通过高通量抑制剂筛选鉴定调控胚胎干细胞多能性的激酶的简易方法

本筛选实验的总体目标是鉴定能够调节胚胎干细胞多能性的小分子蛋白激酶抑制剂。该方法可通过识别调控胚胎干细胞多能性的新型蛋白激酶信号通路，帮助解答胚胎干细胞信号转导领域中的关键科学问题。因此，该技术的主要优势在于，利用常规实验室设备和 readily available 试剂即可相对简便地开展筛选。

当我们意识到关于多能性信号通路的大多数研究完全忽略了激酶组中的大量激酶时，我们首次提出了该方法的构想。通过向10厘米培养皿中加入5毫升0.1%明胶，制备明胶包被的10厘米培养皿。在室温孵育5分钟后，吸除明胶溶液，并让培养皿干燥2分钟。

然后，将任何标准的小鼠胚胎干细胞系接种至包被的培养皿中，使用含有100纳克/毫升GST标签LIF、10%胎牛血清和5%Knockout血清替代物的标准小鼠胚胎干细胞培养基。在37摄氏度、5%CO2条件下培养细胞，每天更换培养基。每两天传代一次小鼠胚胎干细胞，当细胞融合度达到约80%时，吸除培养基，并用每皿5毫升的磷酸盐缓冲液洗涤。

然后，每孔小鼠胚胎干细胞加入1毫升胰蛋白酶EDTA溶液，在37摄氏度孵育10分钟。孵育结束后，用4毫升培养基重悬消化后的细胞，并在1200转/分钟下离心5分钟。将所得细胞沉淀用5毫升培养基充分重悬，反复吹打以形成单细胞悬液。

将10微升细胞悬液与10微升台盼蓝混合后计数细胞。将混合液加入细胞计数板，或使用血细胞计数板和光学显微镜进行计数。随后，用多通道移液器将3000个小鼠ES细胞接种至经0.1%明胶包被的96孔板中，每孔终体积为100微升培养基。

然后，使用多通道移液器以1:100的稀释比例加入激酶抑制剂。轻轻吹打培养基，以充分混匀抑制剂与细胞悬液。随后，将细胞置于组织培养超净台中静置1小时，以确保细胞在培养表面均匀分布。

将细胞培养 48 小时，期间不更换培养基。开始筛选分析时，使用多通道移液器和移液管，用 200 微升 PBS 清洗 96 孔小鼠 ES 细胞板。清洗后，在 150 微升裂解缓冲液中混合细胞裂解物。

在V型底96孔板中，以1500 × g离心30分钟澄清提取物。随后，使用96孔真空点印迹装置将100 µL上清液固定于硝酸纤维素膜上。将膜干燥后，用40 mL Ponceau S染色，以确认转移的一致性。

用 TBST 洗涤膜后，在含 3% 脱脂奶粉的 TBST 中封闭。然后，将膜与 Nanog 和 Dnmt3b 抗体按 1:1000 的稀释比例在封闭缓冲液中 4°C 孵育过夜。次日，用 TBST 洗涤膜三次，每次 10 分钟。

然后，在封闭缓冲液中用1:10,000稀释的30毫升二抗溶液孵育。使用数字免疫印迹成像系统显影膜。在继续实验之前，必须通过传统的免疫印迹法验证筛选中鉴定出的激酶抑制剂。

这有助于在进一步的下游分析之前去除假阳性结果。按照文本方案中所述，分析筛选数据并验证抑制剂为真正的多能性调控因子。此处显示的是所进行筛选实验中一个具有代表性的Nanog点图。

标出了可诱导始发态或多能性的阳性对照抑制剂。图中还显示了筛选实验中得到的一个代表性 Dnmt3b 点图。再次标出了可诱导始发态或多能性的阳性对照抑制剂。

在此图中，根据 Nanog 与 Dnmt3b 的比值对抑制剂进行了排序。设定两倍的 Nanog 与 Dnmt3b 比值作为阈值，用于识别能够稳定 naive 或 primed 多能性的抑制剂。同时提供了 Nanog 与 Dnmt3b 信号的总和。

此外，还列出了用于进一步验证的激酶抑制剂。图中展示了所选激酶抑制剂、Nanog 和 Dnmt3b 的常规免疫印迹验证结果，以及 Nanog 与 Dnmt3b 的比值和总信号强度。观看本视频后，您应能够充分了解如何鉴定可调节胚胎干细胞多能性的 小分子激酶抑制剂。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在72小时内完成。尽管该方法可帮助研究调控多能性的激酶信号通路，也可应用于胚胎干细胞分化及其他调控系统，例如表观遗传修饰因子。在完成该操作步骤后，还可使用其他小分子抑制剂文库（如靶向表观遗传修饰因子的文库），以鉴定参与多能性调控的新因子。

该技术建立后，为我们的研究团队阐明新的多能性信号通路奠定了基础。我们利用该技术鉴定出扩增通路在调控多能性方面的新功能。