Name: 通过高通量抑制剂筛选鉴定调节胚胎干细胞多能性的激酶的简单方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 学习高通量激酶抑制剂筛选方法，用于鉴定调节小鼠胚胎干细胞多能性状态的信号通路。该方法利用免疫印迹技术分析Nanog与Dnmt3b表达比例，可在72小时内完成筛选，为干细胞生物学研究提供高效工具。

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C.A.C.W. 获得英国医学研究委员会博士生奖学金的支持。G.M.F. 部分获得英国医学研究委员会新研究者奖（MR/N000609/1）和苏格兰Tenovus研究基金的资助。

1. 小分子激酶抑制剂文库的收集
<ol>
	<li>从公开可获取的激酶抑制剂文库中整理抑制剂集合， 例如 哈佛医学院的集成网络细胞特征库（Library of Integrated Network-based Cellular Signatures，LINCS），包含228种高效且具有选择性的激酶抑制剂（http://lincs.hms.harvard.edu）；以及由工业界研究人员构建的蛋白质激酶抑制剂集合（Protein Kinase Inhibitor Set，PKIS），包含376种化合物（https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS）13或者，可从市售化合物中自行组建定制的激酶抑制剂库。 
	注意：在我们的实验室中，已收集了72种强效且高选择性的工具激酶抑制剂，涵盖51种主要靶点激酶，所有这些抑制剂均可从商业渠道获得。</li>
	<li>将激酶抑制剂配制到96孔板中，用于在多种浓度（使用1、0.1和0.01 mM）下进行高效的高通量处理。每块板中均设置仅含DMSO的对照孔，以及已知可分别促进原始态和始发态多能性的参考对照抑制剂PD173074（FGFRi）和Ruxolitinib（JAKi）。在电子表格或类似软件中进行标注。</li>
</ol>
2. 筛选准备用小鼠胚胎干细胞培养条件与操作步骤
<ol>
	<li>通过向10 cm培养皿中加入5 mL 0.1%（w/v）明胶溶液，室温孵育5分钟，制备0.1%明胶包被的10 cm培养皿。吸除明胶溶液，让培养皿干燥2分钟。</li>
	<li>将任何标准的小鼠胚胎干细胞（mESC）系在含100 ng/mL GST-LIF、10%胎牛血清和5% Knockout血清替代物的标准mESC培养基（见材料表）中，于37 °C、5% CO2条件下，在0.1%明胶包被的10 cm培养皿中培养。每天更换培养基，并每两天在约80%融合度时以1:5至1:10的比例传代mESC。</li>
	<li>传代mESC时，吸除培养基，并用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤每块培养皿。</li>
	<li>每块mESC培养皿中加入1 mL胰蛋白酶-EDTA溶液（0.05%胰蛋白酶，0.02% EDTA），于37 °C孵育10分钟。</li>
	<li>用4 mL mESC培养基重悬消化后的细胞，于1,200 rpm离心5分钟。</li>
	<li>用5 mL mESC培养基充分重悬细胞沉淀，反复吹打以获得单细胞悬液。</li>
	<li>取10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝（0.4%）混合进行细胞计数。将混合液加入细胞计数板或使用血细胞计数板配合光学显微镜进行计数。</li>
	<li>使用多通道移液器将3 × 103个mESC接种至0.1%明胶包被的96孔板中，每孔终体积为100 µL培养基。</li>
	<li>使用多通道移液器以1:100稀释比例加入激酶抑制剂（每100 µL培养基中加入1 µL抑制剂）。轻轻吹打培养基以混匀抑制剂与细胞悬液，然后将细胞置于生物安全柜中静置1小时，确保细胞在培养表面均匀分布。在不更换培养基的情况下继续培养48小时。 
	注意：1 mM、0.1 mM和0.01 mM的储存液分别对应最终抑制剂浓度为10 µM、1 µM和0.1 µM。我们建议筛选实验从1 µM的终浓度开始，以确保有效抑制主要靶点激酶的同时，尽量减少脱靶效应。</li>
</ol>
3. 激酶抑制剂筛选分析
<ol>
	<li>使用多通道移液器和吸液器，以 200 µL PBS 清洗 96 孔 mESC 培养板。</li>
	<li>在 150 µL 裂解缓冲液（20 mM Tris pH 7.4，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1% NP-40 (v/v)，0.5% 脱氧胆酸钠 (w/v)，10 mM β-甘油磷酸钠，10 mM 焦磷酸钠，1 mM NaF，2 mM Na3VO4，完全蛋白酶抑制剂混合片剂）中制备细胞裂解物。</li>
	<li>将裂解物在 V 型底 96 孔板中以 1,500 × g 离心 30 分钟，以澄清提取物。</li>
	<li>使用 96 孔真空点印迹装置，将 100 µL 上清液固定到硝酸纤维素膜上。</li>
	<li>干燥膜后，用 40 mL Ponceau S 染色，以确认转移的一致性。</li>
	<li>用 TBST 洗涤膜，并在含 3% (w/v) 脱脂奶粉的 TBST 中封闭。</li>
	<li>在含 3% (w/v) 脱脂奶粉的 TBST 中，以 1:1,000 (v/v) 稀释度加入 Nanog 和 Dnmt3b 抗体，4°C 孵育过夜。</li>
	<li>在 TBST 中洗涤 3 次，每次 10 分钟，然后在 30 mL 含 3% (w/v) 脱脂奶粉的 TBST 中，以 1:10,000 (v/v) 稀释度加入二抗孵育。</li>
	<li>使用数字免疫印迹成像系统显影。 
	注意：如有可能，建议采用定量荧光免疫印迹检测 Nanog 和 Dnmt3b。然而，Dnmt3b 的荧光免疫印迹背景信号过高，因此 Nanog 使用 800 nm 荧光抗兔二抗，Dnmt3b 使用抗小鼠 HRP 二抗。</li>
</ol>
4. 筛选数据的分析及对抑制剂作为真正多能性调控因子的验证
注意：这是确保仅鉴定出真正多能性调节剂的关键步骤。必须根据 Nanog:Dnmt3b 比值和总体信号对抑制剂进行初步筛选，以确保不会选择对小鼠胚胎干细胞存活产生不利影响的激酶抑制剂进入后续分析。
<ol>
	<li>使用免疫印迹分析软件对 Nanog 和 Dnmt3b 信号进行定量，并将数值导入电子表格或类似软件中。计算所有样品相对于 DMSO 对照组的 Nanog:Dnmt3b 比值。同时测定 Nanog 和 Dnmt3b 的总信号强度，以确保激酶抑制剂不会通过影响 mESC 存活率而改变 Nanog:Dnmt3b 比值。</li>
	<li>根据 Nanog:Dnmt3b 比值的排序结果，鉴定可促进原始态多能性（Nanog:Dnmt3b 比值高于对照组）和始发态多能性（Nanog:Dnmt3b 比值低于对照组）的抑制剂。设定阈值为对照组数值的 2 倍偏差，并排除那些导致 Nanog+Dnmt3b 总信号低于 DMSO 对照组 50% 的激酶抑制剂，从而获得高可信度的激酶抑制剂列表，这些抑制剂可分别稳定原始态（高 Nanog:Dnmt3b 比值）和始发态（低 Nanog:Dnmt3b 比值）多能性状态。</li>
	<li>通过将 mESCs 以每 6 孔 2 × 105 个细胞接种于 2 mL 培养基中，并在不更换培养基的情况下加入 1 µM 浓度的激酶抑制剂处理 48 小时，对候选抑制剂进行验证。</li>
	<li>使用裂解缓冲液裂解 mESCs，并通过常规 SDS-PAGE 免疫印迹分析 Nanog 和 Dnmt3b 的表达水平。</li>
	<li>进一步通过 SDS-PAGE 免疫印迹检测原始态多能性标志物 Klf2 和 Klf4 以及 Oct4 的表达，以确认在 48 小时抑制剂处理后多能性状态得以维持。</li>
</ol>

<ol><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li>
<li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+primed+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).</li>
<li>Boroviak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-Specific+Profiling+Delineates+the+Emergence+and+Progression+of+Naive+Pluripotency+in+Mammalian+Embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Lineage-Specific Profiling Delineates the Emergence and Progression of Naive Pluripotency in Mammalian Embryogenesis.</a> Developmental Cell. 35 (3), 366-382 (2015).</li>
<li>Tesar, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+cell+lines+from+mouse+epiblast+share+defining+features+with+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells.</a> Nature. 448 (7150), 196-199 (2007).</li>
<li>Brons, I. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+pluripotent+epiblast+stem+cells+from+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos.</a> Nature. 448 (7150), 191-195 (2007).</li>
<li>Festuccia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esrrb+is+a+direct+Nanog+target+gene+that+can+substitute+for+Nanog+function+in+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Esrrb is a direct Nanog target gene that can substitute for Nanog function in pluripotent cells.</a> Cell Stem Cell. 11 (4), 477-490 (2012).</li>
<li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+inhibition+in+ESCs+drives+rapid+genome-wide+demethylation+to+the+epigenetic+ground+state+of+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klf4+reverts+developmentally+programmed+restriction+of+ground+state+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Klf4 reverts developmentally programmed restriction of ground state pluripotency.</a> Development. 136 (7), 1063-1069 (2009).</li>
<li>Chambers, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).</li>
<li>Findlay, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+domains+of+Sos1%2FGrb2+are+finely+tuned+for+cooperative+control+of+embryonic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interaction domains of Sos1/Grb2 are finely tuned for cooperative control of embryonic stem cell fate.</a> Cell. 152 (5), 1008-1020 (2013).</li>
<li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12 (13), 2048-2060 (1998).</li>
<li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+stimulation+of+the+Erk1%2F2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134 (16), 2895-2902 (2007).</li>
<li>Elkins, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+characterization+of+the+Published+Kinase+Inhibitor+Set%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive characterization of the Published Kinase Inhibitor Set.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 95-103 (2016).</li>
<li>Williams, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erk5+Is+a+Key+Regulator+of+Naive-Primed+Transition+and+Embryonic+Stem+Cell+Identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Erk5 Is a Key Regulator of Naive-Primed Transition and Embryonic Stem Cell Identity.</a> Cell Reports. 16 (7), 1820-1828 (2016).</li>
<li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules.</a> Science. 352 (6290), (2016).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+reprogramming+of+fibroblasts+into+neural+stem+cells+by+signaling-directed+transcriptional+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pharmacological reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by signaling-directed transcriptional activation.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 653-667 (2016).</li>
</ol>

作者声明本研究不存在利益冲突。

本文展示了一种广泛适用的方法，用于探究激酶信号通路在调控多能性从初始态向始发态转变过程中的作用，这解决了胚胎干细胞领域中的一个关键科学问题。尽管高通量基因组学和转录组学方法已被常规用于鉴定初始态和始发态多能性状态的关键转录调控因子，但解析多能性的信号网络仍具挑战性。我们现提出一种灵活的策略，利用化学抑制剂来鉴定调控小鼠胚胎干细胞（mESCs）中初始态-始发态多能性转变的激酶。该方法依赖于大多数研究细胞信号转导和胚胎干细胞生物学的实验室均具备的常规设备、试剂和材料。该技术平台成功的关键在于我们建立了一种可靠的定量检测方法，用于评估初始态与始发态多能性之间的转变。该检测方法的建立经历了对细胞接种密度、抑制剂孵育时间以及免疫印迹条件的多次反复优化。
小分子方法在治疗性胚胎干细胞（ESC）应用中的合理使用正受到越来越多的关注15,16。小分子筛选的一个主要优势在于，工具化合物被设计和/或修饰以实现高效的细胞摄取，因此转染效率不再成为限制因素，也无需使用慢病毒等具有潜在危害的递送系统。此外，抑制剂通常可同时抑制激酶家族中的多个同工型（例如 Fgfr1-4、Jak1-3），从而克服了RNA干扰和CRISPR/Cas9等遗传学或基因组干扰技术因功能冗余而面临的局限性。随着来自学术界和制药行业药物发现项目中越来越多高效且具有选择性的工具化合物的出现，那些研究较少、功能尚不明确的激酶将被推向ESC研究的前沿。因此，我们提出，这种高通量筛选方法将为探索核心ESC调控网络开辟新的研究途径。
该技术的一个微小局限在于，即使是最有效且最具选择性的小分子抑制剂，在体内也会结合并抑制多个不相关的激酶。in vivo。然而，随着激酶抑制剂谱型数据日益全面，激酶抑制剂的功能性靶点能够被快速识别（http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan；http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase-inhibitors）。最后，原则上，我们的平台可应用于任何具备高质量免疫印迹抗体的小分子化合物库和/或细胞检测体系。这将有助于研究多条参与多能性调控的调节通路，并促进发现可调控多种细胞过程的小分子抑制剂。具体而言，我们预计应用新兴的小分子化合物库，例如结构基因组联盟（Structural Genomics Consortium）正在开发的表观遗传探针（http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics），有望揭示更多调控多能性转变的新型调控因子。

胚胎干细胞（ESCs）具有自我更新或分化为成体中任何细胞类型的潜能，这种特性被称为多能性1。最近的研究表明，存在发育阶段不同的多能性状态，分别称为&#34;初始态&#34;和&#34;始发态&#34;多能性2。初始态胚胎干细胞所处的发育状态类似于着床前胚胎中的细胞状态3。相比之下，始发态多能性胚胎干细胞已准备退出多能状态，并进一步分化为特定的胚胎谱系4,5。
幼稚态和始发态多能性由不同的基因调控网络标记。幼稚态多能性特征在于关键多能性转录因子的表达，如 Nanog、Krueppel样转录因子（Klfs）、Rex12 和 Esrrb6在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中， primed 多能性表现为 naïve 多能性标志物的表达降低，并具有特定的基因表达特征，其中包括从头DNA甲基转移酶 Dnmt3b 的表达7. 在体，已启动的多能性植入后上胚层干细胞（EpiSCs）4,5 此外表达上胚层标志物 Fgf5 以及谱系启动标志物如 Brachyury8.
mESCs 为研究调控 naive-primed 多能性转换的机制提供了可操作的模型 体外在白血病抑制因子（LIF）和胎牛血清（FBS）培养条件下，小鼠胚胎干细胞（mESCs）在 naive 和 primed 多能性状态之间发生动态转换9,10LIF-Jak-Stat3 信号通路的功能是促进一种初始态基因调控网络11，而通过成纤维细胞生长因子4（Fgf4）Erk1/2通路的自分泌信号则驱动向始发态的转变12然而，系统地评估蛋白激酶在决定不同多能性状态中的作用仍是一个挑战。
本文介绍了一种定量且可扩展的平台，可用于对调控多能性从初始态向始发态转变的激酶相关小分子进行靶向筛选。我们采用简单的小鼠胚胎干细胞（mESC）培养条件，结合常规试剂、材料和设备，发现并验证了若干激酶抑制剂具有此前未被充分认识的维持初始态多能性的能力。此外，我们还探讨了该技术潜在的拓展应用，包括用于筛选其他小分子化合物库，例如新兴的靶向表观遗传调控因子的抑制剂文库。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;mESC 培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCE mESC</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;nbsp;SCRC-1023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>终浓度：2 mM</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>终浓度：50 U/mL</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>终浓度：0.1 mM</td></tr><tr><td>白血病抑制因子（GST 融合蛋白）</td><td>MRC-PPU 试剂与服务</td><td></td><td>终浓度：100 ng/mL</td></tr><tr><td>白血病抑制因子</td><td>Thermo</td><td>PMC9484</td><td>终浓度：100 ng/mL</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>终浓度：0.1 mM</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>终浓度：1 mM</td></tr><tr><td>KnockOut 血清替代物</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>终浓度：5%</td></tr><tr><td>限定型胎牛血清</td><td>Fisher</td><td>10703464</td><td>终浓度：10%</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组织培养材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红</td><td>Thermo</td><td>25300054&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>猪皮明胶</td><td>Sigma</td><td>1890</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96 孔微孔板</td><td>Thermo</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>不含钙、镁的 DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>V 型底 96 孔板</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651261</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;裂解缓冲液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris 缓冲液</td><td>VWR</td><td>103157P</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>VWR</td><td>97061</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>1% NP-40</td><td>Sigma</td><td>9016-45-9</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma</td><td>D6750-100g</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-甘油磷酸钠</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>焦磷酸钠</td><td>Sigma</td><td>13472-36-1</td><td></td></tr><tr><td>氟化钠</td><td>Sigma</td><td>450022</td><td></td></tr><tr><td>正钒酸钠</td><td>Sigma</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Roche 完全蛋白酶抑制剂混合片剂</td><td>Sigma</td><td>CO-RO</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>Sigma</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Marvel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;蛋白质印迹&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protran BA 85 硝酸纤维素膜，0.45 &amp;micor;M&amp;nbsp; 孔径（20 cm × 20 cm 片，25 片装）</td><td>GE</td><td>10401191</td><td></td></tr><tr><td>丽春红 S</td><td>Sigma</td><td>P7170-1L</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;实验设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minifold I 系统</td><td>GE</td><td>10447850</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc 成像仪</td><td>BioRad</td><td>1708280&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LiCor Odyssey 成像仪</td><td>LiCor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 Nanog 抗体</td><td>Reprocell</td><td>RCAB001P</td><td></td></tr><tr><td>抗 Dnmt3b 抗体</td><td>Imgenex</td><td>IMG-184A</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW 驴抗兔二抗</td><td>Licor</td><td>926-32213</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 HRP 二抗</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>抗 Klf2 抗体</td><td>Millipore</td><td>09-820</td><td></td></tr><tr><td>抗 Klf4 抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF3158</td><td></td></tr><tr><td>抗 Oct4 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td></td></tr></tbody></table>

通过高通量抑制剂筛选鉴定调控胚胎干细胞多能性的激酶的简易方法

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

胚胎干细胞（ESCs）能够自我更新或分化为所有类型的细胞，这种现象被称为多能性。目前已描述了不同的多能性状态，分别称为&#34;初始态&#34;和&#34;始发态&#34;多能性。关于调控初始态与始发态转换的机制，目前仍知之甚少。特别是对于决定初始态和始发态多能性状态的蛋白激酶，尽管目前已有越来越多高质量的工具化合物可用于探究激酶功能，但相关知识依然匮乏。本文中，我们介绍一种可扩展的平台，用于在小鼠胚胎干细胞中针对调控初始态-始发态多能性转换的激酶进行靶向小分子筛选。该方法利用简单的细胞培养条件以及常规的试剂、材料和设备，发现并验证对多能性具有此前未被认识作用的激酶抑制剂。我们还讨论了该技术的潜在应用，包括筛选其他小分子文库，例如日益复杂的激酶抑制剂以及新兴的表观遗传学工具化合物文库。

利用本文所述方法（图1），我们对包含228种高效且高选择性激酶抑制剂的LINCS文库进行筛选，以鉴定能够调控小鼠胚胎干细胞（mESC）多能性的化合物。该文库以0.1 mM浓度制备，经1:100稀释后，在mESC中的最终筛选浓度为1 µM。48小时后，裂解mESC并制备蛋白提取物，用于通过定量点印迹分析Nanog和Dnmt3b的表达水平（图2，上图）。为简洁起见，此处未展示其他筛选浓度的结果。针对每种激酶抑制剂计算Nanog与Dnmt3b的比值，并据此对化合物进行排序，同时设定2倍截断值（图2，下图）。将各抑制剂处理组中Nanog和Dnmt3b总信号相对于对照组的相对量叠加至排序结果中，并应用0.5倍截断值，以排除对mESC具有显著毒性的抑制剂。选择可稳定原始态（naïve state）的激酶抑制剂，通过传统的Nanog/Dnmt3b免疫印迹实验进行验证（图3）。这些抑制剂的主要激酶靶点列于表1中。我们还展示了该筛选方法在鉴定可稳定始发态（primed state）抑制剂方面的适用性14。
<img alt="图1" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig1.jpg" /> 
图1：筛选调控初始态-启动态转换的激酶抑制剂的工作流程。 将mESC用含有228种化合物的激酶抑制剂文库处理，终浓度为1 µM。制备细胞裂解液并转移至硝酸纤维素膜上进行免疫点印迹分析，检测Nanog和Dnmt3b的水平（图例改编自Williams et al.14）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig2.jpg" /> 
图2：初始态-始发态多能性筛选分析及抑制剂鉴定。（上图）代表性 Nanog 和 Dnmt3b 免疫点印迹图像。（下图）每种激酶抑制剂的 Nanog 和 Dnmt3b 值均相对于 DMSO 对照组进行归一化处理，计算 Nanog:Dnmt3b 比值及总的相对 Nanog+Dnmt3b 信号强度，并据此对抑制剂进行排序，与 DMSO 对照组进行比较。筛选出使 Nanog:Dnmt3b 比值相对于 DMSO 对照组变化超过2倍阈值（上调或下调）的抑制剂，作为驱动初始态或多能性始发态转变的候选分子。设定低于 DMSO 对照组2倍的阈值，以排除影响小鼠胚胎干细胞（mESC）存活的抑制剂。用于进一步验证的抑制剂已高亮标出。（图改编自 Williams et al.14）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig3.jpg" /> 
图3：所鉴定出的部分命中化合物的验证结果。 将小鼠胚胎干细胞（mESCs）分别用1 µM AZD4547（一种选择性FGFR抑制剂）或图2筛选中鉴定出的指定抑制剂处理，随后通过标准SDS-PAGE及免疫印迹分析检测Nanog:Dnmt3b水平。相对Nanog:Dnmt3b和Nanog+Dnmt3b的数值列于下方表格中，其中可稳定原始多能状态的抑制剂以绿色标出。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>化合物</td>
			<td colspan="2">主要靶点</td>
			<td>其他靶点</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AV-951</td>
			<td colspan="2">VEGFR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HG-6-64-01</td>
			<td colspan="2">ABL、BRAF、RET、CSF1R、EGFR、EPHA8、FGFR、FLT3、KIT、LOK、MAP4K1、p38b、MUSK、PDGFR、TAOK3、TNNI3K&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WH-4-023</td>
			<td colspan="2">Lck</td>
			<td>Src</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R406</td>
			<td colspan="2">Syk</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GW-572016</td>
			<td colspan="2">HER2</td>
			<td>EGFR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIN001-244</td>
			<td colspan="2">PDK1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WZ-4-145</td>
			<td colspan="2">CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WZ-7043</td>
			<td colspan="2">CSF1R, DDR1, FGFR 和 TAO1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GW786034</td>
			<td colspan="2">VEGFR1</td>
			<td>VEGFR2, VEGFR3&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZD-1480</td>
			<td colspan="2">JAK2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：筛选出的命中化合物及其主要激酶靶点。

本文介绍了一种定量且可扩展的方案，用于对调控 naive-primed 多能性转换的激酶相关小分子进行靶向筛选。

胚胎干细胞（ESCs）能够自我更新或分化为所有类型的细胞，这种现象称为多能性。已发现存在不同的多能性状态……

本筛选实验的总体目标是鉴定能够调节胚胎干细胞多能性的小分子蛋白激酶抑制剂。该方法可通过识别调控胚胎干细胞多能性的新型蛋白激酶信号通路，帮助解答胚胎干细胞信号转导领域中的关键科学问题。因此，该技术的主要优势在于，利用常规实验室设备和 readily available 试剂即可相对简便地开展筛选。当我们意识到关于多能性信号通路的大多数研究完全忽略了激酶组中的大量激酶时，我们首次提出了该方法的构想。通过向10厘米培养皿中加入5毫升0.1%明胶，制备明胶包被的10厘米培养皿。在室温孵育5分钟后，吸除明胶溶液，并让培养皿干燥2分钟。然后，将任何标准的小鼠胚胎干细胞系接种至包被的培养皿中，使用含有100纳克/毫升GST标签LIF、10%胎牛血清和5%Knockout血清替代物的标准小鼠胚胎干细胞培养基。在37摄氏度、5%CO2条件下培养细胞，每天更换培养基。每两天传代一次小鼠胚胎干细胞，当细胞融合度达到约80%时，吸除培养基，并用每皿5毫升的磷酸盐缓冲液洗涤。然后，每孔小鼠胚胎干细胞加入1毫升胰蛋白酶EDTA溶液，在37摄氏度孵育10分钟。孵育结束后，用4毫升培养基重悬消化后的细胞，并在1200转/分钟下离心5分钟。将所得细胞沉淀用5毫升培养基充分重悬，反复吹打以形成单细胞悬液。将10微升细胞悬液与10微升台盼蓝混合后计数细胞。将混合液加入细胞计数板，或使用血细胞计数板和光学显微镜进行计数。随后，用多通道移液器将3000个小鼠ES细胞接种至经0.1%明胶包被的96孔板中，每孔终体积为100微升培养基。然后，使用多通道移液器以1:100的稀释比例加入激酶抑制剂。轻轻吹打培养基，以充分混匀抑制剂与细胞悬液。随后，将细胞置于组织培养超净台中静置1小时，以确保细胞在培养表面均匀分布。将细胞培养 48 小时，期间不更换培养基。开始筛选分析时，使用多通道移液器和移液管，用 200 微升 PBS 清洗 96 孔小鼠 ES 细胞板。清洗后，在 150 微升裂解缓冲液中混合细胞裂解物。在V型底96孔板中，以1500 × g离心30分钟澄清提取物。随后，使用96孔真空点印迹装置将100 µL上清液固定于硝酸纤维素膜上。将膜干燥后，用40 mL Ponceau S染色，以确认转移的一致性。用 TBST 洗涤膜后，在含 3% 脱脂奶粉的 TBST 中封闭。然后，将膜与 Nanog 和 Dnmt3b 抗体按 1:1000 的稀释比例在封闭缓冲液中 4°C 孵育过夜。次日，用 TBST 洗涤膜三次，每次 10 分钟。然后，在封闭缓冲液中用1:10,000稀释的30毫升二抗溶液孵育。使用数字免疫印迹成像系统显影膜。在继续实验之前，必须通过传统的免疫印迹法验证筛选中鉴定出的激酶抑制剂。这有助于在进一步的下游分析之前去除假阳性结果。按照文本方案中所述，分析筛选数据并验证抑制剂为真正的多能性调控因子。此处显示的是所进行筛选实验中一个具有代表性的Nanog点图。标出了可诱导始发态或多能性的阳性对照抑制剂。图中还显示了筛选实验中得到的一个代表性 Dnmt3b 点图。再次标出了可诱导始发态或多能性的阳性对照抑制剂。在此图中，根据 Nanog 与 Dnmt3b 的比值对抑制剂进行了排序。设定两倍的 Nanog 与 Dnmt3b 比值作为阈值，用于识别能够稳定 naive 或 primed 多能性的抑制剂。同时提供了 Nanog 与 Dnmt3b 信号的总和。此外，还列出了用于进一步验证的激酶抑制剂。图中展示了所选激酶抑制剂、Nanog 和 Dnmt3b 的常规免疫印迹验证结果，以及 Nanog 与 Dnmt3b 的比值和总信号强度。观看本视频后，您应能够充分了解如何鉴定可调节胚胎干细胞多能性的 小分子激酶抑制剂。一旦掌握，该技术若操作得当，可在72小时内完成。尽管该方法可帮助研究调控多能性的激酶信号通路，也可应用于胚胎干细胞分化及其他调控系统，例如表观遗传修饰因子。在完成该操作步骤后，还可使用其他小分子抑制剂文库（如靶向表观遗传修饰因子的文库），以鉴定参与多能性调控的新因子。该技术建立后，为我们的研究团队阐明新的多能性信号通路奠定了基础。我们利用该技术鉴定出扩增通路在调控多能性方面的新功能。

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科研

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