背根神经节内注射和背根挤压伤为感官轴突再生模型

该协议提出了使用背根神经节 （DRG） 注射病毒载体和成年大鼠并发背根挤压伤作为研究感觉轴突再生的模型。该模型适用于研究使用基因疗法促进感觉轴突再生。

这种手术方法的目标是直接在神经元细胞体水平上应用治疗，并评估治疗干预后的轴突再生，而无需在中枢神经系统内进行更具破坏性的病变。这种方法可以帮助回答轴突再生领域的关键问题，例如，治疗治疗的轴突能否在脊髓中再生，并可能到达脑干靶点？这项技术的主要优点是研究人员可以检查 CNS 轴突再生，而不必直接损伤脊髓。

这减少了术后并发症，并改善了动物福利。首先对动物进行适当的麻醉。通过对脚趾捏没有反应来确认手术麻醉平面。

然后称量动物并记录术前体重。对于手术 DRG 注射，从耳朵之间到肩胛骨下方剃掉脖子上的毛皮。用消毒产品对剃须区域进行消毒。

动物的侧面皮下注射两毫升生理盐水，以及适当剂量的镇痛药和抗生素。在双眼涂抹眼膏，以防止手术过程中角膜干燥。将动物放在脊柱立体定位框架中，并在动物下方放置 37 摄氏度的加热垫。

通过定位皮肤上突出的 C2 和 T2 棘突来开始手术。然后使用 10 号手术刀在 C2 和 T2 棘突之间做一个皮肤切口。一旦皮肤打开，第一层肌肉上应该可以看到一条白色的纤维组织中线，它具有果冻状质地。

沿着白色中线在第一层肌肉上做一个类似大小的切口。不要超过第一个突出的 T2 棘突，因为附近有一条主要血管。使用两个牵开器缩回第一层肌肉，一个放在嘴部，一个放在尾部。

具有横纹外观的第二层肌肉现在应该可见。找到第二层肌肉的中线，在那里可以观察到两块纵向肌肉，由一根薄的膜组织连接。然后用一把微型剪刀解剖膜组织，将两块纵向肌肉分开。

调整牵开器，露出覆盖脊柱的第三层薄肌肉。用一对镊子轻轻触摸第三层肌肉可以感觉到棘突。用微型剪刀在第三层肌肉上做一个小切口，轻轻地从骨头上刮掉肌肉，用刮刀或手术刀侧向，清楚地露出椎骨。

要将左侧 C5 暴露于 C8 DRG，请使用一对细骨剪在 C4 至 T1 椎骨上进行左半椎板切除术，小心去除部分椎板和椎弓根。一旦暴露了足够的 DRG 以进行注射，通过将装有定制 33 号钝针的充满病毒的微升注射器放在立体定位注射器支架上来准备注射器。接下来，使用 30 号斜面针在每个目标 DRG 上开一个小的浅表开口，以帮助插入注射针。

轻轻调整立体定位坐标，将 33 号针插入 DRG 的中心。理想情况下，针头应放置在 DRG 的正中心，以确保进样器溶液在整个 DRG 中均匀扩散。插入针头后，使用输注注射泵将 1 微升病毒注射到每个 DRG 中。

在注射过程中，如果病毒溶液中含有有色染料，DRG 会慢慢变色。不要过度插入针头，因为这可能会导致液体从 DRG 的腹侧泄漏出来。如果在注射过程中发生泄漏，请立即调整针头的位置。

注射结束后 3 分钟，取出注射针。要同时进行 C5 至 C8 背根挤压伤，请使用一对细尖镊子将每个牙根挤压 3 次，持续 10 秒。完全对着镊子的末端。

挤压部位应出现组织中的白线。手术后，确保切口部位没有出血或留下小块骨碎片，然后再闭合。如果愿意，在暴露的脊髓和 DRG 顶部放置一小块手术可吸收海绵。

让第三层肌肉自然缩回脊柱上，无需缝合。用可吸收的 6-0 缝合材料松散地缝合第二层上的两块纵向肌肉。用可吸收的 6-0 缝合材料缝合第一层肌肉。

用可吸收的 5-0 缝合材料缝合皮肤。如果手术过程中发生大量出血，请在当地法规允许的情况下皮下注射 1 至 2 毫升生理盐水，以补充动物流失的液体。提供可食用的保湿凝胶，让动物从麻醉中完全恢复。

在返回饲养区之前，经常监测动物至少一小时。下图显示了术后动物在第 1 天、第 7 天、皮肤缝合线移除后和第 14 天的恢复情况。在组织收集前一周，像以前一样适当麻醉动物，然后通过将肢体贴在桌子上来稳定左前爪。

在注射 CTB 之前，使用 30 号斜面针头在皮肤上开一个小的浅表开口，以帮助插入注射针头。然后使用装有定制 33 号短针头的微升注射器，将 1 微升 1%CTB 缓慢皮下注射到无毛脚垫和四个手指的中心。让动物从麻醉中完全恢复，然后再返回饲养区。

该图显示了 DRG 注射的结果，没有背根挤压伤。注射 GFP 阳性细胞体和脊髓轴突后 4 周AAV5GFP清晰可见。这张放大倍率较高的图像显示了背柱和背角中的轴突。

DRG 中 GFP 标记的细胞体如图所示。该图显示了 CTB 注射后 1 周楔核中的 CTB 阳性轴突末端。下图显示了完全性背根挤压伤的结果。

如图所示，GFP 标记的轴突切割感觉轴突可以再生到背根进入区，但在受伤后不能再生到脊髓。这是同一动物的楔状核的图像。完全性背根挤压伤后不存在 CTB 阳性轴突末梢。

损伤后脊髓中存在标记的轴突代表不完全损伤或再生。楔形核中存在 CTB 阳性末梢表明损伤不完全，而不存在则表明完全损伤和可能部分再生到脊髓中。在参加此手术时，重要的是要去除适量的椎骨以暴露 DRG 和背根，而不会引起任何不必要的损伤，尤其是对脊髓的伤害。

否则，这可能会导致意外的术后并发症。观看此视频后，您应该对如何执行 DRG 注射有很好的了解。您可以结合其他技术，例如中央脊髓损伤、电生理学、行为测试和解剖学分析来检查轴突再生。