哺乳动物细胞细菌挑战后应激颗粒形成的免疫荧光分析

我们描述了在用细菌和许多不同的应力攻击细胞后，哺乳动物细胞中应激颗粒形成的定性和定量分析的方法。该方案可用于研究广泛的宿主细菌相互作用中的细胞应激颗粒反应。

本实验的总体目标是评估细菌感染对宿主细胞形成应激颗粒以响应外源性应激的能力的影响。该方法是细胞微生物学领域的宝贵工具，用于评估给定的病原体是否能够改变或破坏整个应激颗粒途径。该技术的主要优点是可以使用免费的图像分析程序以严格和自动化的方式对应力颗粒进行定性和定量分析。

这种方法提供了对应激颗粒形成和组成的动力学以及这些参数如何受特定病原体影响的见解。谢谢。在开始挑战之前，将来自新鲜划线的胰蛋白酶大豆琼脂 1% 刚果红琼脂平板中的红色 S.flexneri M90T 菌落接种到含有 8 毫升胰蛋白酶大豆肉汤的 15 毫升锥形管中。

拧紧盖子后，以 222 RPM 和 30 摄氏度振荡孵育菌落过夜。第二天，在 37 摄氏度和 222 RPM 的 8 毫升新鲜胰蛋白酶大豆汤中将 150 微升细菌传代培养约两个小时，以启动毒力基因表达的晚期指数期诱导并增强细菌的感染性。当传代培养物的光密度在 0.6 和 0.9 之间时，将 1 毫升细菌转移到 1.5 毫升的试管中，以便通过离心收集。

并将沉淀以光密度 1 重新悬浮在感染培养基中。接下来，从 HeLa 细胞盖玻片培养物的每个孔中吸出上清液。并用每孔 500 微升新鲜室温 HeLa 细胞培养基小心洗涤 HeLa 细胞。

用每孔 500 微升感染培养基替换洗涤液，并离心 24 孔板以将细菌旋转到细胞上。将沉淀的细菌共培养物转移到 37 摄氏度的组织培养箱中 30 分钟，以促进宿主细胞感染。孵育结束时，每次洗涤在 1 毫升新鲜的 37 摄氏度 HeLa 培养基中冲洗 3 次，从细胞中去除外源细菌。

然后用 1 毫升含有庆大霉素的新鲜培养基覆盖感染的细胞，并将板放回细胞培养箱中。在孵育结束时，用 500 μL 适当的培养基替换培养基，并补充感兴趣的压力源，然后将细胞放回组织培养箱中。1 小时后，完全吸出上清液，并将样品固定在 0.5 mL 室温 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液中 30 分钟。

接下来，将固定剂丢弃到适当的废液容器中，用 1 毫升 tris 缓冲盐水轻轻摇晃清洗盖玻片 2 分钟。洗涤结束时，完全吸出 TBS 并用 500 微升 0.3%Triton X-100 的 TBS 溶液透化每个孔中的细胞。10 分钟后，用 1 毫升 TBS 替换透化液，轻轻旋转板，然后用 1 毫升封闭液替换 TBS，在室温下放置 1 小时。

要使用感兴趣的一抗混合物标记细胞，请将每个盖玻片的 50 μL 一抗混合物点在一块牢固地贴在工作台上的塑料封口膜上。然后用镊子拿起第一个盖玻片。然后将盖玻片的边缘轻拍在一张薄纸上以去除多余的液体。

小心地将盖玻片放在液滴上，并在适当的标记条件下孵育盖玻片。在一抗标记孵育结束时，将每个盖玻片转移到新的24孔板的单个孔中，每孔含有1毫升TBS，并在室温下在平板振荡器上洗涤细胞5分钟3次。最后一次洗涤后，用适当的二抗混合物标记每个盖玻片上的细胞，如刚才所示。

并将盖玻片在室温下避光孵育 1 小时。在二抗标记孵育结束时，在新的 24 孔板中用 1 毫升 PBS 洗涤细胞 3 次，轻轻摇动，如前所述，但要避光。最后一次洗涤后，将每个盖玻片短暂浸入去离子水中以去除盐分，将盖玻片边缘轻拍到纸巾上，然后小心地将盖玻片贴在每张玻璃显微镜载玻片上 5 微升荧光封固剂上，无气泡。

然后用指甲油密封盖玻片。并适当储存载玻片直至成像。要通过荧光共聚焦显微镜对细胞进行成像，首先要选择合适的物镜和合适的荧光通道进行图像采集。

然后使用适当的成像软件获取细胞的图像堆栈。捕获完所有图像后，使用适当的图像分析软件折叠图像堆栈并将堆栈另存为 TIFF 文件。接下来，将控件和实验性 TIFF 图像加载到图像分析平台，然后选择 Lookup Table 以在 Sequence 窗口中打开通道参数。

单击所有 channel 选项卡复选框以停用所有渠道。然后单击通道 0，然后单击通道 0 颜色条以选择首选颜色，根据需要增加通道的强度以可视化所有结构。为实验分析选择并调整每个适当的颜色通道后，选择画布选项卡并调整缩放选项卡以可视化每个观察场约 10 个单元格。

使用面工具，单击感兴趣的像元并延长像元周围的线以描绘像元边界。要命名此感兴趣区域，请在 Region of interest （感兴趣区域） 窗口中，右键单击感兴趣的单元格，然后双击感兴趣区域的名称以对其进行修改。以相同的方式选择并命名所有感兴趣的细胞后，在 detection and tracking 选项卡中打开 Spot Detector 应用程序。

打开 Pre Processing 选项卡，然后选择要分析的渠道。在 Detector（检测器）选项卡中，选择 Detect bright spots over dark background（检测深色背景上的亮点），然后选择适当的刻度和灵敏度。在 Region of Interest 选项卡下，从序列中选择建议的感兴趣区域。

在 Filtering 选项卡下，选择 NoFiltering。在 Output 选项卡中，选择相应的输出。选择 Remove previous spot render渲染为感兴趣区域，然后单击 no file selected 以选择用于保存文件的文件夹。

然后在 Display 选项卡下，选择感兴趣的适当选项，然后单击 Start Detection。在成像分析软件中，光斑检测器可用于识别每个指定感兴趣区域内的应力颗粒。然后可以生成二进制图像来显示所有已识别的应力颗粒。

应力颗粒分析必须针对所分析的每个应力颗粒市场进行仔细定制。例如，更改检测到的目标区域的大小要求或更改检测参数的灵敏度会导致结果不同。在较高的像素大小尺度上，较小的应力颗粒将不会被计数，并且应力颗粒的数量将减少。

而提高灵敏度会导致应力颗粒的数量增加。例如，在这个实验中，灵敏度为 100 的 2 分制给出了应激颗粒标记物 G3BP1 的最佳结果。而灵敏度为 55 的 2 分制对 EIF3B 应激颗粒标记物给出了最佳结果。

然后可以根据应力颗粒的大小计算表面积。频率分布图可用于突出显示不同细胞群之间应激颗粒大小的变化。此外，荧光的强度可以提供有关分析的应力颗粒质量的信息。

一旦掌握，全细胞激发试验可以在大约 6 到 7 小时内完成，分析可以在另外 2 到 3 小时内完成。在尝试此过程时，请务必记住始终在相同条件下同时处理对照和实验样品，以最大限度地减少数据中的可变性。按照此程序，分析还可以扩展到三维体积，以进一步了解应力颗粒定位。

这种半自动程序允许对未感染和感染细胞中的应激颗粒进行严格和公正的分析。它可以揭示以前未知的应激颗粒途径的颠覆。看完这个视频后，你应该对如何用细菌感染细胞、如何诱导应激颗粒的形成，以及如何使用半自动方法以定性和定量的方式分析应激颗粒有了很好的了解。

不要忘记，使用福氏志贺氏菌和克霉唑等应激颗粒诱导剂可能是危险的，并且有必要采取预防措施，例如戴手套、在 BL2 实验室工作和正确丢弃所有试剂。