Name: 体外成像和荧光标记的GnRH类似物的药物靶向性的定量分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 学习使用荧光标记的GnRH类似物结合共聚焦显微镜和流式细胞术，定量分析人类癌细胞对靶向药物的吸收效率，为抗癌治疗研究提供重要方法学支持。

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该项目由国家研究基金OTKA（K 104045）资助。

1. 细胞培养物与试剂的准备
<ol>
	<li>按照制造商推荐的培养基培养细胞，并添加10%（v/v）胎牛血清和抗生素（称为完全培养基）。将细胞培养瓶置于37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中培养。使用倒置显微镜（配备10倍相差物镜）观察细胞增殖和汇合情况。</li>
	<li>当细胞达到适当汇合度时，吸除培养基，用2–3 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。吸除PBS后，向培养瓶中加入0.5 mL无菌的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C孵育至细胞脱落（约10分钟）。</li>
	<li>用3–4 mL无菌完全培养基重悬细胞以终止胰蛋白酶作用，并将细胞悬液转移至无菌离心管中。在室温（RT）下以150 × g离心4分钟。小心弃去上清液，将沉淀用2–3 mL无菌完全培养基重悬。</li>
	<li>取100 µL细胞悬液与100 µL 0.4%（m/V）台盼蓝溶液混合，以染色死细胞。取10 µL该混合液加入血细胞计数板，使用倒置显微镜计数活细胞数量。</li>
	<li>将步骤1.3制备的细胞悬液用无菌完全培养基稀释至10 mL，调整浓度为4 × 104 个细胞/mL。</li>
	<li>将步骤1.5制备的细胞悬液每孔250 µL（每孔104 个细胞）加入第一张玻璃底8孔载玻片的七个孔中。该载玻片用于促性腺激素释放激素（GnRH）摄取实验。</li>
	<li>将步骤1.5制备的细胞悬液每孔250 µL（每孔104 个细胞）加入第二张8孔载玻片的五个孔中。该载玻片用于GnRH-I-R表达实验。</li>
	<li>将步骤1.5制备的细胞悬液每孔1 mL（每孔4 × 104 个细胞）加入12孔板的七个孔中。该板用于GnRH定量实验。</li>
	<li>让细胞在两张载玻片和12孔板中贴壁。将它们置于37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中孵育48小时。</li>
	<li>孵育结束后，使用倒置显微镜（配备10倍相差物镜）检查细胞状态。若细胞生长良好且已贴壁，则继续后续操作。</li>
	<li>使用二甲基亚砜（DMSO）配制三种偶联物的10 mM GnRH-FITC储备液18。（使用以下稀释浓度：16.43 µg/µL [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I、16.97 µg/µL [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II 和 16.47 µg/µL [Lys8(FITC)]-GnRH-III）。将这些储备液避光保存于室温，并在数周内使用完毕。</li>
	<li>分别取三种10 mM GnRH-FITC储备液各1.7 µL，加入1.7 mL完全培养基中稀释。充分震荡混匀（此为10 µM GnRH-FITC处理液）。再分别取三种10 µM GnRH-FITC处理液各150 µL，加入1.35 mL完全培养基中稀释，同样震荡混匀（此为1 µM GnRH-FITC处理液）。 
	注意：所有含GnRH-FITC的处理液均需避光，且在数小时内使用完毕。</li>
	<li>将步骤1.12制备的六种GnRH-FITC处理液以及4 mL完全培养基预热至37 °C。</li>
	<li>将5 mM荧光探针溶液（材料列表中提及的核复染试剂）3 µL加入3 mL PBS中稀释至5 µM。该溶液需避光，室温保存，并在数小时内使用完毕。</li>
</ol>
2. 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）
<ol>
	<li>GnRH 摄取方法
	<ol>
		<li>取步骤 1.6 中制备的第一张显微镜载玻片，用移液器吸出每个孔中的完全培养基。向第一个孔中加入 250 µL 预热的完全培养基，作为阴性对照。向接下来的六个孔中（三个孔加 1 µM，三个孔加 10 µM）各加入 250 µL 预热的 GnRH-FITC 处理培养基（来自步骤 1.13）。将载玻片置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润培养箱中孵育 5 小时。</li>
		<li>用移液器吸出各孔中的培养基，并用 250 µL PBS 洗涤细胞。向每个孔中加入 250 µL 固定液（10% 中性缓冲福尔马林），将载玻片在室温下孵育 10 分钟。</li>
		<li>用移液器吸出各孔中的固定液，并用 250 µL PBS 洗涤细胞。向每个孔中加入 250 µL 含有步骤 1.14 中配制的 5 µM 荧光探针溶液的 PBS，在室温下孵育 10 分钟。</li>
		<li>用移液器吸出各孔中的荧光探针溶液，并小心地用 250 µL PBS 洗涤细胞两次。最后向每个孔中加入 3–4 滴封片液。将载玻片置于暗处室温保存，直至成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GnRH-I-R 表达检测方法
	<ol>
		<li>取步骤 1.7 中制备的第二张 8 孔显微镜载玻片，用移液器吸出五个孔中的完全培养基。</li>
		<li>向第一个孔中加入 250 µL 预热的完全培养基，作为阴性对照。向第二个孔中也加入 250 µL 预热的完全培养基，用于检测 GnRH 处理前的 GnRH-I-R 表达水平。</li>
		<li>向接下来的三个孔中各加入 250 µL 预热的 10 µM GnRH-FITC 处理培养基。利用这三个孔在检测 GnRH-I-R 表达前对细胞进行 GnRH-FITC 共轭物预处理。将载玻片置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润培养箱中孵育 1 小时。</li>
		<li>用移液器吸出将用于检测 GnRH 处理后 GnRH-I-R 表达的三个孔中的处理培养基，并用 250 µL 预热的完全培养基洗涤这些孔。向这三个孔中各加入 250 µL 预热的完全培养基。将载玻片置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润培养箱中再孵育 1 小时。</li>
		<li>用移液器吸出五个孔中的培养基，并用 250 µL PBS 洗涤细胞。向每个孔中加入 250 µL 固定液，在室温下孵育 10 分钟。</li>
		<li>用移液器吸出各孔中的固定液，并用 250 µL PBS 洗涤细胞。向每个孔中加入 250 µL 含有 5% 牛血清白蛋白（BSA）封闭液的 PBS，在室温下孵育 1 小时。</li>
		<li>将 10 µL GnRH-I-R 一抗用 1 mL PBS 稀释（1:100 比例）。置于室温保存，并在数小时内使用完毕。</li>
		<li>除阴性对照孔（第一个孔）外，用移液器吸出其余各孔中的 BSA 封闭液，并用 250 µL PBS 洗涤细胞（阴性对照孔除外）。向各孔（阴性对照孔除外）中加入 250 µL 含步骤 2.2.7 中配制的 GnRH-I-R 一抗的 PBS。将载玻片置于暗处室温孵育 1 小时。</li>
		<li>将 2.5 µL Alexa 546 标记的二抗用 1.25 mL PBS 稀释（1:500 比例）。 
		注意：该溶液需避光保存，置于室温，并在数小时内使用完毕。</li>
		<li>用移液器吸出五个孔中的溶液，并用 250 µL PBS 洗涤细胞。向每个孔中加入 250 µL 含步骤 2.2.9 中配制的 AF 546 标记二抗的 PBS。将载玻片置于暗处室温孵育 1 小时。</li>
		<li>用移液器吸出各孔中的溶液，并用 250 µL PBS 洗涤细胞。向每个孔中加入 250 µL 含步骤 1.14 中配制的 5 µM 荧光探针溶液的 PBS，在室温下孵育 10 分钟。</li>
		<li>用移液器吸出各孔中的荧光探针溶液，并小心地用 250 µL PBS 洗涤细胞两次。随后向每个孔中加入 3–4 滴封片液。将载玻片置于暗处室温保存，直至显微成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像
	<ol>
		<li>使用倒置共聚焦激光扫描显微镜（采用 63X 油镜）对细胞进行成像
		<ol>
			<li>使用以下激发/发射波长：GnRH 共轭物：488/514 nm；Alexa 546 标记抗体：488/546 nm（仅用于 GnRH-I-R 表达检测方法）；Draq5 荧光探针：633/680 nm。</li>
			<li>使用阴性对照细胞设定成像参数，并用这些参数对处理组细胞进行成像（图 3）。每次分析开始时，需在每张显微镜载玻片上重新调整成像参数。必要时使用设备制造商提供的软件对图像进行微调并导出。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 荧光激活细胞分选（FACS）
<ol>
	<li>GnRH 定量方法
	<ol>
		<li>取步骤 1.8 中制备的培养板，用移液器吸出七个孔中的全部培养基。向第一个孔中加入 1 mL 预热的完全培养基，作为阴性对照。向接下来的六个孔中分别加入 1 mL 预热的处理培养基（三个孔加入 1 µM，另三个孔加入 10 µM）。将培养板置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润化培养箱中孵育 5 小时。</li>
		<li>用移液器吸出各孔中的培养基。用 2 mL PBS 小心清洗细胞两次。向每个孔中加入 500 µL 胰蛋白酶-EDTA 溶液。将培养板在 37 °C 孵育，直至细胞脱落（约 10 分钟）。</li>
		<li>向每个孔中加入 1 mL 完全培养基以终止胰蛋白酶作用。轻轻摇动培养板。用移液器轻柔地重悬细胞，并将每个孔中的细胞悬液转移至流式管中。在 4 °C 条件下，以 150 × g 离心 4 分钟。</li>
		<li>小心一次性倾倒上清液。向每根流式管中加入 500 µL 冰冷的 PBS，并轻柔地重悬细胞。将流式管置于冰上，直至实验结束。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析与计算
	<ol>
		<li>通过流式细胞术分析细胞。激发波长使用 488 nm 氩激光，检测波长使用 530 nm。先运行阴性对照细胞以设定流式细胞仪参数，并使用该参数分析处理组细胞（图 4A）。使用仪器厂商提供的软件分析数据，确定中位荧光强度（MFI）值，并计算相对 MFI 值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2227-9059/4/2/11">Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells.</a> Biomedicines. 4 (2), 11(2016).</li>
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<li>Manea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+antitumour+effect+of+daunorubicin-GnRH-III+derivative+conjugates+on+colon+carcinoma-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Anti-Cancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">In-vivo antitumour effect of daunorubicin-GnRH-III derivative conjugates on colon carcinoma-bearing mice.</a> Anti-Cancer Drugs. 23 (1), 90-97 (2012).</li>
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<li>Olberg, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+in+vitro+evaluation+of+small-molecule+%5B18F%5D+labeled+gonadotropin-releasing+hormone+%28GnRH%29+receptor+antagonists+as+potential+PET+imaging+agents+for+GnRH+receptor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthesis and in vitro evaluation of small-molecule [18F] labeled gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor antagonists as potential PET imaging agents for GnRH receptor expression.</a> Bioorg Med Chem Lett. 24 (7), 1846-1850 (2014).</li>
<li>Zoghi, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.degruyter.com/view/j/ract.2016.104.issue-4/ract-2015-2443/ract-2015-2443.xml">Development of a Ga-68 labeled triptorelin analog for GnRH receptor imaging.</a> Radiochimica Acta. 104 (4), 247-255 (2016).</li>
<li>Guo, H., Gallazzi, F., Sklar, L. A., Miao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+indium-111-labeled+gonadotropin-releasing+hormone+peptide+for+human+prostate+cancer+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">A novel indium-111-labeled gonadotropin-releasing hormone peptide for human prostate cancer imaging.</a> Bioorg Med Chem Lett. 21 (18), 5184-5187 (2011).</li>
<li>Nederpelt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+12+GnRH+peptide+agonists+-+A+kinetic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Characterization of 12 GnRH peptide agonists - A kinetic perspective.</a> Br J Pharmacol. 173 (1), 128-141 (2016).</li>
<li>Szabo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+in+vitro+biological+evaluation+of+daunorubicin+containing+GnRH-I+and+GnRH-II+conjugates+developed+for+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparative in vitro biological evaluation of daunorubicin containing GnRH-I and GnRH-II conjugates developed for tumor targeting.</a> J Pept Sci. 21 (5), 426-435 (2015).</li>
<li>Leurs, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GnRH-III+based+multifunctional+drug+delivery+systems+containing+daunorubicin+and+methotrexate%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">GnRH-III based multifunctional drug delivery systems containing daunorubicin and methotrexate.</a> Eur J Med Chem. 52, 173-183 (2012).</li>
<li>Murányi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+characterization+and+systematic+comparison+of+FITC-labelled+GnRH-I%2C+-II+and+-III+analogues+on+various+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">Synthesis, characterization and systematic comparison of FITC-labelled GnRH-I, -II and -III analogues on various tumour cells.</a> J Pept Sci. 22 (8), 552-560 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述实验采用选择性标记的GnRH类似物筛选贴壁细胞 细胞培养 体外共聚焦显微镜和流式细胞术可用于以时间和浓度依赖的方式追踪并定量这些GnRH-FITC偶联物的细胞摄取。这些实验包含以下关键步骤：1）维持无菌且健康的细胞培养环境；2）GnRH肽必须具有高纯度；3）采用合理的浓度和孵育时间；4）处理与洗涤步骤；5）仪器参数需经过良好优化。
细胞在制造商推荐的培养基中培养，培养基中添加10%（V/V）胎牛血清和抗生素（完全培养基）。在处理步骤（使用GnRH-FITC偶联物）之前，细胞应始终保持并操作于无菌环境中。实验前，使用倒置显微镜检查细胞，细胞应状态良好、贴壁生长，并达到所需的数量。
使用高纯度和高质量的促性腺激素释放激素（GnRH）肽至关重要。我们合成了这些肽，并将其纯化至纯度超过98%18。肽可作为冻干粉末在-25 °C冰箱中保存。DMSO中的10 mM GnRH-FITC储备溶液应避光、室温保存，并在数周内使用完毕。我们研究了这些偶联物...

近年来，基于肽的靶向药物递送系统已成为癌症治疗领域发展迅速且极具前景的研究方向1,2。人类促性腺激素释放激素受体I型（GnRH-I-R）主要位于垂体，但也存在于其他多种与自身繁殖相关的组织中3。GnRH-I-R在多种癌症组织中均有表达，无论其是否与生殖系统相关4,5。相较于正常组织，多种恶性肿瘤细胞表面GnRH-I-R的高表达为靶向治疗提供了可行机会5,6。
近几十年来，已开发出多种促性腺激素释放激素（GnRH）类似物，可用作靶向基团7,8,9。这些肽类能够将抗癌药物高选择性地递送至过表达GnRH-I-R的恶性肿瘤细胞6。已有多个报道显示，与相应的未偶联游离药物相比，GnRH偶联的抗肿瘤药物具有更高的选择性和更好的疗效7,8,9。
关于GnRH肽及其受体的既往研究报道指出，GnRH-I-R可呈现多种构象，对不同的GnRH类似物具有不同的选择性10。 高度可变的GnRH-I-R具有复杂且多样的信号通路，对天然及人工配体表现出不同的活性11。这些特性使得基于GnRH的系统研究具有挑战性。另一方面，它们也具有良好的治疗潜力。此前已有若干使用放射性标记GnRH肽的实验报道12,13,14,15，但使用荧光标记GnRH类似物的实验仍较为有限。尽管放射性标记具有高灵敏度，荧光标记仍具备多项优势，例如操作更简便，以及可与不同荧光染料进行复染。三种常用于药物递送的GnRH类似物为[D-Lys6]-GnRH-I、[D-Lys6]-GnRH-II和GnRH-III，但这些肽段作为靶向基团的有效性很少被直接比较16,17。另一方面，使用不同癌细胞和不同GnRH类似物的独立实验所得结果差异较大。
基于上述考虑，我们聚焦于这些促性腺激素释放激素（GnRH）肽的肿瘤靶向和药物递送潜力，从而合成并表征了[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I、[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II和[Lys8(FITC)]-GnRH-III肽偶联物18。这些类似物在Lys或D-Lys侧链上选择性地标记了FITC（每种偶联物中肽与FITC的比例为1:1）。其设想是，这种选择性荧光标记可为这些肽提供新的信息，并使其能够被有效追踪和可靠定量。这些偶联物具有安全的操作性和可靠的可检测性，便于比较它们的肿瘤靶向效率，并用于多种恶性肿瘤细胞的筛选。我们希望，利用这些肽偶联物开展的最新实验能够促进新型靶向癌症的GnRH-药物偶联物的开发，并有助于发现新的治疗靶点。
本文展示了若干可高度重复且快速的GnRH-FITC偶联物实验。GnRH受体（GnRH-R）在细胞表面的表达是影响GnRH摄取的关键条件，因此我们同时检测了各实验细胞系中GnRH-I-R在细胞表面的表达水平。我们通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对GnRH-I-R和GnRH-FITC偶联物进行可视化，并利用荧光激活细胞分选技术（FACS）对细胞摄取GnRH-FITC偶联物的情况进行定量分析。

<table><tbody><tr><td>EBC-1</td><td>JCRB 细胞库</td><td>JCRB0820</td><td>人肺鳞状细胞癌</td></tr><tr><td>BxPC-3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1687</td><td>人胰腺腺癌</td></tr><tr><td>Detroit-562</td><td>ATCC</td><td>CCL-138</td><td>人咽癌</td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基（含 L-谷氨酰胺）</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F</td><td>BxPC-3 细胞培养用培养基</td></tr><tr><td>伊格尔最低必需培养基</td><td>Lonza</td><td>BE12-611F</td><td>EBC-1 细胞培养用培养基，Detroit-562 细胞培养时补充 0.1% 丙酮酸钠</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Euro Clone</td><td>ECS0180L</td><td>补充培养基</td></tr><tr><td>MycoZap Plus-CL&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>VZA-2012</td><td>补充培养基（抗生素）</td></tr><tr><td>标准细胞培养瓶</td><td>VWR</td><td>10062-872</td><td>为细胞提供稳定、无菌的生长环境</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 混合液&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td>消化贴壁细胞</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>[D-Lys&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;(FITC)]-GnRH-I</td><td>自制</td><td>-</td><td>纯度 &amp;ge;98%（HPLC）</td></tr><tr><td>[D-Lys&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;(FITC)]-GnRH-II</td><td>自制</td><td>-</td><td>纯度 &amp;ge;98%（HPLC）</td></tr><tr><td>[Lys&lt;sup&gt;8&lt;/sup&gt;(FITC)]-GnRH-III</td><td>自制</td><td>-</td><td>纯度 &amp;ge;98%（HPLC）</td></tr><tr><td>玻璃底 8 孔显微镜载片</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>用于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）实验</td></tr><tr><td>Corning Costar 细胞培养板，12 孔</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3513-50EA</td><td>用于流式细胞术（FACS）实验</td></tr><tr><td>固定液（10% 中性缓冲福尔马林）</td><td>Bio-Optica</td><td>01V60P</td><td>固定贴壁细胞</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-10G</td><td>防止抗体非特异性结合</td></tr><tr><td>GnRHR 抗体</td><td>Proteintech</td><td>19950-1-AP</td><td>免疫细胞化学试剂，结合人 I 型 GnRH 受体</td></tr><tr><td>二抗，Alexa Fluor 546 标记</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11035</td><td>免疫细胞化学试剂，结合一抗</td></tr><tr><td>荧光探针溶液（Draq5）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62254</td><td>细胞核复染</td></tr><tr><td>Fluoromount 水性封片介质</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680-25ML</td><td>用于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）实验，保持荧光信号</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Elektro-Optika Ltd.&amp;nbsp;</td><td>Alpha XDS-2T</td><td>观察细胞形态及汇合度</td></tr><tr><td>倒置共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM-710</td><td>用于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）实验</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSCalibur</td><td>用于流式细胞术（FACS）实验</td></tr></tbody></table>

体外成像与荧光标记gnrh类似物药物靶向效率的定量分析

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

GnRH类似物是有效的靶向基团，能够将抗癌药物选择性地递送至高表达GnRH受体的恶性肿瘤细胞。然而，目前针对GnRH类似物的细胞摄取定量分析及其在基于GnRH的药物递送系统中所研究的细胞类型仍较为有限。此前已报道的选择性标记的荧光GnRH I、-II和-III衍生物具有良好的可检测性，并具备适合进行可重复且稳健实验的化学特性。我们还发现，采用这些标记的GnRH类似物结合适当的现代方法，可为基于GnRH的药物递送系统提供新的信息。本文介绍了一些简单且快速的实验方法，用于研究[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I、[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II和[Lys8(FITC)]-GnRH-III在EBC-1（肺）、BxPC-3（胰腺）和Detroit-562（咽）恶性肿瘤细胞中的细胞摄取情况。同时，利用共聚焦激光扫描显微镜，在GnRH处理前后检测了这些细胞系表面GnRH-I受体的表达水平。GnRH-FITC偶联物的细胞摄取通过荧光激活细胞分选进行定量。实验结果显示，不同GnRH类似物之间的差异较小，而不同细胞类型之间的差异显著。细胞系间的显著差异与其细胞表面GnRH-I受体表达水平的不同密切相关。所介绍的实验提供了实用的方法，可在多种贴壁细胞培养体系中以时间和浓度依赖的方式可视化、定量并比较GnRH-FITC偶联物的摄取效率。这些结果可预测GnRH偶联物在特定细胞培养体系中的药物靶向效率，并为进一步研究基于GnRH的药物递送系统提供良好的基础。

通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）获得的图像能够以时间和浓度依赖的方式，直观展示特定细胞培养体系中GnRH-FITC偶联物的摄取情况。与此同时，该CLSM实验也可验证细胞表面是否存在GnRH-I-R。此外，通过使用远红光DNA染色荧光探针，可在观察GnRH及GnRH-I-R的同时对细胞核进行共染色。然而，尽管共聚焦图像本身难以进行定量分析，但采用简单的“GnRH摄取法”即可快速评估待测细胞中GnRH-FITC偶联物含量的高低。本方法中所使用的GnRH-FITC偶联物种类、浓度及处理时间均可根据实验需求灵活调整。如图1所示，不同类型的癌细胞在浓度依赖条件下对GnRH-FITC的摄取水平存在差异。
先进的“GnRH-I-R表达方法”描述了在GnRH-FITC处理前后，通过免疫细胞化学法对细胞表面GnRH-I-R进行可视化。该方法的第一部分（GnRH-FITC处理前）是指在未进行GnRH-FITC处理的情况下，通过免疫细胞...

选择性标记的荧光GnRH-I、-II和-III衍生物是追踪和定量其细胞摄取的可靠工具。 本文介绍了在多种细胞系中可视化、定量和比较这些GnRH偶联物摄取效率的实验方法。

体外成像与荧光标记GnRH类似物药物靶向效率的定量分析

GnRH类似物是有效的靶向分子，能够将抗癌药物选择性地递送至高表达GnRH的恶性肿瘤细胞。

本实验的总体目标是研究并预测基于GnRH的药物递送系统在人类癌细胞培养中的有效性。该方法有助于回答靶向抗癌治疗领域中的关键问题，例如不同人类癌症类型的细胞对GnRH靶向抗癌药物的摄取效率如何。该方法的主要优势在于使用了新型荧光标记的GnRH类似物，可同时进行共聚焦显微镜和流式细胞术分析。该技术在抗癌治疗方面具有重要意义，因为促性腺激素释放激素（GnRH）受体在多种癌细胞类型上高表达，从而能够实现对这些细胞的特异性靶向。本次实验操作将由我实验室的博士研究生 Bianka Gurbi 进行演示。首先，从已接种细胞的显微镜载玻片的七个孔中分别移除培养液。然后，向阴性对照孔中加入 250 微升预热的完全培养基，向其余六个孔中各加入 250 微升预热的 GnRH fit 种子处理培养基。将玻片置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中孵育 5 小时。孵育 5 小时后，吸去各孔中的培养基，并用 250 微升 PBS 洗涤细胞。随后，向每个孔中加入 250 微升固定液，在室温下孵育载玻片 10 分钟。细胞固定后，弃去固定液，并用 250 微升 PBS 洗涤细胞。向每个孔中加入 250 微升用 PBS 配制的 5 微摩尔荧光探针溶液，在室温下孵育载玻片 10 分钟。移除荧光探针溶液后，用 250 µL PBS 小心清洗细胞两次。最后，向每个孔中加入三到四滴封片剂。将载玻片置于室温避光处保存，直至在显微镜下观察成像。从已接种的显微镜载玻片的五个孔中移除培养基。接着，向阴性对照孔以及未处理细胞的第二个孔中各加入 250 微升预热的完全培养基。用含有 10 微摩尔 GnRH-FITC 的预热处理培养基对剩余三个孔中的细胞进行预处理。将载玻片置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育1小时。随后，仅移除处理组细胞的培养基，并用250微升预热的完全培养基洗涤细胞。接着，移除洗涤用培养基。然后，向三个孔中各加入 250 µL 预热的完全培养基。将玻片置于 37 °C、5% 二氧化碳的培养箱中孵育 1 小时。孵育结束后，弃去全部五个孔中的培养基，并用 250 µL PBS 洗涤细胞。然后，吸除 PBS，并加入 250 微升固定液，在室温下固定细胞 10 分钟。接着，弃去固定液，用 250 微升 PBS 洗涤细胞。每孔加入 250 微升封闭液，将玻片在室温下孵育 1 小时。从除阴性对照外的每个孔中吸去封闭液。用 250 微升 PBS 洗涤细胞后，向每孔加入 250 微升一抗溶液。将玻片置于避光处，室温孵育 1 小时。从五个孔中移除溶液，并用 250 µL PBS 洗涤细胞。然后移除 PBS，加入 250 µL 二抗溶液。将载玻片在室温下避光孵育一小时。吸去每孔中的溶液，用 250 微升 PBS 洗涤细胞。去除洗涤用 PBS 后，向每孔中加入含 5 微摩尔荧光探针的 250 微升 PBS。将玻片在室温下孵育 10 分钟。从每个孔中移除荧光探针溶液，并用 250 微升 PBS 小心洗涤细胞两次。最后，向每个孔中加入三到四滴封片介质。将载玻片置于室温避光处，直至在显微镜下成像。在倒置共聚焦激光扫描显微镜下观察细胞。开启488纳米和633纳米激光器。检查激光放大倍数和针孔大小。成像阴性对照样本。优化观察到的细胞核信号，并调整 FITC 和 Alexa 546 的信号至接近零。然后，使用相同的参数对处理后的样本进行成像。弃去已接种的培养板中全部七个孔中的完全培养基。然后，向阴性对照孔中加入一毫升预热的完全培养基，向其余六个孔中各加入一毫升预热的处理用培养基。将培养板置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中孵育五小时。弃去所有孔中的培养基后，用两毫升 PBS 轻轻洗涤细胞两次。移除 PBS，然后每孔加入 500 微升胰蛋白酶 EDTA 溶液。将培养板置于 37 摄氏度孵育，直至细胞脱落，大约需要 10 分钟。用一毫升完全培养基中和每个孔中的胰蛋白酶，并震荡培养板。随后通过轻柔吹打重悬细胞。将细胞悬液转移至不同的 FACS 管中，在 4°C 条件下以 150 × g 离心 4 分钟。小心倾去上清液。然后，向每根FACS管中加入500微升预冷的PBS，轻轻重悬细胞。将FACS管置于冰上，待FACS分析。本文展示了促性腺激素释放激素（GnRH）在咽癌细胞中的摄取分析。使用一微摩尔荧光标记的GnRH复合物处理细胞5小时后，可在咽癌细胞中观察到微弱但可分辨的绿色荧光信号，表明GnRH被轻微摄取。进一步增加复合物剂量可增强细胞摄取，表明咽癌细胞对GnRH的摄取具有剂量依赖性。通过同时使用荧光标记的GnRH复合物处理，并对肺癌细胞中的一型GnRH受体及细胞核进行染色，分析了GnRH的受体依赖性摄取及其配体在受体中的细胞内分布。结果显示，一型GnRH受体定位于细胞膜，而GnRH蛋白则被细胞内化并保留在细胞质中。此外，还采用流式细胞术（FACS）分析研究了咽癌细胞对GnRH的摄取情况。结果显示，当细胞用1 µM的GnRH偶联物处理时，GnRH的摄取量在剂量增加至10 µM时显著增强。若操作得当，掌握该技术后可在八小时内完成实验。在进行该实验时，需注意避免处理后的样品和荧光染料暴露于直射光线下。采用此方法后，还可进行细胞活力或细胞凋亡检测等其他实验，以回答更多问题，例如靶向GnRH的药物抑制特定类型癌症生长的效率如何。该技术的建立为癌症治疗领域的研究人员探索基于GnRH的药物递送系统在黏附癌细胞中的有效性铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用这些荧光标记的GnRH偶联物来研究癌细胞对GnRH靶向治疗的敏感性。

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体外成像与荧光标记GnRH类似物药物靶向效率的定量分析

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