研究棉铃虫浓核病毒在寄主组织中的分布、传播方式及其对寄主适应性影响的实验方案

本实验方案的总体目标是研究一种浓核病毒（HaDV2）对其宿主棉铃虫的影响。该方法有助于回答病毒-宿主相互作用领域中的关键问题，例如当前具有致病性的病毒对其宿主的影响。该技术的主要优势在于，用于构建病毒阳性与阴性品系的幼虫来源于相同的亲代宿主，从而确保了遗传背景的一致性。

实验开始时，将八对新羽化的蛾子进行单对交配，每对使用一个塑料笼子饲养，并用棉纱布覆盖，以确保良好的通风，并作为产卵基质。为提高获得无病毒种群的可能性，应至少使用30对单对交配的蛾子。成虫以浸有10%蔗糖和2%维生素溶液的棉球喂养，并每日更换溶液。

交配后的当天，雌性成虫会将卵产在棉纱布上，此后需开始每天更换一次纱布。将带有卵的纱布收集起来，并与成虫置于同一生长室内培养，直至卵孵化。幼虫孵化后应立即转移到新的24孔板中，每孔放置一头幼虫。

在首次产卵日期后的第五天，收集成虫蛾并将其保存在液氮中。使用特异性引物通过PCR检测亲代是否携带HaDV2，并将未检测到HaDV2的个体保留作为无HaDV2的非感染品系。单独收集成虫蛾，并立即将其保存在液氮中。

使用无菌研钵和研杵在液氮中将采集的单个蛾类彻底研磨。取约10微克的组织碎片转移至一个洁净的1.5毫升离心管中。然后将剩余碎片转移至另一新离心管中，并立即于-80摄氏度保存。

按照制造商提供的方案，从10微克的残渣中提取DNA。在分离出蛾类DNA后，使用该方案检测HaDV2。根据检测结果，将剩余的残渣分为两组：HaDV2阳性组和HaDV2阴性组。

向每个个体中加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS），以彻底溶解残留的幼虫碎片。将离心机预冷至4°C，然后离心匀浆液。在冰上用0.22微米膜过滤器过滤液体上清液。

每管收集 200 微升滤液，并立即在 80 摄氏度下保存。通过稀释含有 HaDV2 的滤液，制备不同浓度的样品，以测定口服感染效率。在生物安全柜中，将每种浓度的含 HaDV2 滤液各 200 微升均匀涂布于固体人工饲料表面。

接下来，开始将100只新孵化的幼虫转移到含有HaDV2的人工饲料中，置于培养皿内。轻轻敲击附有新孵化幼虫的棉纱布，使幼虫从纱布落入一张白纸上。再轻轻敲击纸张，使幼虫吐丝并从纸上飘落。

使用灭菌镊子接触蚕丝，并将幼虫转移至培养皿中。48小时后，将单头幼虫分别转移至含有人工饲料的24孔板中，每孔一头。用相同浓度的HaDV2接种幼虫，并饲养至成虫阶段。

使用该方案检测成虫的 HaDV2 感染状态。以每微升 10 的 8 次方拷贝数的 HaDV2 接种的成虫感染率达 100%，可作为 HaDV2 阳性品系保存。为防止污染，需将镊子和剪刀在 75% 乙醇中消毒三次，然后在酒精灯火焰上灼烧灭菌。

使用分析天平称量用于储存组织的空管。随后将感染品系的幼虫和成虫置于冰上约五分钟。用两枚昆虫针插入幼虫头部和腹部末端体节附近的节间膜，将其固定在囊孢封片剂（cystosepiment）上。

然后在幼虫的腹部后段，切开幼虫的腹足，使血淋巴流出。使用移液器在约10秒内吸取大约10微升的幼虫血淋巴，以防止血淋巴褐变和凝固。用一把剪刀从最后一段节间膜开始，沿体壁向头部方向剪开一个切口。

使用两把镊子解剖前肠、中肠、后肠、脂肪体和马氏管。为防止在解剖过程中其他组织被血淋巴污染，需将解剖所得组织在 PBS 缓冲液中清洗。将三个个体的组织样本混合，作为一个重复组。

立即将每种组织转移至盛有液氮的离心管中。在含有 PBS 缓冲液的洁净培养皿中，分离雌性和雄性成体的组织，并立即将每种组织转移至盛有液氮的离心管中。分别称量离心管及上述组织的总质量，并计算组织的质量。

提取这些组织的DNA，并进行kPCR以定量各组织中的病毒滴度。将至少100只来自未感染品系的蛹或新羽化的成虫放入一个5升的金属网笼中，笼口用纱布覆盖。两天后，交配后的成年雌蛾将开始在纱布上产卵。

收集并保存含有卵的脱脂棉纱布。通过将未感染品系的初孵幼虫转移至含HaDV2的人工饲料中，进行初孵幼虫接种，以建立感染品系。同样，将初孵幼虫转移至覆盖无HaDV2的过滤液体的人工饲料中，以建立对照组，即未感染品系。

每种处理至少包含 240 头幼虫。48 小时后，将单个幼虫分别转移至 24 孔板的每个孔中。对每孔中的幼虫依次编号，并每日记录其龄期和存活状态。

大约五天后，当人工饲料发生变质时，立即将这些个体同时转移到含有新鲜人工饲料的新24孔板中。使用分析天平称量第7天至第11天的幼虫。称量后，将幼虫逐一放回24孔板中。

孵化后约十天，幼虫蜕皮进入五龄期时，将其转移至玻璃管中。每天在同一时间将个体转移至玻璃管。五龄期幼虫也可通过头壳的宽度进行鉴别。

接下来，使用油漆或记号笔在玻璃管上标记每只幼虫的原始编号。每天记录幼虫的状态。记录玻璃管中每只个体的化蛹日期和羽化日期，并记录三日龄蛹的质量。

羽化后，将一只雌蛾和一只雄蛾放入同一个笼子中，提供10%蔗糖溶液和2%维生素溶液。每天补充蔗糖溶液。记录每只蛾的死亡日期。

产卵后，每天更换一次棉纱布。立即统计卵的数量。最后，在子代孵化时及时统计新孵化的幼虫数量。

进行了三次重复实验，以确保实验所用样本的质量。将来自不含 HaDV2 的雄性和雌性亲本的子代作为非感染品系进行培育。利用相同的 DNA 模板，我们成功扩增了亲本及子代中的肌动蛋白基因，表明所用 DNA 模板质量良好。

随机选取的8个子代均未感染HaDV2、HaNPV和Wolbachia。标准曲线定义了起始材料质量的对数值与获得的CT值之间的关系，显示CT值与HaDV2初始基因拷贝数的对数之间存在强烈的线性相关性。每微克组织中的HaDV2拷贝数被计算出来，特定组织中HaDV2总滴度所占百分比表明，HaDV2主要分布在脂肪体中。

在进行该操作时，必须注意在整个操作过程中，从孵化后的前五天起要小心处理脆弱的幼虫。