Name: 背根神经节内注射和背根挤压伤为感官轴突再生模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 学习背根神经节注射联合背根挤压伤技术，用于研究成年大鼠感觉轴突再生及基因治疗应用。该方法可在不损伤脊髓的情况下评估轴突再生能力，改善动物福利并减少术后并发症。

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本工作获得了克里斯托弗和丹娜·里夫基金会、医学研究理事会、欧洲研究理事会ECMneuro项目以及剑桥大学NHMRC生物医学研究中心的资助。我们衷心感谢Heleen Merel van ’t Spijker和Justyna Barratt在拍摄过程中提供的技术支持。我们感谢伊丽莎白·莫洛尼博士和荷兰神经科学研究所的Joost Verhaagen教授在AAV制备方面提供的帮助。

以下所有动物实验操作均按照英国《1986年动物（科学程序）法》进行。如果对这些操作不熟悉，请在开始本方案前查阅当地或国家的相关法规，并寻求兽医建议。
1. 选择合适的动物品系
注意：背根神经挤压伤会导致感觉丧失和足掌去传入。前足去传入常见的不良反应包括过度理毛、自残行为和足部自体切断。
<ol>
	<li>获取用于实验的动物。 
	注意：对于大鼠，与较为温顺的品系（如 Lewis 和 Sprague-Dawley）相比，活动性更强的品系（如 Lister-Hooded 和 Wistar）在去传入后出现足部自噬的发生率更高。如果条件允许，应优先考虑最温顺的品系 Lewis。若因基因修饰或特定行为学评估需求而必须使用特别活跃的品系，则应提前制定兽医治疗方案，以应对可能出现的不良反应。</li>
</ol>
2. 准备用于注射的病毒
注意：所有病毒的操作均须遵守生物安全和实验室安全规范。
<ol>
	<li>根据各病毒包装方案9，将病毒稀释或浓缩至滴度为 2 × 1012 基因组拷贝 (GC)/mL。 
	注：此处将病毒稀释于含 5% 蔗糖的杜氏磷酸盐缓冲液 (D-PBS) 中。滴度可能需根据病毒类型、启动子、构建体大小及靶细胞类型进行优化。</li>
	<li>可选：向病毒溶液中加入 1% 有色染料（例如，快绿），以便后续注射时易于观察。轻轻混匀溶液。</li>
	<li>将溶液置于冰上，用于立即使用（4 小时内），或置于 -80 °C 冰箱中长期保存。</li>
</ol>
3. 动物术前准备操作
注意：由于手术具有高度侵入性，必须始终采用无菌技术。
<ol>
	<li>手术开始前，准备并对手术器械及脊髓立体定位架进行灭菌。例如，在134 °C下使用高压灭菌器对器械进行灭菌。每只动物均需使用一套新的无菌器械。</li>
	<li>对动物实施麻醉。通过轻捏足部以检测回缩反射，或触碰角膜以检测眼睑反射，确认麻醉效果。
	<ol>
		<li>对于成年大鼠，若使用异氟烷等吸入麻醉剂，诱导时采用4%异氟烷与2.0 L/min的氧气混合；术中维持阶段采用2–3%异氟烷与1.5 L/min的氧气混合，根据动物的呼吸模式调整异氟烷浓度，避免剂量过高或不足。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动物初步麻醉后，记录其术前体重。</li>
	<li>进行颈段DRG注射时，剃除从耳间至肩胛骨远端区域的颈部毛发，并用消毒剂对剃毛区域进行消毒。</li>
	<li>在动物侧腹部皮下注射2 mL生理盐水，同时给予适当剂量的镇痛药（e.g., 卡洛芬5 mg/kg）和抗生素（e.g., 恩诺沙星5 mg/kg）。</li>
	<li>在双眼涂抹眼膏，防止手术过程中角膜干燥。</li>
	<li>将动物置于带有37 °C加热垫的脊髓立体定位架上，开始手术。</li>
</ol>
4. 注射背根神经节并实施背根挤压损伤
注意：这是一项极为精细的手术。建议先在几只死亡的动物身上进行练习，以熟悉解剖结构，然后再进行活体动物手术。
<ol>
	<li>定位皮肤表面明显的 C2 和 T2 棘突。使用 10 号手术刀片在 C2 与 T2 棘突之间做皮肤切口（切开皮肤后，应在肌肉第一层表面可见一条白色纤维组织中线；肌肉第一层具有一个 &#34;凝胶状&#34; 纹理）</li>
	<li>使用手术刀片沿白色中线在第一层肌肉上做一个大小相似的切口，不要超过明显的T2棘突。&#160;因为此处附近有来自降主动脉的主要动脉分支。 
	注意：从本步骤开始可能出现严重出血。务必使用无菌棉签或外科可吸收海绵及时止血并清除血液，以确保视野始终清晰。继续进行操作 &#34;盲目地&#34; 可能导致脊髓、背根神经节或背根的意外损伤，从而在动物后续过程中引发意想不到的不良反应。</li>
	<li>使用两个拉钩分别置于头侧和尾侧，将第一层肌肉向两侧牵开，此时应可见到具有横纹状外观的第二层肌肉。</li>
	<li>定位第二层肌肉的中线位置（此处可见两条纵向肌肉由一层薄的膜状组织连接）。使用显微剪刀解剖该膜状组织，以分离两条纵向肌肉。应尽量避免使用手术刀片，以免造成不必要的肌肉损伤和出血。</li>
	<li>根据需要调整拉钩，以暴露覆盖脊柱的第三层薄肌。可用镊子轻轻触碰第三层肌肉表面，感知棘突的位置。</li>
	<li>使用显微剪刀在第三层肌肉上做一个小切口，并用刮匙或手术刀以侧向方式轻轻刮除附着在骨面上的肌肉，以充分暴露椎骨。如有需要，可切除部分肌肉或肌腱，以便于进行椎板切除术。</li>
	<li>为暴露左侧 C5 - C8 背根神经节（DRG），使用精细咬骨钳小心切除 C4 - T1 椎骨部分椎板和椎弓根，行左侧半椎板切除术。DRG 位于椎骨横突孔附近。 
	注意：C3 - C7 椎骨没有明显的棘突。C5 背根神经节（DRG）位于 C4 与 C5 椎骨之间，C6 DRG 位于 C5 与 C6 椎骨之间，依此类推，而 C8 DRG 位于 C7 与 T1 椎骨之间。尽管存在 C8 DRG 和 C8 脊髓节段，但并不存在 C8 椎骨。</li>
	<li>当背根神经节（DRG）已充分暴露可供注射时，将装有病毒的微升注射器（配备自制的33号钝针头）安装至立体定位注射器 holder 上，以准备注射。注射前，使用30号斜面针头在每个目标DRG表面制造微小的浅表切口，以辅助注射针头的插入。</li>
	<li>使用33号针头，通过轻轻旋转旋钮调节立体定位坐标，将针头插入背根神经节（DRG）的中心位置。切勿过度插入针头，以免液体从DRG腹侧漏出。若发生泄漏，应立即调整针头位置。 
	注意：不使用数字立体定位坐标；但利用支架固定注射用针头会更为方便。</li>
	<li>注射1 &#181;每 DRG 注射 0.2 L 病毒 &#181;使用输注注射泵以 L/min 的速度注入。拔针前再等待三分钟。注射过程中，若病毒溶液含有有色染料，背根神经节将逐渐变色。</li>
	<li>为实施C5至C8节段背根的同步挤压损伤，使用精细尖头镊子（Bonn Micro）对每根背根进行三次挤压，每次持续10秒，完全闭合镊子的两端；挤压部位的组织上应出现一条白色线条。镊子操作时勿深入超过必要程度，以免损伤腹根。</li>
	<li>注射和/或挤压操作完成后，在缝合动物之前，务必确认切口部位无出血或残留骨碎片。如有需要，可在暴露的脊髓和背根神经节（DRG）上方放置一小块可吸收的外科止血海绵。</li>
	<li>让第三层肌肉自然回缩至脊柱处，无需缝合。松散地缝合第二层的两条纵向肌肉（&#8776; 3针间断缝合），使用可吸收的6-0缝合线。缝合第一层肌肉（&#8776; 5针间断缝合），使用可吸收的6-0缝合线。</li>
	<li>使用可吸收的5-0缝合线缝合皮肤（&#8776; 10个间断缝合） 
	注意：确保缝线不要过紧。皮肤隆起是缝线过紧的迹象，可能会引起动物不适。</li>
	<li>如果手术过程中出现大量出血，可根据当地法规允许，皮下注射1 - 2 mL生理盐水，以补充动物体液的流失。</li>
	<li>提供可食用的补水凝胶，让动物从麻醉中完全恢复，并在将其送回饲养区前至少进行1小时的定期监测。</li>
	<li>至少饲养动物3周，以获得最佳的转基因表达，用于评估感觉轴突再生。</li>
</ol>
5. 动物术后护理的实施
<ol>
	<li>术后第一周内为动物提供食物糊和柔软的棉质垫料。根据当地/国家规定和兽医建议，如有需要，可给予额外剂量的镇痛药和抗生素以促进恢复。</li>
	<li>术后7 - 10天拆除皮肤缝线。 
	注意：手术常见的不良反应包括切口部位形成血清肿或血肿、因可吸收缝线引起的皮肤瘙痒所致抓痕、轻微的感觉或运动功能障碍，以及背根挤压损伤后去传入神经的前爪出现自残迹象。若出现远比预期严重的动物福利问题，应立即寻求兽医建议。</li>
</ol>
6. 进行顺行CTB注射以进行轴突示踪
注意：建议在组织采集前一周进行霍乱毒素B亚基（CTB）轴突示踪。
<ol>
	<li>按照制造商说明书配制1% CTB溶液。</li>
	<li>可选：向溶液中加入1%有色染料，以便后续直观观察注射情况。将溶液轻轻混匀。</li>
	<li>麻醉动物（参见步骤3.2.1），并通过胶带将左前肢固定在手术台上以稳定前足。</li>
	<li>使用配备自制33号短针头的微升注射器，将1 µL的1% CTB溶液缓慢地皮下注射至无毛足垫中心及四个脚趾。 
	注意：注射前，可先用30号斜面针头在皮肤上制造一个微小的浅表开口，有助于注射针头的插入。</li>
	<li>待动物从麻醉状态完全恢复后，将其送回饲养区域。</li>
</ol>
7. 组织采集
<ol>
	<li>为采集病毒注射后的背根神经节（DRG）和脊髓组织用于免疫组织化学分析，先给予动物过量麻醉剂，随后经心脏灌注磷酸盐缓冲盐水，再灌注冷的4%多聚甲醛。在显微镜下小心地进行全椎板切除术以采集固定后的组织。根据分析需要，继续进行组织准备、切片及后续处理4,5,6。 
	注：回收的切口部位应清晰可见，可通过瘢痕组织的存在进行判断。</li>
	<li>或者，为采集病毒注射后的DRG用于体外（in vitro）培养，可采用批准的人道处死方法（如逐渐升高浓度的二氧化碳）处死动物。在显微镜下小心解剖DRG，尽可能保持无菌条件。随后根据需要进行组织培养4,5,6,10。</li>
</ol>

<ol><li>Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenges+of+long-distance+axon+regeneration+in+the+injured+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS.</a> Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).</li>
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<li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Front Mol Neurosci. 8, 36(2015).</li>
<li>Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+intraperitoneal+or+intravenous+injections+of+recombinant+adeno-associated+virus+type+8+transduce+dorsal+root+ganglia+and+lower+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons.</a> Hum Gene Ther. 19 (1), 61-70 (2008).</li>
<li>Vulchanova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+adeno-associated+virus+mediated+gene+transfer+to+sensory+neurons+following+intrathecal+delivery+by+direct+lumbar+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pain%22%5BJournal%5D)">Differential adeno-associated virus mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture.</a> Mol Pain. 6, 31(2010).</li>
<li>Gray, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+a+novel+adeno-associated+virus+%28AAV%29+vector+that+crosses+the+seizure-compromised+blood-brain+barrier+%28BBB%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of a novel adeno-associated virus (AAV) vector that crosses the seizure-compromised blood-brain barrier (BBB).</a> Mol Ther. 18 (3), 570-578 (2010).</li>
<li>Fagoe, N. D., Attwell, C. L., Kouwenhoven, D., Verhaagen, J., Mason, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+ATF3+or+the+combination+of+ATF3%2C+c-Jun%2C+STAT3+and+Smad1+promotes+regeneration+of+the+central+axon+branch+of+sensory+neurons+but+without+synergistic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Overexpression of ATF3 or the combination of ATF3, c-Jun, STAT3 and Smad1 promotes regeneration of the central axon branch of sensory neurons but without synergistic effects.</a> Hum Mol Genet. 24 (23), 6788-6800 (2015).</li>
</ol>

James Fawcett 是 Acorda Therapeutics 和 Novartis 的付费顾问。

本文提供了一步一步的操作指南，用于在成年大鼠下颈椎脊髓区域进行背根神经节注射及背根 crush 损伤。由于该手术具有极强的侵入性和精细性，我们强烈建议所有潜在操作人员在开展活体动物手术前，接受充分的培训并积累足够的练习经验。操作者不仅应熟悉脊髓的解剖结构，还应掌握周围肌肉组织、椎骨结构以及血管系统的相关知识。理想情况下，熟练的操作者应能够在尽量减少对周围组织损伤的前提下，通过切除部分椎骨完成干净利落的椎板切除术，且不造成脊髓的任何损伤。正如脊髓损伤所显示的那样，脊髓内的微小病灶可能对整个神经系统产生广泛而有害的影响。此外，接受过此类手术的动物 &#34;清洁&#34; 手术后的动物发生意外术后并发症和福利问题的可能性较低，因此在达到预定实验时间点之前因这些问题而被处死的可能性也较小。
将病毒导入神经系统时，有几种可能的给药途径：静脉注射15、腹腔注射16、鞘内注射17，或直接注射至靶部位4<s...

在神经系统损伤后实现轴突再生是一项具有挑战性的任务1。为了研究中枢神经系统（CNS）中轴突再生失败的机制，研究人员已采用了多种神经损伤模型。由于中枢神经系统的不同区域具有差异，因此使用解剖学上合适的模型来研究轴突再生至关重要。通过采用适当的模型，研究人员可根据损伤的严重程度、目标神经元细胞类型以及拟评估再生情况的脊髓传导束，制定出特定的治疗方案，而非采用&#34;一刀切&#34;的治疗策略。
以脊髓损伤为例，最具致残性的症状源于感觉和运动功能的丧失。感觉丧失是由于上行感觉通路受损所致，而运动功能丧失则是由于下行运动通路受损引起的。由于这两条通路在细胞和解剖结构上存在差异，许多针对轴突再生的研究仅专注于其中一条通路，其理论依据在于，任一通路的功能成功恢复都将为患者带来巨大益处。本文介绍了一种实验方案：通过在成年大鼠颈段脊髓下部进行背根神经节（DRG）直接注射病毒载体，同时施加背根挤压损伤，构建用于研究感觉轴突再生的动物模型。
背根神经节感觉神经元负责将触觉和疼痛等感觉信息从外周传递至中枢神经系统。感觉神经元在脊髓中的长轴突投射为研究长距离轴突再生提供了良好的模型。此外，由于啮齿类动物在发生背根 crush 损伤等感觉通路损伤后仍可存活，且福利问题较少，研究人员得以在无需完全损伤脊髓的情况下研究中枢神经系统轴突的再生。已有研究表明，C5 - C8（颈段5 - 8）四重背根 crush 损伤是前肢去传入研究的一种有效模型。2此外，背根神经节挤压损伤提供了一种 &#34;清洁剂&#34; 相较于直接脊髓损伤，该模型在研究轴突再生时更为简便，因为它不受胶质瘢痕形成等其他因素的干扰。
利用病毒基因疗法将神经元重编程为再生状态， increasingly 被视为治疗多种神经系统疾病的一种有前景的策略3。研究表明，使用携带促生长蛋白转基因的腺相关病毒（AAV）载体，可实现 robust 的轴突再生并伴随行为功能恢复4,5,6。AAV 在引发免疫反应方面表现出明显的低致病性，并且能够转导非分裂细胞（如神经元），使其成为基因治疗的理想载体。此外，目前用于治疗的是重组型 AAV。该形式无法将其病毒基因组整合到宿主基因组中7，与慢病毒等其他病毒载体相比，降低了插入突变的风险。这使得 AAV 成为基因治疗应用中的安全选择。
由于背根神经节（DRG）包含感觉神经元的细胞体，因此它是通过病毒介导的基因治疗来研究和/或促进感觉轴突再生的最合适解剖靶点。在一项比较不同腺相关病毒（AAV）血清型与慢病毒的研究中，直接注射到DRG后，AAV5血清型在至少12周的时间范围内被证明在转导DRG神经元方面效率最高8。此外，AAV可实现超过40%的转导效率，并能转导所有DRG神经元亚型，包括大直径的神经丝蛋白200 kDa（NF200）阳性神经元以及小直径的降钙素基因相关肽（CGRP）阳性或凝集素b4（IB4）阳性神经元4,8。
由于DRG注射和背根挤压损伤手术具有极高的侵入性和精细性，我们认为本文将有助于新用户以非常高效的方式学习该操作流程。本文展示了成年大鼠在C6-C7节段DRG注射对照病毒AAV5-GFP（绿色荧光蛋白）并同时造成C5-C8节段背根挤压损伤后四周的代表性结果。该模型特别适用于研究利用病毒基因治疗促进感觉轴突再生的研究人员。

<table><tbody><tr><td>快绿 FCF 染料</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258</td><td>用于可视化无色溶液。推荐浓度：1%</td></tr><tr><td>霍乱毒素 B 亚基</td><td>List Biological Laboratories</td><td>104</td><td>用于顺行性轴突示踪。推荐浓度：1%</td></tr><tr><td>IsoFlo</td><td>Zoetis</td><td>115095</td><td>吸入性麻醉剂（活性成分：异氟烷）</td></tr><tr><td>Baytril 2.5% 注射液</td><td>Bayer</td><td>05032756093017</td><td>抗生素（活性成分：恩诺沙星）。生产厂家推荐剂量：10 mg/kg</td></tr><tr><td>Carprieve 5.0% w/v</td><td>Norbrook</td><td>02000/4229</td><td>镇痛药（活性成分：卡洛芬）。生产厂家推荐剂量：4 mg/kg</td></tr><tr><td>Lacri-Lube</td><td>Allergan</td><td>PL 00426/0041</td><td>眼用软膏</td></tr><tr><td>Olsen-Hegar 持针器</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 12502-12</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Pearson Rongeur 弯头咬骨钳（杯口直径 0.7 mm）</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Bonn 显微镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 11083-07</td><td>用于背根神经节挤压损伤操作</td></tr><tr><td>组织分离剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 14072-10</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Adson 有齿镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Goldstein 牵开器</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 17003-03</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 弹簧剪（直头）</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 15018-10</td><td></td></tr><tr><td>SURGIFOAM 可吸收明胶海绵</td><td>Ethicon</td><td>1972</td><td>用于止血</td></tr><tr><td>微量注射器 RN701（10 &amp;mu;L）</td><td>Hamilton</td><td>80330</td><td></td></tr><tr><td>定制可拆卸针头（用于 DRG 注射）</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>33 号，38 mm，尖端类型 3</td></tr><tr><td>定制可拆卸针头（用于 CTB 注射）</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>33 号，10 mm，尖端类型 3</td></tr><tr><td>UltraMicroPump 配 SYS-Micro4 控制器</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr></tbody></table>

背根神经节注射与背根挤压损伤作为感觉轴突再生的研究模型

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

在神经系统损伤后实现轴突再生是一项具有挑战性的任务。由于中枢神经系统（CNS）的不同区域在解剖结构上存在差异，因此选择合适的研究模型至关重要。通过使用适当的模型，我们可以根据损伤的严重程度、目标神经元类型以及希望评估再生情况的脊髓通路，制定出特定的治疗方案。在感觉通路中，背根神经节（DRG）神经元负责将来自外周的感觉信息传递至中枢神经系统。本文介绍了一种利用病毒载体对成年大鼠下颈段脊髓区域的背根神经节进行注射，并同时施加背根挤压损伤的模型，用于研究感觉轴突的再生。通过使用对照病毒AAV5-GFP，我们展示了直接向DRG注射病毒在转导DRG神经元以及示踪感觉轴突进入脊髓方面的有效性。同时，我们也验证了背根挤压损伤可导致前肢去神经化，表明其作为评估轴突再生的损伤模型是有效的。尽管该手术操作需要经过专门培训才能完成，但本实验方案具有良好的灵活性，使用者可根据自身的实验需求对多个环节进行调整。尤为重要的是，该模型可为正在寻找合适动物模型的研究人员提供一个可靠的基础。我们相信，本文将有助于新用户以高效且有效的方式掌握该实验技术。

作为示例，展示了一张带有附着背根神经节（DRG）的脊髓横切面，以说明本方案的有效性：在将对照病毒AAV5-GFP直接注射至C7节段DRG后四周，无需造成背根 crush 损伤，即可实现DRG神经元的有效转导以及脊髓内感觉轴突的示踪（图1A）。脊髓的背柱和背角中的轴突均表达GFP（图1B），注射侧DRG内的神经元胞体及其轴突也呈GFP阳性（图1C）。对脑干中感觉轴突终末区域——楔束核进行额外的解剖学分析，结果显示顺行性CTB示踪呈阳性（图1D）。
当DRG注射与完全性C5-C8背根 crush 损伤同时进行时，脊髓中未观察到GFP阳性轴突，楔束核中也未观察到CTB阳性终末（图2A）。然而需要指出的是，尽管背根完全损伤，轴突切断后的感觉轴突仍可再生至背根进入区——该区域属于周围神经系统（P...

本方案介绍了一种在成年大鼠中通过背根神经节（DRG）注射病毒载体并同时造成背根 crush 损伤的模型，用于研究感觉轴突的再生。该模型适用于探索基因治疗在促进感觉轴突再生中的应用。

在神经系统损伤后实现轴突再生是一项具有挑战性的任务。由于中枢神经系统（CNS）的不同区域彼此之间存在差异……

该手术方法的目标是直接在神经元胞体水平施加治疗，并在不造成中枢神经系统更严重损伤的情况下，评估治疗干预后的轴突再生情况。该方法有助于回答轴突再生领域的一些关键问题，例如：经过治疗的轴突能否在脊髓中再生，并可能到达脑干靶区？该技术的主要优势在于，研究人员能够在不直接损伤脊髓的情况下研究中枢神经系统轴突的再生能力。这可减少术后并发症并改善动物福利。首先对动物进行适当的麻醉，通过脚趾夹捏无反应来确认动物已达到外科麻醉水平。然后称量动物并记录术前体重。对于手术性DRG注射，剃除从耳间至肩胛骨稍下方的颈部毛发。使用消毒剂对剃毛区域进行消毒。在动物侧 flank 处皮下注射 2 毫升生理盐水，同时给予适当剂量的镇痛剂和抗生素。双眼涂抹眼膏，以防止手术过程中角膜干燥。将动物置于脊髓立体定位架中，并在动物下方放置 37 摄氏度的加热垫。手术开始时，先在皮肤上定位明显的C2和T2棘突。然后使用10号手术刀在C2与T2棘突之间做皮肤切口。皮肤切开后，第一层肌肉表面应可见一条白色纤维状组织中线，其质地呈胶冻样。沿白色中线在第一层肌肉上做一个大小相似的切口。切勿超过明显的第二胸椎（T2）棘突，因为附近有主要血管。使用两个牵开器分别置于头侧和尾侧，将第一层肌肉牵开。现在应可见具有横纹外观的第二层肌肉。找到第二层肌肉的中线位置，此处可观察到两条纵向肌肉，由一层薄的膜状组织连接。然后使用一对显微剪刀解剖该膜状组织，分离这两条纵向肌肉。调整拉钩以暴露覆盖脊柱的第三层薄肌。用镊子轻轻触碰第三层肌肉，可触及棘突。使用显微剪刀在第三层肌肉上做一小切口，并用刮匙或手术刀以侧向方式轻轻刮除骨面肌肉，以清晰暴露椎骨。为暴露左侧 C5 至 C8 背根神经节（DRG），使用精细骨剪对 C4 至 T1 椎体进行左侧半椎板切除术，小心地去除部分椎板和椎弓根。当暴露足够范围的 DRG 以进行注射后，准备注射器：将装有病毒的微升注射器（配备自制的 33 号钝针头）安装至立体定位注射器架上。接着，使用 30 号斜面针头在每个目标 DRG 上制作一个小的浅表切口，以辅助注射针头的插入。轻柔调整立体定位坐标，将33号针头插入背根神经节（DRG）中心。理想情况下，针头应置于DRG正中心，以确保注射液在DRG内均匀扩散。针头插入后，使用输注注射泵向每个DRG注射一微升病毒液。注射过程中，若病毒溶液中含有有色染料，背根神经节（DRG）会逐渐改变颜色。切勿过度插入针头，以免液体从DRG腹侧漏出。若注射时发生泄漏，应立即调整针头位置。注射结束后3分钟，撤出注射针。为同时实施C5至C8背根 crush 损伤，使用一对尖头镊子对每条神经根各夹压3次，每次持续10秒。夹压时须使镊子尖端完全闭合。在组织上，压迫部位应出现一条白色线条。手术完成后，在缝合切口前，需确保手术部位无出血或残留的细小骨碎片。如有需要，可在暴露的脊髓和背根神经节（

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

背根神经节内注射和背根挤压伤为感官轴突再生模型

我们介绍了一种在轴突损伤后从背根神经节组织中进行染色质免疫沉淀的方法。该方法可用于鉴定特定转录因子的结合位点以及组蛋白和DNA的表观遗传修饰，这些修饰对于周围和中枢神经系统中受损轴突的再生具有重要意义。...

脊髓背根神经节组织在轴突损伤后的染色质免疫沉淀

本文描述了一种用于在背根挤压损伤后监测初级感觉轴突的体内成像方案。该方法利用宽场荧光显微镜和thy1-YFP转基因小鼠，可对周围神经系统中长达4...

脊神经后根切断术后背根轴突的活体成像

本报告中，我们描述了一种 crush 小鼠坐骨神经的方法。该方法使用常规可得的止血钳，能够简便、可重复地实现完全的坐骨神经 crush。此外，我们还介绍了一种制备肌肉全装片的方法，适用于在坐骨神经 crush...

可重复的小鼠坐骨神经挤压损伤模型及通过完整肌肉标本分析评估再生

关键词：小鼠，坐骨神经，神经挤压，神经再生，完整肌肉标本，神经功能评估

本文描述了一种利用培养的成年小鼠背根神经节神经元进行轴突再生遗传学研究的体外模型。该方法包括重新悬浮和再接种步骤，以允许经历遗传操作的神经元重新生长轴突。该策略对于利用基于RNA干扰的蛋白敲低技术进行轴突再生的缺失功能研究尤为有用。...

成年背根神经节神经元培养体系中的轴突再生遗传学研究

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小鼠坐骨神经挤压损伤后的轴突再生

利用背根神经节注射与背根挤压损伤在大鼠中建立感觉轴突再生模型

来源：Li, Q. et al. 研究哺乳动物轴突再生：成年小鼠背根神经节的体内电穿孔。 J. Vis. Exp.

电穿孔介导的小鼠背根神经节转染以促进感觉轴突再生

黑腹果蝇 幼虫因其半透明的角质层和强大的遗传学工具，成为活体成像的理想模型系统。本方案描述了如何利用一种单层聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置，即“幼虫芯片”，对3龄幼虫神经元中的细胞过程进行活体成像rd 龄期 果蝇...

使用微流控芯片进行活体成像及损伤反应研究 果蝇 幼虫

在此，我们介绍一种使用 黑腹果蝇 感觉神经元 - 树突分支（da）神经元损伤模型，该模型结合了 体内 活体成像、双光子激光轴突/树突切割技术，以及强大的果蝇遗传工具箱,...

一种用于研究周围和中枢神经系统神经再生的 Drosophila In Vivo 损伤模型

电穿孔是一种将目的基因有效导入细胞的方法。通过应用该技术 体内 在成年小鼠背根神经节（DRG）神经元上，我们描述了一种用于研究轴突再生的模型 体内.

研究哺乳动物轴突再生：体内电穿孔成年小鼠背根神经节

学习背根神经节注射联合背根挤压伤技术，用于研究成年大鼠感觉轴突再生及基因治疗应用。该方法可在不损伤脊髓的情况下评估轴突再生能力，改善动物福利并减少术后并发症。

背根神经节注射与背根挤压损伤作为感觉轴突再生的研究模型

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