通过高通量抑制剂筛选鉴定调节胚胎干细胞多能性的激酶的简单方法
May 12th, 2017
在这里，我们提出一个定量和可扩展的方案来执行针对性的小分子屏幕，用于初始化多能转换的激酶调节剂。
该筛选的总体目标是鉴定调节胚胎干细胞多能性的小分子蛋白激酶抑制剂。该方法可以通过识别调节胚胎干细胞多能性的新型蛋白激酶信号通路来帮助回答胚胎干细胞信号传导领域的关键问题。因此，该技术的主要优点是使用标准实验室设备和现成的试剂相对容易进行筛选。
当我们意识到大多数关于多能性信号通路的研究完全忽略了激酶组的巨时，我们第一次有了这种方法的想法。向 10 厘米板中加入 5 毫升 0.1% 明胶，准备涂有明胶的 10 厘米培养皿。在室温下孵育 5 分钟后，吸出明胶，让板干燥 2 分钟。
然后，将任何标准小鼠 ES 细胞系接种在含有 100 ng/mL GST 标记的 LIF 、10% 胎牛血清和 5% 敲除血清替代物的标准小鼠 ES 细胞培养基中的包被培养皿上。在 37 摄氏度 5% CO2 下培养细胞，并每天更换培养基。通过吸出培养基并每板用 5 毫升磷酸盐缓冲盐水洗涤，每隔一天以大约 80% 汇合度传代小鼠 ES 细胞。
然后，每板小鼠 ES 细胞添加 1 毫升胰蛋白酶 EDTA，并在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。孵育后，将胰蛋白酶消化的细胞重悬于 4 mL 培养基中，并以 1200 RPM 的转速离心细胞 5 分钟。将所得细胞沉淀彻底重悬于 5 mL 培养基中，上下移液以产生单细胞悬液。
通过混合 10 μL 细胞悬液和 10 μL 台盼蓝对细胞进行计数。将混合物放入细胞计数室中或使用血细胞计数器和光学显微镜。接下来，使用多通道移液器将 3000 个小鼠 ES 细胞接种到最终体积为 100 微升培养基的 0.1% 明胶包被的 96 孔板中。
然后，使用多通道移液器以 1 到 100 的稀释度应用激酶抑制剂。轻轻移液培养基以混合抑制剂和细胞悬液。然后，让细胞在组织培养罩中沉淀 1 小时，以确保在铺板表面均匀分布。
将细胞培养 48 小时而不更换培养基。要开始筛选分析，使用多通道抽吸器和移液器在 200 微升 PBS 中洗涤 96 孔小鼠 ES 细胞板。洗涤后，将细胞提取物混合在 150 μL 裂解缓冲液中。
通过在 V 形底 96 孔板中以 1500 倍 G 离心 30 分钟来澄清提取物。然后，使用 96 孔真空点图歧管将 100 微升上清液固定在硝酸纤维素膜上。干燥膜并用 40 毫升丽春红 S 染色，以确保转移一致。
用 TBST 洗涤膜后，将其封闭在 TBST 加 3% 牛奶中。然后，将膜在 Nanog 和 Dnmt3b 抗体中以 1 比 1000 的稀释度在封闭缓冲液中孵育过夜。第二天，在 TBST 中洗涤膜 3 次，每次 10 分钟。
然后，将其与 30 mL 二抗以 1 至 10， 000 的稀释度在封闭缓冲液中孵育。使用数字免疫印迹成像系统显影膜。在进行之前，使用常规免疫印迹验证筛选中鉴定的激酶抑制剂至关重要。
这有助于在进一步的下游分析之前消除假阳性。分析筛选数据并验证抑制剂为真正的多能性调节因子，如文本方案中所述。此处显示的是执行屏幕中具有代表性的 Nanog 点图。
突出显示了驱动启动或初始多能性的阳性对照抑制剂。还显示了执行屏幕中具有代表性的 Dnmt3b 点图。驱动引物或幼稚多能性的阳性对照抑制剂再次被强调。
在该图中，抑制剂按 Nanog 与 Dnmt3b 的比率进行排序。设置两倍 Nanog 与 Dnmt3b 比率阈值，以识别稳定初始或引发多能性的抑制剂。还提供了 Nanog 和 Dnmt3b 信号的总和。
此外，还记录了选择用于进一步验证的激酶抑制剂。此处显示的是所选激酶抑制剂、Nanog 和 Dnmt3b 免疫印迹的常规免疫印迹验证，以及 Nanog 与 Dnmt3b 的比率和总信号。看完这个视频，你应该对如何鉴定调节胚胎干细胞多能性的小分子激酶抑制剂有一个很好的了解。
一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 72 小时内完成。虽然这种方法可以深入了解控制多能性的激酶信号通路，但它也可以应用于胚胎干细胞分化和其他调节系统，例如表观遗传修饰剂。该程序之后，其他小分子抑制剂文库，例如靶向表观遗传修饰物的文库，可用于识别多能性调节的新参与者。
开发后，这项技术为我们的研究小组阐明新的多能性信号通路铺平了道路。我们使用这种技术来确定扩增途径在调节多能性中的新作用。
概述
本文介绍了一种定量且可扩展的靶向小分子筛选协议，旨在识别初级-诱导多能性转变的激酶调节剂。该方法旨在增强对胚胎干细胞信号传导通路的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 干细胞研究
- 信号转导
背景
- 胚胎干细胞多能性由各种信号传导通路调节。
- 以往的研究忽略了基因组中的许多组分。
- 识别新型激酶抑制剂可以为多能性调节提供见解。
- 本研究旨在填补当前关于干细胞激酶信号传导的知识空白。
研究目的
- 识别调节胚胎干细胞多能性的小分子蛋白激酶抑制剂。
- 阐明多能性涉及的新型蛋白激酶信号传导通路。
- 开发使用标准实验室设备的简单筛选方法。
所用方法
- 准备明胶涂层细胞培养皿。
- 接种小鼠胚胎干细胞并施用激酶抑制剂。
- 通过免疫印迹技术进行筛选分析。
- 使用常规方法验证识别出的激酶抑制剂。
主要结果
- 成功识别出稳定初级或诱导多能性的激酶抑制剂。
- 数据分析揭示了抑制剂选择的Nanog与Dnmt3b比率为2倍的阈值。
- 对选定的抑制剂的验证证实了它们在调节多能性中的作用。
- 获得的见解可应用于其他调节系统和分化过程。
结论
- 所开发的协议允许高效筛选激酶抑制剂。
- 该方法可适用于研究胚胎干细胞分化。
- 未来的应用可能包括探索多能性调节中的表观遗传修饰剂。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to systematically interrogate kinase signaling networks that govern pluripotency transitions, a critical inflection point in stem cell-based therapeutic development. By providing a scalable, reagent-efficient platform for target de-risking, it supports early-stage hypothesis testing and mechanistic insight into cell fate regulation. The approach enhances predictive confidence in target selection by linking kinase modulation to defined pluripotency biomarkers, informing portfolio prioritization in regenerative medicine and disease modeling pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of kinase-dependent mechanisms underlying naïve-primed pluripotency transitions.
- Operational Value: Uses standard cell culture and immunoblotting infrastructure, minimizing specialized equipment needs.
- Predictive Value: Identifies kinase inhibitors that modulate pluripotency biomarkers (Nanog/Dnmt3b) to support target hypothesis validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative immunoblot readouts (Nanog, Dnmt3b, ratio) for hit identification in kinase-focused screens.
- Operational Value: Compatible with 96-well formats and multichannel pipetting for medium-throughput compound evaluation.
- Assay Readiness: Produces normalized, reproducible signals enabling cross-plate comparison and threshold-based hit selection (e.g., two-fold Nanog/Dnmt3b ratio).
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links kinase activity to pluripotency states relevant for disease modeling and regenerative applications.
- Mechanistic De-risking: Clarifies signaling pathways upstream of core pluripotency factors, reducing ambiguity in target mechanism.
- Preclinical Relevance: Supports validation of kinase targets in stem cell-derived models prior to differentiation or tissue-specific assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, connecting target hypothesis testing to assay development and preclinical validation through measurable biomarker outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening of kinase libraries to clarify signaling nodes in pluripotency regulation.
- Screening: Enables standardized, reproducible compound screening in ESC models using accessible reagents and detection methods.
- Analytics: Delivers quantitative, normalized immunoblot data (signal intensity, ratios) to prioritize hits based on pluripotency effects.
- Translational Research: Connects kinase modulation to stem cell state transitions, informing downstream differentiation and disease model relevance.
- Enterprise Reuse: Platform can be adapted for other small molecule libraries (e.g., epigenetic modifiers) and stem cell contexts beyond pluripotency screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in kinase-target pluripotency relationships through biomarker-linked phenotypic readouts.
- Operational Value: Leverages standard lab equipment (incubator, centrifuge, immunoblot system) for broad accessibility across discovery teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early functional validation of kinase targets in a physiologically relevant system.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization by identifying kinases that modulate defined pluripotency states.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic stem cell culture and maintenance under defined conditions.
- Dependent on access to immunoblotting infrastructure and validated antibodies (e.g., Nanog, Dnmt3b).
- Necessitates standardization of cell seeding density, inhibitor dosing, and incubation times for assay reproducibility.
- Adaptation to other model systems may require optimization of coating, media, and passaging protocols.
- False positive rates require orthogonal validation (e.g., conventional immunoblot) to confirm target engagement and specificity.
