Name: 该WinCF模式 - 粘液的廉价和易于处理的缩影细支气管堵塞，研究肺部感染的微生物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: 了解WinCF系统如何模拟肺部环境以研究囊性纤维化等慢性气道疾病中的微生物群落。该方法利用人工痰液培养基和毛细管建立氧梯度，便于观察微生物生长、代谢及群落动态变化。

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作者谨此感谢Vertex Pharmaceuticals和囊性纤维化研究创新奖对R. Quinn的资助，以及美国国立卫生研究院/国家过敏与传染病研究所（NIH/NIAID）提供的资助项目1 U01 AI124316-01，该项目采用系统生物学方法治疗多重耐药病原体。我们还要感谢加州大学圣地亚哥分校（UCSD）机械与航空航天工程系的本科机械工程高年级设计课程，为本研究在工程方面的合作提供了支持。

1. 人工痰培养基储备液的制备
<ol>
	<li>配制5%的黏蛋白溶液。将1.0 g脱水猪胃黏蛋白加入20 mL去离子水中。对所得溶液进行高压灭菌。 
	注意：黏蛋白的灭菌会破坏其固有结构；其他对干燥形式黏蛋白进行灭菌的方法包括紫外线灭菌和辐照灭菌。然而，这些方法在WinCF系统中尚未被广泛使用。</li>
	<li>将2.2 g KCl加入50 mL去离子水中，搅拌至溶解。将5.0 g NaCl加入50 mL去离子水中，搅拌至溶解。对这两种溶液进行高压灭菌。</li>
	<li>将100 mg鲑鱼精子DNA加入10 mL无菌去离子水中。将该溶液加热至约 85 °C 在水浴中放置数小时以确保溶解。</li>
	<li>将5.0 mg的铁蛋白加入5.0 mL无菌去离子水中。</li>
</ol>
2. 人工痰液培养基的制备
<ol>
	<li>混合以下组分：16 mL 黏蛋白储备液、2.0 mL KCl 储备液、2.0 mL NaCl 储备液， 200 µL 卵黄乳剂，5.6 mL DNA 储存液 120 µL 5.78 mL 基本氨基酸溶液、5.78 mL 非必需氨基酸溶液和 2.44 mL 无菌水。
	<ol>
		<li>若出现少量沉淀，轻轻振荡混匀。</li>
		<li>将5.0 mL培养基移液至八个无菌的15 mL离心管中。 
		注意：可根据需要调整每个试管的化学条件。例如，可向各试管中添加缓冲溶液和 pH 指示剂，以比较微生物在不同 pH 水平下的行为。在代表性结果部分展示了这一操作，设置了 8 个不同的 pH 水平，分别为 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 和 8.5。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>一旦培养基的化学条件成功调控后，即可冷冻以备后续使用。培养基在 -20 °C 数月。解冻后涡旋震荡。</li>
</ol>
3. 毛细管对照实验的制备
<ol>
	<li>在无菌生物安全柜中，向八个无菌微量离心管中加入 250 µL 每种培养基各</li>
	<li>另取八个无菌的15 mL离心管，每个离心管对应步骤3.1中提到的一个微量离心管。
	<ol>
		<li>用70%乙醇溶液对一张纸巾进行灭菌，并使其干燥。干燥后，将纸巾撕成每片约四平方英寸大小的碎片，并将每片揉成团放入15 mL离心管底部。如需更多离心管，可根据需要喷洒乙醇并干燥额外的纸巾。</li>
		<li>在每个离心管底部放入一团纸巾，用约1.0 mL无菌水略微润湿每团纸巾，以创造湿润环境。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为步骤3.1中准备的每支微量离心管取三根玻璃毛细管，并准备一块毛细管密封胶泥。</li>
	<li>对于每个微量离心管，用培养基填充三根毛细管，液面距管顶端蓝色标记处约5 mm。
	<ol>
		<li>通过将毛细管的一端置于微量离心管中并倾斜至接近水平方向，利用毛细作用使培养基进入毛细管内（参见 图1).</li>
		<li>用戴着手套的手指轻轻按住管子的开口端以停止填充，然后将管子的另一端压入密封块中以封口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>
</ol>
<img alt="实验室中的微流控装置；戴手套的手持移液器和小瓶，液相色谱装置。" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：pH梯度示例，毛细管中填充人工痰液培养基。 将管子一端插入液体中并倾斜，以促进毛细作用，从而加入培养基。本示例中培养基的颜色是由于添加了pH指示剂，以帮助显示培养后酸度可能发生的改变。 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<ol start="5">
	<li>将每组三支毛细管放入盛有无菌水充分浸湿的纸巾的15 mL离心管中，毛细管封口端朝下。盖紧管盖并标记。这三支毛细管用于每个对照条件的重复实验。</li>
	<li>当所有15 mL离心管均装入指定的毛细管后，将离心管放入支架中。放置支架时应使离心管保持水平孵育状态（以捕获气泡）（参见 图2）。将毛细管放入离心管（内含湿润的纸团）中，在其中孵育 37 °C 48 小时。</li>
</ol>
<img alt="用于实验室实验设置的试管架中的试管，包含液体体积测量、化学反应过程。" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：pH梯度示例，毛细管已准备就绪用于孵育。 将三根毛细管填充并封口后，放入底部垫有湿润纸巾的离心管中。将该离心管盖好并置于试管架中。孵育期间，试管架必须如图所示侧向放置，以便孵育结束后观察气体的产生情况。 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
4. 孵育后对照毛细管的成像
<ol>
	<li>从培养箱中取出离心管架，确保离心管保持水平。小心地将毛细管从离心管中滑出，使每组三根毛细管与其他组分开。</li>
	<li>将毛细管并排置于光源箱上，排列整齐，使各管内容物清晰可见并被照亮。每三根毛细管之间留出空隙，以区分不同的化学条件。</li>
	<li>将试管排成一行并打开灯箱，从正上方进行拍摄。（参见 图3)</li>
</ol>
<img alt="DNA分离与分析的毛细管电泳装置示意图，展示样品迁移过程。" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：pH梯度示例，对照运行，预孵育，未添加痰液。 人工痰液培养基被分组加入三根毛细管中，从左至右pH值逐渐升高。培养基中添加的指示剂组合使得酸性较强的管呈现更明显的黄色，而酸性较弱的管则呈现更深的紫色。毛细管水平排列，自下方照明，从上方拍摄。 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>将对照材料弃置于生物危害废物中。</li>
</ol>
5. 使用痰液样本接种WinCF毛细管
<ol>
	<li>在无菌生物安全柜中，向八个无菌微量离心管中加入 225 µL 每种培养基各</li>
	<li>使用3 mL注射器（不带针头的塑料注射器）反复抽吸和推出痰液样本，以均质化痰液。重复此操作直至痰液呈均匀一致的质地。</li>
	<li>添加 25 µL 向步骤5.1中准备的每支微量离心管（含ASM培养基，1/10稀释度）加入等量均质化痰液，然后涡旋振荡30秒以充分混匀。</li>
	<li>按照步骤3.2至3.5的相同操作，将培养基加入毛细管中。</li>
</ol>
6. 孵育后样本毛细管的成像
<ol>
	<li>在孵育48小时后，按照与步骤4.1至4.3相同的程序，取出并成像毛细管。</li>
	<li>如果试管中存在气泡，应确保所拍摄的照片能够清晰显示气泡与培养基之间的分界。如果存在生物膜，也应确保照片能够清晰显示其存在。</li>
</ol>
7. 后续应用的培养基去除
<ol>
	<li>为便于后续分析，成像后从毛细管中移除培养基。潜在应用包括细胞培养、DNA/RNA测序及代谢组学分析。 
	注意：装有病原体的玻璃毛细管具有显著的生物安全风险，因此必须使用特定设备谨慎操作。若毛细管破裂，应将其丢弃至合格的生物危害锐器容器中。</li>
	<li>使用25号、0.5英寸长的钝头针去除培养基。将钝头针插入管子的封口端以破坏密封。</li>
	<li>封口打开后，将毛细管倒置，培养基会从顶部滴出。如果培养基不易滴出，可使用移液枪配合移液器吸头 200 µL 将移液器枪头插入毛细管末端，下压移液器推杆，将管内培养基排出。用适当的容器（1.5 mL 离心管）收集排出的管内培养基。 
	注意：对于转录组学或其他RNA分析，可直接将培养基弃入RNA稳定缓冲液中。</li>
</ol>
8. WinCF FLUD 系统
注意：WinCF 流体加载实用装置（FLUD）系统是一套可选的配套设备，旨在优化 WinCF 系统的通量。WinCF FLUD 系统主要由可 3D 打印材料构成。3D 打印制造可实现材料的快速、便捷更换，从而确保研究人员的停机时间最短，且制造需求最小。设计图、stl 文件、3D 打印说明及 WinCF FLUD 使用手册详见在线补充资料。
<ol>
	<li>准备用于毛细管加样培养基
	<ol>
		<li>在无菌生物安全柜中，将八个无菌的 2 mL 微离心管装满 900 µL 每份培养基</li>
		<li>使用3 mL注射器（不带针头的塑料注射器）反复抽吸和推出痰液样本，以充分匀浆化。重复此操作直至痰液呈均匀细腻的质地。</li>
		<li>添加 100 µL 向步骤8.1.1中准备好的每支微量离心管中加入均质化痰液（培养基中1/10稀释），然后涡旋振荡30秒以充分混匀。</li>
		<li>将装好且敞口的微量离心管插入旋转器管架中，方向朝上，确保离心管保持垂直。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>毛细管的放置
	<ol>
		<li>在步骤8.1中，为每个微量离心管取三根毛细管。</li>
		<li>将三支试管插入橡胶支架中，使其与装置另一端的微量离心管对齐。确保试管的标记端朝向远离微量离心管的一侧。将支架底部的三个孔正确套入支架底座上的三个凸柱。</li>
		<li>将毛细管置于仪器的导槽中后，用橡胶压头牢固地压住其中段，以防移动。（参见 图4)</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="毛细管电泳装置，展示利用多根毛细管进行DNA分离" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图4：FLUD系统完全装载了毛细管，橡胶塞头压紧在毛细管中段以固定其位置。 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<ol start="3">
	<li>将介质装入毛细管
	<ol>
		<li>用一只手小心抓住装有毛细管的一端装置，另一只手握住装有微量离心管的旋转架。</li>
		<li>小心旋转微量离心管架，使微量离心管接近水平位置，然后缓慢将管架推向毛细管。（参见 图5)</li>
		<li>当毛细管末端与微量离心管中的培养基接触时，应确保毛细作用立即开始填充毛细管。为调节填充速度和填充水平，可轻轻整体旋转装置。操作时需注意避免将微量离心管中的培养基洒出。（参见 图6)</li>
		<li>当毛细管填充至所需液位时，将装置水平放置于平面上，并小心而迅速地将微量离心管架从毛细管末端取下，以停止填充。此时可将微量离心管完全缩回至垂直位置并关闭。</li>
		<li>将毛细管的突出端密封，每次将密封块压在一组三个重复样本上，逐组密封，直至所有组均被密封。为降低污染风险，每组三个重复样本应使用密封块的不同部位进行按压（参见 图7).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="在实验室实验中，使用带支架的毛细管进行DNA分离分析的电泳装置 setup。" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：FLUD系统将培养基管部署为水平方向，准备与毛细管接触。 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于色谱分析设置的移液管和试管架，支持液体样品分析。" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：加载培养基的毛细管FLUD系统 通过 毛细作用 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="凝胶电泳中的静态平衡；在托盘上加样进行方法设置" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7：使用密封块在FLUD系统上逐次密封装有样品的毛细管三联管。 该封膜板边缘带有塑料部分，需切除以防止封膜过程中与相邻的三个重复样本组接触。 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>孵育
	<ol>
		<li>取下覆盖在管子中段的橡胶压头，并将橡胶支架从主装置上抬起，这样会将所有毛细管一并带走。随后将支架及其所固定的管子放置到成像架上。该成像架设有三个可插入支架的定位柱，以及用于安放毛细管的小型导引槽。</li>
		<li>将整个成像支架放入透明塑料培养箱中。取少量无菌纸巾用无菌水浸湿，置于培养箱的两个较短侧边，以在培养期间提供湿度。（参见 图8)</li>
		<li>完全关闭盒子，并将其放入内部 37 °C 孵育器中孵育，确保试管保持水平。孵育48 h。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="静态平衡；ΣFx=0；梁平衡法；紧凑型实验装置；教学用途。" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图8"> 
图8：从FLUD系统转移至成像架上的橡胶支架中的毛细管，成像架已放置于透明培养盒内，并与湿润的纸巾一同存放以提供湿度。 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<ol start="5">
	<li>成像与提取
	<ol>
		<li>从培养箱中取出装有试管的成像架，放置在下方透光的光源箱上。试管仍保留在成像架中，三组重复样本将保持适当间距，可立即进行成像。</li>
		<li>将相机对准试管，确保所有试管均位于视野范围内，并使光源箱的光线为试管中染料的颜色提供足够的对比度和清晰可见性。从正上方进行拍摄。</li>
		<li>为提取管内物质，每次取一组三份的毛细管，将其从橡胶支架中取出。轻轻提起管子离开支架，或将其滑出。</li>
		<li>对于每组三个重复样本，按照步骤 7.1 至 7.3 中详述的提取程序进行操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Quinn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Winogradsky-based+culture+system+shows+an+association+between+microbial+fermentation+and+cystic+fibrosis+exacerbation%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J+%22%5BJournal%5D)">A Winogradsky-based culture system shows an association between microbial fermentation and cystic fibrosis exacerbation.</a> ISME J . 9, 1024-1038 (2015).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

囊性纤维化（CF）患者肺部的微生物组成包含多种多样的生物体，但肺内环境条件可能对哪些类型的微生物能够存活和增殖具有显著影响13,15。目前，这些条件发生变化的具体机制及其对肺部微生物组的确切影响尚不明确。在本实验方法中，我们基于模拟肺细支气管中人为调控的化学条件，对微生物学变化进行了分析。
该实验方案中有一些关键步骤。在添加痰液样本之前，保持人工痰液培养基的无菌状态至关重要，尤其是在考虑所分析环境的微生物组时。外源微生物可能会改变条件，干扰细支气管模拟的准确性，还可能在使用的痰液样本中与目标病原体竞争，从而影响孵育后变化的任何分析结果。毛细管必须水平孵育，这一点至关重要。因为水平放置有助于观察气体的产生。如果将毛细管垂直孵育，所产生的气体可能会上升并逸出培养基，导致看似完全没有气体产生。封闭两端可促进更多气体生成并防止气体逸失，但这会破坏所需的氧气梯度。
该方案可根据多种因素进行修改，从培养基的化学成分到接种样...

本文所述方法称为WinCF系统1。WinCF的总体目标是提供一种能够模拟充满黏液的肺细支气管环境的实验装置。这将建立一个可操作的系统，用于研究具有黏液过度分泌表型的肺部疾病中的微生物病原体，包括囊性纤维化（CF）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、哮喘及其他相关疾病。该实验流程最初专为CF研究而设计，CF的特征是基因突变导致肺部分泌物变厚且难以清除，最终使细支气管和其他小气道被黏液充满2。肺部此类阻塞会抑制气体交换，因为吸入的空气无法再到达许多肺泡，同时也为细菌定植提供了生存环境3,4。由于无法抑制过量肺黏液中的微生物生长，最终导致呼吸道形成复杂的慢性感染。这些微生物群落包含多种生物体，包括病毒、真菌以及如Pseudomonas aeruginosa等细菌，它们之间相互作用5,6,7,8。CF患者肺部微生物组的活动被认为与症状急性加重（称为肺部急性加重）有关1,9,10,11。WinCF系统可用于研究这些急性加重期间微生物群落的行为，并正在被拓展为研究肺部微生物生态学的基础实验平台。传统上，急性加重主要通过直接分析从肺部采集的样本进行研究。由于存在多种混杂因素，直接分析肺部微生物行为具有挑战性；而使用WinCF系统可消除其中许多因素，从而更直接地研究肺部微生物组的行为，实现对黏液堵塞细支气管中细菌活动的更精细分析。
WinCF 系统提供了一种培养和分析细菌的方法，可有效模拟肺部环境。传统的肺部细菌培养方法通常是在标准琼脂平板上进行样本培养，这些方法使样本暴露于大气氧气中，未能考虑到黏液堵塞的肺细支气管中常见的低氧甚至无氧条件。12,13在有氧条件下于琼脂上培养与囊性纤维化（CF）患者肺部环境相去甚远，可能导致临床医生和研究人员对所研究病原体的行为产生误解。此外，琼脂平板上细菌可利用的营养物质与实际痰液中的营养成分也存在差异，而WinCF通过使用人工痰液培养基（ASM）来弥补这一差异。如图所示， 假单胞菌 Sriramulu 的培养物 等14ASM 包含一组特定组分，可模拟痰液微生物可利用的资源，同时复制痰液的物理一致性。由于病变肺部具有特定的微生物组，对这些微生物的研究 ideally 应在肺部的特定条件下进行。
WinCF 系统能够快速分析并轻松调控实验条件，以观察类似于真实肺部细支气管中发生的微生物变化。该技术可用于接种多种相关类型的样本，包括痰液、唾液、其他体液分泌物以及纯培养或混合细菌培养物。该实验装置的特点使得微生物群落行为可立即进行直观观察，并设计为便于后续开展多种微生物学及组学分析流程。此类研究具有重要意义，因为细菌群落的组成会随其生存环境的理化条件变化而改变。利用 WinCF 系统，可调控培养基的化学条件，以分析其对细菌活性的影响。例如，可在接种样本前调节培养基的酸度。孵育后，可直接比较不同条件下细菌的活性，进而推断这些痰液样本中的细菌在不同 pH 条件下的响应行为。本文概述了 WinCF 系统的应用步骤，并举例说明如何调控培养基化学性质以研究其对肺部微生物组的影响。

<table><tbody><tr><td>彩色编码毛细管</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-260943</td><td></td></tr><tr><td>Cha-seal 管封合剂</td><td>Kimble-Chase</td><td>43510</td><td></td></tr><tr><td>猪胃黏蛋白</td><td>Sigma</td><td>M1778</td><td></td></tr><tr><td>阳离子化马脾铁蛋白</td><td>Sigma</td><td>F7879</td><td></td></tr><tr><td>鲑鱼精DNA钠盐（超声处理）</td><td>AppliChem Panreac</td><td>A2159</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸</td><td>Corning cellgro</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM氨基酸</td><td>Cellgro</td><td>25-030-CI</td><td></td></tr><tr><td>蛋黄乳剂，50%</td><td>Dalynn Biologicals</td><td>VE30-100</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher Scientific</td><td>P2157500</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271500</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 带刻度和平盖的离心管</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 带刻度和平盖的离心管</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Corning</td><td>MCT-150-R</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL 微量离心管</td><td>Corning</td><td>MCT-200-C</td><td></td></tr></tbody></table>

wincf 模型——一种经济且易于操作的黏液阻塞细支气管微环境系统，用于研究肺部感染的微生物学

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

许多慢性气道疾病会导致气道被黏液堵塞。囊性纤维化患者的肺部就是一个典型例子，其被黏液堵塞的细支气管为微生物定植提供了有利环境。多种病原体在这一环境中相互作用并蓬勃生长，导致囊性纤维化（CF）相关疾病的诸多症状。与任何微生物群落一样，其栖息地的化学条件对群落结构和动态具有显著影响。例如，不同微生物在氧气或其他溶质浓度不同的条件下生长状况各异。在囊性纤维化患者的肺部也是如此，氧气浓度被认为驱动着微生物群落的生理特性和结构组成。本文所述方法旨在模拟肺部环境，以更接近病原体致病时的自然状态来培养这些病原体。通过调控这些微生物所处的化学环境，可研究肺部感染的化学特性如何调控其微生物生态。该方法称为WinCF系统，基于人工痰液培养基和细毛细管，旨在建立类似于黏液堵塞细支气管中存在的氧气梯度。通过调节化学条件，如痰液培养基的pH值或抗生素压力，可利用显色指示剂、观察气体或生物膜的产生，或提取并测序各样本中的核酸成分，从而可视化不同样本间的微生物学差异。

在不同样本所诱导的化学条件下，微生物的生长情况在某些情况下差异极为显著，在其他情况下则变化较为细微。许多活性变化在性质上是可视的，在培养期结束后立即明显可见。以pH值调控为例，经过培养后，pH谱系中各样本在多个指标上表现出显著差异。当未向培养基中添加痰液样本时，经过48小时培养后，pH谱系中唯一观察到的变化是由于轻微蒸发导致的培养基体积略微减少（图9）。而接种后的毛细管则表现出体积变化、气泡生成、颜色改变以及出现不透明沉淀物（图10）。
<img alt="电泳结果；色谱凝胶图示；DNA分离；蛋白质分析方法。" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图9"> 
图9： pH梯度示例，对照运行，孵...

囊性纤维化（CF）患者的气道被黏液堵塞，为微生物病原体的生长提供了理想的环境。本文描述了一种研究CF肺部微生物组的新方法，该方法在模拟病原体致病环境的条件下进行，并可探究化学条件的改变如何驱动微生物群落的动态变化。

WinCF 模型——一种经济且易于操作的黏液阻塞细支气管微环境系统，用于研究肺部感染的微生物学

许多慢性气道疾病会导致气道被黏液堵塞。囊性纤维化患者的肺部就是一个典型例子，其……

本实验的总体目标是模拟肺部环境，以更接近病原体致病时的条件进行培养。该方法有助于解答呼吸道微生物学领域的关键问题，例如，多种细菌病原体在囊性纤维化患者肺部如何相互作用。该技术的主要优势在于能够轻松调控实验条件。为了观察微生物在人工肺支气管环境中与真实肺部条件相似的反应，本实验将由本实验室的 Will Comstock 演示。制备人工痰液培养基时，加入 16 毫升先前配制的黏液储备液、2 毫升氯化钾储备液、2 毫升氯化钠储备液、200 微升蛋黄乳剂、5.6 毫升 DNA 储备液、120 微升铁蛋白储备液、5.78 毫升必需氨基酸溶液、5.78 毫升非必需氨基酸溶液，以及 2.44 毫升无菌水。无菌人工痰液培养基的精确配制极为重要，因为任何污染都可能影响后续孵育毛细管中细菌的活性。轻轻振荡混匀后，将五毫升培养基分装至八个无菌的15毫升离心管中。现在可以对培养基进行修饰，以达到所需的化学条件。例如，此处所示的培养基已调整其pH值，并添加了染料以反映其不同的酸碱度。接下来，在无菌生物安全柜中，向八个无菌的1.5毫升微量离心管中每管加入900 µL培养基。使用3毫升注射器反复抽吸和排出先前采集的痰液样本，直至痰液呈均匀一致的质地，以完成均质化处理。将均质化后的痰液各100微升加入8个微量离心管中。随后涡旋振荡各管，以充分混匀。根据先前准备的培养基微量离心管，标记另外八个无菌的15毫升离心管。这些将作为孵育管。使用70%乙醇溶液浸湿一张纸巾进行消毒，并使其干燥。将毛巾撕成每块约四平方英寸的小片。然后将每支孵育管底部放入一块撕碎的纸巾。在每支孵育管底部放置一团纸巾后，用1毫升无菌水将每团纸巾略微润湿，以在管内创造一个湿润的环境。对于每管培养基，将毛细管的一端浸入培养基中并水平倾斜，利用毛细作用使培养基进入毛细管，填充三根玻璃毛细管。当培养基充满后，用戴手套的手指轻轻堵住毛细管的开口端以停止填充，然后将另一端压入毛细管密封胶块中以完成密封。将每组三根毛细管放入15毫升孵育管中，管口用封口胶密封并倒置。然后盖紧管盖，并确保已做好标记。这三根毛细管用于每个对照条件的重复实验。当所有培养管均装入指定的毛细管后，将架子置于37摄氏度环境中，使试管水平孵育，以防止产生的任何气体从开口端逸出。孵育试管48小时。从培养箱中取出试管时，确保保持其水平状态。小心地将毛细管从培养试管中取出，使每组三根毛细管与其他组分开。将毛细管并排置于光源箱上，排列整齐，使管内内容物清晰可见，并从下方透光照明。每三根毛细管之间留出一个空隙，以区分不同的化学条件。接下来，将相机对准正上方的毛细管，确保所有毛细管均位于视野范围内，且光源箱提供的光照能够充分凸显毛细管内染料颜色的对比度和可视性。为进行后续分析而提取毛细管内容物时，每次从光源箱上取下一组三联毛细管。将一根25号、0.5英寸长的钝头针插入毛细管封闭端，以破坏密封。然后将毛细管倒置，使培养基从毛细管顶部滴入一个1.5毫升微量离心管中。如果培养基无法滴出，可使用200微升移液器，将移液器吸头插入毛细管末端，按下移液器活塞，将培养基推出。如图所示，当未向培养基中添加痰标本时，经过48小时孵育后，整个pH范围内唯一观察到的变化是由于轻微蒸发导致的培养基体积略微减少。接种后的毛细管显示出体积变化、气泡产生、颜色改变以及不透明沉淀物的出现。这些结果表明，添加的痰液中所含的细菌及其他微生物能够在人工培养基中生长并发生改变。孵育后，可进一步采用代谢组学和DNA测序等方法，深入探究在毛细管中生长的微生物的行为特征。winCF 系统是一种研究肺部微生物组活性的新方法；对囊性纤维化（CF）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、哮喘及其他多种疾病具有重要意义。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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