哺乳动物细胞经细菌攻击后应激颗粒形成的免疫荧光分析

本实验的总体目标是评估细菌感染对宿主细胞在应对外源性应激时形成应激颗粒能力的影响。该方法在细胞微生物学领域中是一种有价值的工具，可用于判断特定病原体是否能够改变或破坏整个应激颗粒通路。该技术的主要优势在于，可利用免费的图像分析程序以严谨且自动化的方式对应激颗粒进行定性和定量分析。

该方法可深入了解应激颗粒的形成动态及其组分，以及这些参数如何受到特定病原体的影响。谢谢。在开始感染实验前，从新近划线的含1%刚果红的胰蛋白胨大豆琼脂平板上挑取一株红色的 S.flexneri M90T 细菌单菌落，接种至含有8毫升胰蛋白胨大豆肉汤的15毫升圆锥管中。

拧紧盖子后，于30摄氏度、222转/分钟振荡培养过夜。次日，取150微升菌液接种于8毫升新鲜胰蛋白胨大豆肉汤中，于37摄氏度、222转/分钟培养约2小时，以启动毒力基因表达的对数后期诱导并增强细菌感染能力。当亚培养物的光密度值达到0.6至0.9之间时，转移1毫升菌液至1.5毫升离心管中，通过离心收集细菌。

将沉淀重悬于感染培养基中，调整光密度至1。接下来，吸去每个孔中HeLa细胞盖玻片培养物的上清液，并用500 µL新鲜的室温HeLa细胞培养基小心洗涤每个孔中的HeLa细胞。

每孔加入 500 微升感染培养基替代洗涤液，将 24 孔板离心，使细菌沉淀至细胞表面。将已沉淀的细菌共培养物转移至 37 °C 细胞培养箱中孵育 30 分钟，以促进宿主细胞感染。孵育结束后，用 1 毫升新鲜的 37 °C HeLa 细胞培养基洗涤三次，每次洗涤去除细胞外的细菌。

然后，用含有庆大霉素的一毫升新鲜培养基覆盖感染的细胞，并将培养板放回细胞培养箱中。孵育结束后，更换为500微升含有相应应激因子的适当培养基，将细胞重新放回组织培养箱中。一小时后，彻底吸除上清液，加入0.5毫升室温的含4%多聚甲醛的PBS溶液固定样本，固定30分钟。

接下来，将固定液弃入适当的废液容器中，用一毫升的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS）清洗盖玻片，轻轻振荡两分钟。清洗结束后，彻底吸除 TBS，并在每个孔中加入 500 微升含 0.3% Triton X-100 的 TBS 溶液，对细胞进行透化处理。10 分钟后，用一毫升 TBS 替换透化液，轻轻摇动培养板，再用一毫升封闭液替换 TBS，在室温下封闭一小时。

为了用目标的一抗混合物标记细胞，将每张盖玻片50微升的一抗混合液滴加到一块牢固粘贴在实验台面上的塑料Parafilm上。然后使用镊子夹起第一张盖玻片，并将盖玻片边缘轻触一张纸巾以去除多余的液体。

将盖玻片小心地放置在液滴上，并在适当的标记条件下孵育盖玻片。在一抗标记孵育结束后，将每张盖玻片转移至新的24孔板的独立孔中，每孔加入1毫升TBS，于室温下在摇床中洗涤5分钟，重复三次。最后一次洗涤后，按照前述方法，用适当的二抗混合液对每张盖玻片上的细胞进行标记。

在室温下避光孵育盖玻片一小时。在二抗标记孵育结束后，于新的24孔板中，用一毫升磷酸盐缓冲液轻轻振荡洗涤细胞三次，每次洗涤均需避光，操作方法如前所示。最后一次洗涤后，将每片盖玻片短暂浸入去离子水中以去除盐分，用纸巾轻蘸盖玻片边缘，然后小心地将盖玻片移至载玻片上，每片使用五微升荧光封片剂，避免产生气泡。

然后用指甲油封固盖玻片，并将载玻片适当保存至成像前。使用荧光共聚焦显微镜对细胞成像时，首先选择合适的物镜和相应的荧光通道以进行图像采集。

然后使用适当的成像软件获取细胞的图像序列。当所有图像采集完成后，使用相应的图像分析软件将图像序列进行合并，并将合并后的图像序列保存为TIFF文件。接着，在图像分析平台中加载对照组和实验组的TIFF图像，选择“查找表”以在“序列”窗口中打开通道参数。

取消勾选所有通道选项卡的复选框以关闭所有通道。然后点击通道零，再点击通道零的颜色栏以选择所需颜色，并根据需要增加该通道的强度，以便观察所有结构。在为实验分析选择并调整每个合适的颜色通道后，选择画布选项卡，并调节缩放选项，使每个视野中约显示10个细胞。

使用多边形工具，单击目标细胞，并沿细胞周围延伸线条以勾画细胞边界。要为该兴趣区域命名，请在兴趣区域窗口中右键单击目标细胞，然后双击兴趣区域的名称以进行修改。以相同方式选择并命名所有目标细胞后，打开检测与追踪选项卡中的 Spot Detector 应用程序。

打开预处理选项卡，选择待分析的通道。在检测器选项卡中，选择“在暗背景下检测亮斑点”，并选择合适的尺度和灵敏度。在兴趣区域选项卡下，从序列中选择推荐的兴趣区域。

在“过滤”选项卡下，选择“无过滤”。在“输出”选项卡下，选择适当的输出选项。勾选“移除先前作为感兴趣区域渲染的斑点”，然后点击“未选择文件”以选择用于保存文件的文件夹。

然后在“显示”选项卡下，选择相应的感兴趣选项，然后单击“开始检测”。在成像分析软件中，可使用斑点检测器来识别每个指定感兴趣区域内的应激颗粒。随后可生成一幅二值图像，以显示所有已识别的应激颗粒。

应针对所分析的每种应激颗粒市场仔细调整应激颗粒分析的参数。例如，改变检测到的兴趣区域的尺寸要求，或改变检测参数的灵敏度，均会导致结果不同。在较大的像素尺寸尺度下，较小的应激颗粒将不会被计数，导致应激颗粒的数量减少。

提高灵敏度会增加应激颗粒的数量。例如，在本实验中，灵敏度为100时，设置尺度为2可获得应激颗粒标志物G3BP1的最佳结果；而灵敏度为55时，设置尺度为2可获得EIF3B应激颗粒标志物的最佳结果。

随后可根据应激颗粒的大小计算其表面积。频率分布图有助于突出显示不同细胞群体之间应激颗粒大小的变化。此外，荧光强度可提供有关所分析应激颗粒质量的信息。

一旦熟练掌握，整个细胞实验挑战可在大约六到七小时内完成，分析过程则可在另外两到三小时内完成。在进行该实验操作时，重要的是始终要记住，对照样本和实验样本必须同时处理，并在相同条件下进行，以尽量减少数据内的变异性。完成本操作步骤后，分析还可进一步扩展至三维空间体积，以更深入地了解应激颗粒的定位情况。

这种半自动化的实验流程可对未感染和感染细胞中的应激颗粒进行严格且无偏倚的分析，有助于揭示应激颗粒通路此前未知的异常调控机制。观看本视频后，您将充分掌握如何用细菌感染细胞、如何诱导应激颗粒的形成，以及如何采用半自动化方法对应激颗粒进行定性和定量分析。

并且不要忘记，使用志贺氏菌（Shigella flexneri）以及氯苯甲咪唑等可诱导应激颗粒的试剂可能存在危险，必须采取预防措施，例如佩戴手套、在生物安全二级（BL2）实验室中操作，并妥善处理所有试剂。