激光局部补骨脂素加合物的单分子分析
April 20th, 2017
激光器在对DNA损伤的细胞应答的研究经常使用的。然而，它们产生的病变，其间隔，频率，和碰撞与复制叉很少表征。在这里，我们描述了一种方法，使这些参数与激光局部间交联的决心。
该程序的总体目标是对基因组 DNA 中激光定位链间交联的分布进行单分子分析，以研究细胞对 DNA 链间交联的反应。这种方法可以帮助回答 DNA 修复领域的关键问题，即激光技术（一种广泛使用的实验工具）引入的 DNA 损伤分布。该技术的主要优点是它允许对基因组 DNA 中激光激活化合物引入的 DNA 损伤进行直接成像。
这在以前是不可能的。演示该程序的将是来自我们实验室的 Julia Gichimu 和 Hima Gali。每次使用瞄准激光时，都必须执行镜面载玻片校准，以验证激光是否击中了适当的 XYZ 坐标，并确定了相机捕获的激光可以击中的区域。
在幻灯片上查找之前蚀刻过的字段。设置曝光时间和激光功率。然后调整焦点以移动到镜像幻灯片上附近的非目标区域。
开始校准程序。该软件将发射激光以沿水平线和对角线蚀刻镜面幻灯片。这些线定义了激光可以击中目标单元的场边界。
在场内设置多个感兴趣区域 （ROI） 并发射激光以确认它瞄准所选区域，从而击中适当的 XYZ 坐标。在设置显微镜瞄准激光系统时，还必须进行生物校准。第一步是定义光活化三甲基补骨脂素 （TMP）、诱导链间交联并引发 GFP 标记修复因子募集所需的最小激光功率，其动力学先前可以表征。
在该实验室中，使用用表达 GFP 扇形 1 的质粒稳定转染的 U2OS 细胞系。如此处所示，当细胞暴露于 6 微摩尔 TMP 和 1.2% 激光图像下 10 分钟时，将图像序列视为视频可确认 GFP fan 1 的募集到目标 ROI。第二步是验证此功率设置在不存在化合物的情况下不会触发募集。
如此处所示，当细胞暴露于 1.2% 激光单独图像 10 分钟并将图像视为视频时，GFP fan one 不会募集到目标 ROI。第三，定义能够吹毁电池的最小功率设置很重要。应每天使用靶向激光作为常规生物校准来测试在此功率设置下吹灭细胞的能力。
在细胞核内设置 ROI，同时避开核仁。调整焦距。将激光功率设置为 12% 并点火。
最后，必须将焦平面设置在中间单元以实现正确的瞄准。为了证明这一点，三个单元针对三个焦平面。中单元。
太高了。而且太低了。瞄准后 3 分钟，生成一堆跨越 3 微米的图像，以检查 GFP 扇形分布，在整个成像焦平面上有一条条纹。
只有针对中间像元的像元在所有 Z 平面中显示一个 GFP 扇形一条带。在进行激光定位之前，准备用于生长细胞的 35 毫米玻璃底细胞培养皿。用记号笔在每个盘子的侧面做一个垂直标记。
用金刚石笔在培养表面的玻璃杯中心划一个十字，使培养皿侧面的黑色条纹位于十字架的一个臂的顶部。在玻璃的生长表面上标记十字，以便它和细胞位于同一焦平面上。将细胞和灭菌的交叉标记培养皿铺板，并在 1 微摩尔 5 氯脱氧尿嘧啶中孵育 24 小时，以均匀标记 DNA。
在实验当天，向细胞培养基中加入地高辛连接的 TMP 或在 50% 乙醇中挖掘 TMP，至终浓度为 20 微摩尔。将培养基加热至 37 摄氏度。用含有培养基的 dig TMP 替换培养皿中的培养基，并在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育 30 分钟，以使 dig TMP 平衡。
如前所述，当细胞孵育时，进行镜像载玻片校准并从细胞中吹出 12%。将板放入 37 摄氏度的环境室中，在显微镜载物台上控制 CO2 和湿度。使用 60 倍油物镜聚焦在十字架的交叉点上。
选择要定位的第一个字段，并使用形状工具在位于十字交叉点附近的单个单元格中设置 ROI。选择核仁外的核质区域。调整 Z 焦平面以瞄准穿过原子核中间的激光。
接下来，将功率设置设置为在链间交联诱导的 DNA 损伤反应中激活补骨脂素所需的最小值。1.2% 在此处使用。发射激光。
在字段中的所有单元格都成为目标后，将板移动到新字段，保持靠近十字的交点。重复刚刚在 12 到 18 个字段中演示的程序，以靶向总共 80 到 100 个细胞。要收获细胞，请从载物台中取出培养皿。
去除培养基并用 PBS 溶液洗涤细胞。去除 PBS，将 10 微升市售胰蛋白酶 EDTA 溶液滴在玻璃表面中间的交叉交叉点上。在室温下孵育 3 至 4 分钟，然后将含有分离细胞的胰蛋白酶溶液吸入移液器吸头中。
将胰蛋白酶 EDTA 滴和细胞放在硅烷化玻璃显微镜载玻片的一端。要裂解细胞并释放 DNA，请加入 10 μL 5% SDS 溶液，在室温下孵育 3 至 4 分钟，用移液器吸头轻轻混合，让池的外围干燥。将载玻片倾斜 20 度，让液体流到末端。
流动液体的流体动力会延伸和拉伸 DNA 纤维。让玻片风干 10 分钟。将玻片浸入 3 比 1 甲醇与乙酸的溶液中，并固定 10 分钟。
然后从固定溶液中取出载玻片并再次风干。此时，玻片可以在 20 摄氏度的 70% 乙醇中无限期储存。要处理载玻片以通过荧光显微镜检测 DNA 纤维上的 dig 信号，请从 70% 乙醇溶液中取出带有拉伸 DNA 的载玻片，并使其自然干燥。
随后在氯化氢中使 DNA 纤维变性，然后将它们转移到 PH 值为 8 的 tris 盐酸盐容器中进行中和。接下来在 PBS 中洗涤样品。最后，按照先前发布的程序用适当的抗体对它们进行染色。
显示了带有二氧化根素标签的三甲基补骨脂素的结构。链间 DNA 交联 （ICL） 可以通过针对 dig TMP 的免疫荧光来显示。此示例显示了具有 DNA 损伤反应 γ H2AX 的已知标记物积累的细胞，以绿色显示，在包含激光定位 ICL 的 ROI 中以红色显示。
DAPI 染色的细胞核为蓝色。明场显示钻石笔标记上的部分单元格。请注意，ROI 位于核仁之外。
为了确定加合物的频率和间距，在引入 ICL 之前，将细胞在 5 个氯脱氧尿苷中孵育 24 小时。在收获细胞并铺展 DNA 纤维后，通过氨基荧光（以绿色显示）在 5 个氯脱氧尿嘧啶中用红色显示的氨基量子点检测 dig 信号。对光纤上挖掘信号的分析表明，ICL 间距离范围从小于 10 KB 到大于 160 KB。没有证据表明加合物成簇。
遵循这些指南，应该可以将这种方法扩展到其他 DNA 加合物，例如可以通过适当波长的激光定位的氧化损伤。
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概述
本文介绍了一种用于基因组DNA中激光定位的单分子间交联分析方法。其目的是增进对由这些损伤引起的DNA损伤的细胞反应的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- DNA损伤反应
- 基因组分析
- 激光技术应用
背景
- 激光常用于研究DNA损伤。
- 损伤间距和频率的表征通常缺乏。
- 理解DNA损伤对于DNA修复领域至关重要。
- 这种方法允许直接成像DNA损伤。
研究目的
- 分析DNA中分子间交联的分布。
- 研究这些DNA损伤引起的细胞反应。
- 提供对激光技术对基因组DNA影响的见解。
使用的方法
- 单分子分析技术。
- 针对激光的校准以实现准确定位。
- 使用激活化合物激光直接成像DNA损伤。
- 验证激光应用的XYZ坐标。
主要结果
- 成功成像激光定位的分子间交联。
- 建立了可靠的激光针对校准方法。
- 对DNA损伤分布的洞察。
- 增强了对DNA损伤的细胞反应的理解。
结论
- 这种方法为研究DNA损伤提供了新的方法。
- 它允许精确分析DNA损伤。
- 未来的应用可能推进DNA修复研究领域。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization of interstrand crosslink (ICL) distribution in genomic DNA, providing critical insights into DNA damage response mechanisms. By combining laser localization with single-molecule fiber analysis, it supports mechanistic de-risking in target validation for genotoxic stress pathways. The approach enhances predictive confidence in preclinical models by quantifying lesion spacing and replication fork encounter patterns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to DNA repair pathway activation by ICLs.
- Operational Value: Provides quantitative inter-lesion distance measurements to clarify spatial distribution of DNA damage.
- Strategic Value: Supports biological de-risking of targets involved in ICL response through direct lesion imaging.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible, quantifiable outputs for adduct distribution analysis using immunoquantum dot detection.
- Operational Value: Standardizes DNA fiber preparation and lesion visualization for consistent compound screening.
- Strategic Value: Enables scalable assessment of genotoxic compound effects on replication fork progression.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links laser-induced ICLs to replication fork collision patterns, informing disease-relevant mechanistic models.
- Operational Value: Facilitates cross-functional collaboration through standardized lesion mapping and encounter pattern classification.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by correlating adduct spacing with cellular response kinetics.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology by enabling hypothesis testing of DNA lesion distribution and replication stress responses, directly supporting lead identification in genotoxic compound screening.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking through direct imaging of laser-localized ICLs in genomic DNA.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative readouts on inter-lesion distances and replication fork encounter frequencies.
- Analytics: Provides statistical outputs on adduct spacing (10 KB to >160 KB) and encounter pattern classification for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery-phase lesion mapping to preclinical continuity via quantifiable DNA damage metrics.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for single-molecule adduct analysis applicable across DNA-damaging agents.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in ICL response pathways.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through laser calibration and single-molecule fiber spreading protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing quantitative lesion distribution data for capital-efficient prioritization.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement through direct correlation of adduct spacing with functional DNA repair outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in laser microbeam operation, DNA fiber spreading, and immunofluorescence detection.
- Needs calibration infrastructure for mirror slide and biological validation of laser targeting precision.
- Demands cross-team standardization of ROI selection, focal plane setting, and lesion quantification procedures.
- Involves adaptation considerations for different adduct types and cell line models beyond psoralen-induced ICLs.
- Dependent on proper controls to distinguish compound-specific effects from laser-only artifacts, as validated by recruitment absence in TMP-free conditions.
