL）、4 µL试剂2和100 µL低血清培养基。轻轻混匀，室温孵育15分钟。</li>
		<li>将转染混合物逐滴加入细胞中。</li>
		<li>转染后，在37 °C、5% CO2条件下孵育细胞24 - 48小时，再进行后续实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 载玻片上的细胞培养
<ol>
	<li>从培养用6孔板中移除生长培养基。</li>
	<li>用1 mL不含钙和镁的PBS洗涤细胞单层。</li>
	<li>加入0.5 mL胰蛋白酶-EDTA。轻轻晃动培养皿后吸除胰蛋白酶-EDTA。将培养板在37 °C和5% CO2条件下孵育3分钟。实际孵育时间因所用细胞系而异。&#160; 
	注意：在此期间，准备一个新的12孔板，并在每个孔中放入直径为15 mm的无菌盖玻片。对于容易脱落的HEK293细胞，使用经赖氨酸、层粘连蛋白或胶原蛋白包被的盖玻片可改善细胞贴附。</li>
	<li>当细胞脱落后，向每孔加入1 mL预热的完全生长培养基。通过移液混匀后，立即转移&#160;所需数量的细胞至含盖玻片的12孔板中。向每个&#160;孔中添加新鲜的完全生长培养基，调整总体积至1 mL。</li>
	<li>将细胞在37 °C和5% CO2条件下孵育16–24小时。 
	注意：30–60分钟后，大部分细胞将已贴附于无菌盖玻片上。</li>
</ol>
5. 共聚焦显微镜检测
<ol>
	<li>细胞定位
	<ol>
		<li>培养16 - 24小时后，当细胞在12孔板中的无菌盖玻片上生长至接近汇合时，向每孔加入膜探针DiI，使其终浓度为5 µM。在37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟。</li>
		<li>30分钟后，移除预温的培养基，并用冷PBS（2 - 8 °C）洗涤细胞两次。</li>
		<li>向每孔加入1 mL 4%多聚甲醛溶液（溶于PBS中）固定细胞，轻轻振荡15分钟。 
		注意：多聚甲醛经皮肤接触或吸入具有中等毒性，被列为可能的人类致癌物。称量和操作多聚甲醛时应使用化学通风橱、带通风的天平罩或其他防护措施。</li>
		<li>用PBS洗涤固定后的细胞两次。向每孔加入200–300 µL DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）溶液（0.5 µg/mL），室温孵育10分钟。</li>
		<li>用PBS洗涤细胞两次。小心从孔板中取出盖玻片，吸去多余的PBS。将其倒置在已滴加一滴封片剂（50% v/v甘油/水）的载玻片上。去除载玻片上多余的封片剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞内化
	<ol>
		<li>培养16 - 24小时后，当细胞在12孔板中的无菌盖玻片上生长至接近汇合时，移除预温的培养基，并加入新鲜预温的DMEM培养基（37 °C）。在37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。</li>
		<li>用不同浓度（0、10-12、10-9 和 10-6 M）的配体处理细胞30分钟，并用10-6 M配体处理不同时间（0、10、30 和 60分钟）。</li>
		<li>用冷PBS（2 - 8 °C）洗涤细胞两次。向每孔加入1 mL 4%多聚甲醛溶液（溶于PBS中）固定细胞，轻轻振荡15分钟。</li>
		<li>用PBS洗涤细胞两次。小心从孔板中取出盖玻片，吸去多余的PBS。将其倒置在已滴加一滴封片剂（50% v/v甘油/水）的载玻片上。去除载玻片上多余的封片剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>共聚焦显微镜观察
	<ol>
		<li>开启共聚焦显微镜的硬件设备，包括汞灯电源、计算机、扫描仪和激光器。登录操作系统账户，启动软件，检查配置并选择激光器。按照说明书顺序依次开启共聚焦显微系统的各个单元。</li>
		<li>将制备好的载玻片放置于显微镜载物台上。使用载物台控制器将样品移至物镜下方。当使用油镜时，在盖玻片上滴加一滴杉木油。放置盖玻片时应使其面向物镜。</li>
		<li>在荧光显微镜下找到目标细胞。</li>
		<li>切换至扫描模式。选择激光功率及发射荧光染料的光谱范围。通过调节激光强度及其他参数，获取高质量的共聚焦图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+activation+of+the+G+protein-coupled+receptor+BNGR-A21+by+the+neuropeptide+corazonin+from+the+silkworm%2C+Bombyx+mori%2C+dually+couples+to+the+G%28q%29+and+G%28s%29+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades.</a> J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).</li>
<li>Lu, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+Characterization%2C+and+Expression+Profile+of+Estrogen+Receptor+in+Common+Chinese+Cuttlefish%2C+Sepiella+japonica%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool+A+Ecol+Genet+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica.</a> J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文介绍的实验方案提供了一种高效且易于解读的方法，用于检测在HEK293细胞中表达的G蛋白偶联受体融合蛋白的亚细胞定位和内化情况。该技术可轻松适用于多种不同的基因和细胞类型，例如可用于研究家蚕（Bombyx mori）冠心素受体在HEK293细胞和BmN细胞中的细胞定位与内化过程16。
该强大检测方法的成功应用依赖于几个关键因素。首要的是细胞的良好状态，这对于实现高效的转染和保证数据质量至关重要。转染孵育时间、转染与其他实验之间的间隔，以及在成像前将转染后的细胞传代至盖玻片上等步骤，均可能对培养的细胞造成损伤。因此，维持细胞的良好状态是本实验所有步骤的重要前提。此外，为获得高质量的共聚焦显微镜图像，必须避免细胞密度过高导致的细胞过度挤压。为了尽量减少荧光标签对G蛋白偶联受体（GPCR）定位的影响，我们构建了将EGFP融合至受体胞内C末端的表达载体。将目标基因成功且高效地转染入细胞同样至关重要。不同细胞系之间的转染效率可能存在显著差异。因此，可能需要根据所使用的特定细胞类型对实验方案中的某些步骤进行优化。例如，在转染方...

细胞具有货物运输机制，可将胞外物质（如配体、微生物、营养物质和跨膜蛋白）转运至细胞内，以获取信息、能量及其他用途1,2。这一过程对于细胞稳态、组织功能以及细胞整体存活至关重要。利用细胞表达荧光融合蛋白是研究跨膜受体（如G蛋白偶联受体，GPCR）在信号通路中的定位与内化过程的一种有力方法3。
利用来自维多利亚多管发光水母（Aequorea victoria）的绿色荧光蛋白（GFP）标记融合蛋白，并结合直接荧光检测技术，已在蛋白质靶向研究中得到广泛应用4,5,6。基于GFP的检测方法具有可在活细胞中实时成像的优势，同时避免了固定所导致的人工假象7。目前已构建一系列多功能克隆载体，以促进在多种细胞中表达与GFP融合的蛋白质8,9。pEGFP-N1载体是一种广泛应用且已商业化的质粒载体，编码经优化的增强型绿色荧光蛋白（EGFP），其相较于野生型GFP在哺乳动物细胞中具有更强的荧光信号和更高的表达水平。为观察在哺乳动物细胞中表达的EGFP荧光信号，应采用488 nm激发光和507 nm发射光进行荧光显微镜检测，优先使用共聚焦显微镜。
监测受体的亚细胞定位及其配体介导的内化是研究G蛋白偶联受体（GPCR）信号转导与功能的常用技术10,11。在大多数情况下，内化会导致GPCR脱敏（即尽管激动剂存在，刺激反应仍减弱）12,13。内化的受体可被转运至溶酶体并降解，也可被循环回收至细胞膜表面，具体命运取决于受体的性质及实验中所用的细胞系。
促性腺激素释放激素受体（GnRHRs）属于G蛋白偶联受体（GPCR）家族，具有典型的GPCR蛋白结构，包括一个细胞外氨基末端、一个细胞内-COOH末端以及七个跨膜（TM）结构域14。先前已有报道，将重组质粒SjGnRHR-EGFP（包含来自Sepiella japonica的GnRHR基因）转染至细胞，并通过共聚焦显微镜检测在HEK293细胞中表达的EGFP标记的SjGnRHR，同时已确立GFP荧光作为跨膜蛋白定位实验的报告信号15。目前，通过共聚焦显微镜观察发现，由中国台湾S. japonica促性腺激素释放激素（SjGnRH）激活的SjGnRHR内化过程呈现出时间和剂量依赖性。

<table><tbody><tr><td>HEK293细胞系&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/高糖</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>高糖，4.0 mM L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>PuFei</td><td>1101-100</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Genom</td><td>GNM10010</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Genom</td><td>GNM15140</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶 &amp; 0.02% EDTA</td><td>Genom</td><td>GNM25200</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (1x)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31985-062</td><td>低血清培养基</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 转染试剂</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>试剂1</td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA 转染试剂</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td>试剂2</td></tr><tr><td>DAPI染色液</td><td>Beyotime</td><td>C1006</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>Beyotime</td><td>C1036</td><td></td></tr><tr><td>抗荧光淬灭封片剂</td><td>Beyotime</td><td>P0126</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>国药集团化学试剂有限公司（SCRC）</td><td>80096618</td><td></td></tr><tr><td>100 mm细胞培养皿</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>6孔板&amp;nbsp;</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0092</td><td></td></tr><tr><td>12孔板&amp;nbsp;</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0093</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>NEST</td><td>801007</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Citoglas</td><td>10127105P-G</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5II 激光扫描共聚焦显微镜</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>5100001311</td><td></td></tr></tbody></table>

通过共聚焦显微镜检测配体激活的g蛋白偶联受体的内化

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）是一种用于高对比度成像的光学成像技术。该技术可有效可视化荧光融合蛋白（如绿色荧光蛋白GFP），以确定其表达、定位及功能。目标蛋白的亚细胞定位对于蛋白的鉴定、表征及功能分析具有重要意义。内化是调控G蛋白偶联受体（GPCR）信号转导的主要机制之一，可确保细胞对刺激产生适当的反应。本文介绍了一种利用共聚焦显微镜检测HEK293细胞中GPCR亚细胞定位及内化过程的实验方法。此外，本实验还提供了有关细胞培养与转染的一些细节。该方案适用于多种广泛使用的荧光标记物，可用于观察大多数蛋白的亚细胞定位以及GPCR的内化过程。该技术将有助于研究人员高效调控哺乳动物细胞系中GPCR基因的表达，并推动对GPCR亚细胞定位与内化过程的研究。

图1 展示了共聚焦显微镜系统的一个示例。 图2 展示了pEGFP-N1在HEK293细胞中的表达。GFP信号在细胞质和细胞核中均有检测到。 图3 显示促性腺激素释放激素受体（GnRHR）的亚细胞定位 S. japonica 在HEK293细胞中，与我们先前发表的结果一致15. 在C末端带有EGFP标签的融合蛋白 SjGnRHR (SjGnRHR-EGFP）在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）下呈绿色。经DAPI染色的细胞核呈蓝色。DiI染色使细胞膜呈红色。合并图像中细胞表面的黄色信号表明红色与绿色信号重叠，证明GnRHR-EGFP定位于细胞质膜 SjGnRHR
图4 和 图5</stro...

本方案描述了在哺乳动物细胞中通过共聚焦显微镜检测G蛋白偶联受体（GPCR）内化的方法。内容包括基本的细胞培养、转染及共聚焦显微镜操作流程，提供了一种高效且易于解读的方法，用于检测融合表达的GPCR亚细胞定位及其内化过程。

通过共聚焦显微镜检测配体激活的G蛋白偶联受体的内化

共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）是一种用于高对比度成像的光学成像技术。它是一种可视化荧光标记样本的有力方法。

本实验的总体目标是提供一种高效且易于解读的方法，用于检测哺乳动物细胞中表达的G蛋白偶联受体（GPCR）融合蛋白的亚细胞定位及其内化情况。该方法有助于回答亚细胞蛋白定位研究领域中的关键问题，例如受体的内化与再循环。该技术的主要优势在于其操作简便且效率高。因此，该方法可为监测和定位G蛋白偶联受体（GPCRs）提供见解，并可应用于其他系统，如细胞质和核蛋白。按照文本方案复苏并传代HEK293细胞后，当细胞生长至接近汇合时，弃去预温的培养基，加入两毫升磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻晃动培养皿以洗涤细胞。弃去 PBS，加入 1 毫升胰蛋白酶 EDTA。为完全消化细胞，轻轻晃动培养皿后吸除溶液。随后，将培养皿置于 37 摄氏度水套式 CO2 培养箱中孵育 3 分钟。在细胞孵育的同时，向六孔板的每个孔中加入两毫升平衡过的培养基，进行准备。当细胞从培养皿底部脱落时，向培养皿中加入一毫升平衡过的培养基。用移液器吹打混匀，并立即向已准备好的六孔板的每个孔中转移0.1毫升细胞悬液。轻轻吹打各孔中的悬液，并将细胞在37摄氏度、5% CO2条件下孵育。次日，确保细胞融合度达到85–95%。然后，向两个无菌微量离心管中，向其中一管加入3微克质粒DNA和100微升低血清培养基。同时，向另一支试管中加入9微升试剂一和100微升低血清培养基。将试管在室温下孵育5分钟。将稀释的质粒混合物与稀释的试剂一混合。然后轻轻混匀溶液，在室温下孵育20分钟。吸除细胞培养基，每孔加入1.5毫升不含FBS的新鲜DMEM培养基。随后，将215微升DNA转染试剂混合物逐滴加入每孔中，并通过轻轻摇动培养板进行混匀。将培养板置于37摄氏度、5%CO2条件下孵育4至8小时。随后更换为含10%FBS的新鲜DMEM培养基。在进行任何实验前，继续培养细胞24至48小时。不同细胞系的转染效率可能存在显著差异，因此可能需要根据所使用的特定细胞类型优化显微注射与刺入式沉积参数。从六孔培养板中移除生长培养基。然后，用1毫升PBS洗涤细胞单层。加入0.5毫升胰蛋白酶EDTA，轻轻晃动培养皿，吸除溶液。随后，将培养板在37°C条件下孵育3分钟。孵育期间，将直径为15毫米的无菌盖玻片插入12孔板的每个孔中。用少量新鲜的完全培养基重悬细胞，并将所需数量的细胞转移至含有盖玻片的12孔板中。然后，将细胞孵育16至24小时。孵育16至24小时后，当细胞生长接近汇合时，向每个孔中加入5 µM的膜探针dill，然后将细胞放回孵育箱中继续孵育30分钟。移除已平衡的生长培养基，用冷的PBS洗涤细胞两次。随后，向每个孔中加入1 mL的4% PFA，在摇床上振荡15分钟以固定细胞。用 PBS 洗涤固定后的细胞两次，然后向每个孔中加入 200 至 300 微升 DAPI，于室温孵育 10 分钟。再次用 PBS 洗涤细胞两次后，小心从板中取出盖玻片，并吸去多余的缓冲液。将盖玻片倒置在已滴加一滴封片剂的显微镜载玻片上。然后，从载玻片上除去多余的封片介质。使用生长至接近汇合的细胞，移除已平衡的生长培养基，并加入新鲜预热的DMEM。将细胞孵育1小时。用不同浓度的配体处理细胞30分钟，并用10⁻⁶ M配体处理细胞不同时间（如图所示）。用预冷的PBS洗涤细胞两次，然后每孔加入1毫升含4% PFA的PBS溶液，轻轻振荡孵育15分钟。用 PBS 洗涤细胞两次后，小心地将盖玻片从培养板的孔中取出，并按照本视频前面演示的方法进行封片。进行共聚焦显微镜观察时，打开共聚焦显微镜的硬件设备，包括汞灯电源、PC 显微镜、扫描仪和激光器。启动软件后，检查配置并选择相应的激光器。根据说明打开共聚焦显微镜系统的各个组件。将制备好的玻片放置在显微镜载物台上，使用载物台控制器将样品移至物镜下方。若使用油浸物镜，需在盖玻片上滴加一滴雪松油，并将带有盖玻片的一面朝向物镜方向放置玻片。在荧光下找到目标细胞，然后切换至扫描模式，选择发射荧光染料的激光功率和光谱范围。通过调节激光强度和其他参数获取高质量图像。该图展示了 pEGFP-N1 在 HEK293 细胞中的表达情况。在细胞质和细胞核中均检测到GFP信号。此处展示了日本血吸虫促性腺激素释放激素受体（S-Japonica或SjGnRHR）在HEK293细胞中的亚细胞定位。EGFP标记的受体呈绿色，DiI染色用于显示细胞膜，呈红色。受体可见定位于细胞膜。为观察SjGnRHRs的内化过程，细胞经不同浓度的促性腺激素释放激素处理。如图所示，受体的内化呈剂量依赖性，当配体浓度为10⁻⁶ M时，受体可完全从细胞表面内化至细胞内。当用10⁻⁶ M配体处理不同时间后，激动剂刺激10分钟后即可检测到内化的SjGnRHRs，60分钟时出现显著的内化现象。如在HEK293细胞中的实验所示，在两次实验中，荧光标记的SjGnRHR-EGFP融合蛋白主要定位于细胞膜，且在细胞刺激后迅速并显著地内化至细胞内。在进行该操作时，重要的是要始终确保细胞处于无细菌、真菌和支原体污染的适宜培养条件下。通过该实验流程，还可进行细胞检测和固定等方法，以回答其他问题，例如蛋白质受体在第二次通过V区时的情况。随着每一项技术的发展，该方法为细胞生物学和生物化学领域的研究人员探索跨膜受体在不同细胞系中的定位与内化过程奠定了基础。

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生物学

配体激活的G蛋白偶联受体内在化的检测通过共聚焦显微镜

通过使用光谱分辨的双光子显微成像系统，获得表达膜受体的细胞的福斯特共振能量转移（FRET）效率的像素级图谱，这些膜受体被认为可形成同源寡聚复合物。根据FRET效率图谱，我们能够估算所研究寡聚复合物的化学计量信息。...

体内 利用光谱分辨双光子显微镜定量分析G蛋白偶联受体相互作用

本文中，我们描述了用于研究趋化性的详细活细胞成像方法。我们介绍了荧光显微镜技术，用于监测迁移细胞中信号事件的时空动态。对信号事件的测量使我们能够进一步理解GPCR信号网络如何实现对趋化因子梯度的感知，并调控真核细胞的定向迁移。...

成像介导趋化性信号事件的G蛋白偶联受体（GPCR）：以盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）为例

我们在G蛋白偶联受体（GPCR）的不同特定位点处基因编码非天然氨基酸对叠氮-L-苯丙氨酸，并展示了叠氮基团在多种应用中的多功能性。这些应用包括一种靶向光交联技术，用于鉴定GPCR配体结合口袋中的残基，以及利用肽表位标签或荧光探针对GPCR进行位点特异性的生物正交修饰。...

基因编码的分子探针用于研究G蛋白偶联受体

我们描述了一种利用特异性多克隆抗体标记活神经元表面蛋白的方法，该抗体针对细胞外表位。通过内吞作用被抗体结合并在细胞表面内化的蛋白，可与在孵育期间仍停留在表面或转运至表面的蛋白区分开来。...

活体培养神经元抗体孵育后细胞表面与内化蛋白的差异标记

本文所述的基于荧光的钙流测定法是一种中等通量的反向药理学筛选系统，用于鉴定孤儿G蛋白偶联受体（GPCRs）的功能性激活配体。...

基于荧光的钙离子动员检测法表征G蛋白偶联受体

本方案描述了如何利用全内反射荧光显微镜观察和追踪活细胞表面的单个受体，从而分析受体的侧向流动性、受体复合物的大小，以及可视化瞬时的受体-受体相互作用。该方案可拓展应用于其他膜蛋白。...

高分辨率时空分析受体动力学的单分子荧光显微技术

网格蛋白介导的内吞作用是一种快速且高度动态的过程，可将多种蛋白质（包括信号受体）内化。本文所述的实验方案可直接可视化单个内吞事件的动力学过程。这对于理解内吞机制核心组分之间如何相互协调，以及蛋白质货物如何影响该过程至关重要。...

通过全内反射荧光显微镜以单事件分辨率可视化G蛋白偶联受体的网格蛋白介导的内吞作用

受体转运可调节细胞对配体的信号转导及反应性，并且其自身也响应细胞内的各种条件，包括配体诱导的信号通路。本文中，我们介绍一种强大且灵活的技术，通过免疫标记和共定位分析，定量评估药物诱导的受体转运。...

通过共定位分析追踪药物诱导的受体内在化后转运变化

本文介绍了一种对表达绿色荧光蛋白标记的血管紧张素Ⅱ...

活细胞成像与三维分析转染人胚胎肾细胞中血管紧张素受体1a亚型的转运——基于共聚焦显微镜技术

本文介绍了一种简便的荧光检测方法，用于评估氨基酰-tRNA合成酶/tRNA配对在哺乳动物细胞表达蛋白中掺入非经典氨基酸（ncAAs）的效率。文中还描述了将非经典氨基酸应用于G蛋白偶联受体（GPCRs）研究的实例，包括结合位点的光交联定位以及在活细胞中对GPCR进行生物正交标记。...

优化化学探针在G蛋白偶联受体中的遗传编码，用于活体哺乳动物细胞中的光交联定位与生物正交化学研究

本研究描述了一种用于384孔板的高通量细胞内钙荧光检测方法，可用于在重组G蛋白偶联受体（GPCRs）上筛选小分子文库。该检测以牛蜱Rhipicephalus...

一种用于高通量筛选重组G蛋白偶联受体的“双加样”钙荧光检测法

学习使用共聚焦显微镜检测哺乳动物细胞中G蛋白偶联受体的内在化过程。该方法利用HEK293细胞系和荧光标记技术，可清晰观察受体的亚细胞定位与动态变化，为研究受体信号转导和循环机制提供可靠工具。

通过共聚焦显微镜检测配体激活的G蛋白偶联受体的内化

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