Name: S100A12的表达，纯化和抗菌活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 学习S100A12抗菌肽的表达与纯化方法，用于幽门螺杆菌抗菌活性检测。该优化方案可获得高产量稳定的S100A12二聚体，有助于研究营养免疫机制及开发新型抗菌分子。

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本研究得到了美国退伍军人事务部职业发展奖1IK2BX001701、美国国家转化科学促进中心通过国家卫生研究院转化科学奖UL1TR000445、美国国家科学基金会奖号1547757和1400969，以及美国国立卫生研究院资助项目GM05551的支持。本研究内容的全部责任由作者承担，不代表国家转化科学促进中心或美国国立卫生研究院的官方观点。

1. S100A12 的表达
<ol>
	<li>使用标准热激方法将 pGEMEX-S100a12 质粒转化至 BL21 DE3 感受态细胞18。在冰上向 50 µL 细菌中加入 1 至 5 µL 质粒，置于微量离心管中，孵育 20 分钟。</li>
	<li>在 42 °C 下热激 30 秒。</li>
	<li>将细胞置于冰上孵育 2 分钟。</li>
	<li>向细胞中加入 500 µL SOC 培养基，在 37 °C 下以 250 rpm 的转速在摇床中振荡培养 1 小时。</li>
	<li>取 150 µL 转化产物涂布于 LB-琼脂培养基（含 100 µg/mL 氨苄青霉素）。在 37 °C 下孵育 12–16 小时。</li>
	<li>挑取单菌落，接种至 2 mL LB 培养基（含 100 µg/mL 氨苄青霉素）中。</li>
	<li>在 37 °C 下以 300 rpm 的转速在摇床中振荡培养 4–6 小时，OD600 应达到 1–3 吸光度单位。</li>
	<li>将 500 µL 起始培养物接种至 50 mL ZYM-5052 自诱导培养基26（含 100 µg/mL 氨苄青霉素）中。为获得最佳通气效果和最大表达量，使用 250 mL 带挡板的锥形瓶，在 37 °C 下以 300 rpm 振荡培养 24 小时。</li>
	<li>将细菌悬液转移至离心管中，在 4 °C 下以 4,000 × g 离心 10 分钟，收集菌体沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，记录样品信息，并将菌体沉淀在 -80 °C 下保存。样品可稳定保存数年。</li>
</ol>
2. 使用低压色谱法纯化 S100A12
<ol>
	<li>将细胞重悬于 30 mL 的 20 mM Tris（pH 8.0）中。</li>
	<li>在冰上对悬液进行超声处理以裂解细胞。使用约 20 W 输出功率，以 5 秒开启、5 秒关闭为一个循环，持续 5 分钟。</li>
	<li>将溶液转移至高速离心管中。在 4 °C 条件下，以 20,000 × g 离心 30 分钟，澄清细胞裂解物。</li>
	<li>倾去上清液并转移至洁净的 100 mL 聚丙烯烧杯中。将烧杯置于冰上冷却溶液。加入搅拌子，并缓慢加入 11.20 g 硫酸铵。让溶液在冰上继续搅拌 1 小时。此步骤将形成 60% 的硫酸铵溶液，使大多数 E. coli 内源性蛋白质沉淀，而 S100A12 保持可溶状态。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 20,000 × g 离心 20 分钟，使沉淀的蛋白质形成沉淀物。</li>
	<li>倾去上清液并转移至透析袋（截留分子量 3,500 kDa）中。在 4 °C 条件下，用 1 L 的 20 mM Tris（pH 8.0）缓冲液进行透析。更换透析缓冲液两次，每次间隔 4 小时。</li>
	<li>阴离子交换层析
	<ol>
		<li>在低压系统上进行层析，典型流速为 1 mL/min。</li>
		<li>用 10 mL 的 20 mM Tris（pH 8.0）平衡 5 mL Sepharose 柱。</li>
		<li>使用样品泵上样约 40 mL 的 S100A12 溶液（收集穿流液）。</li>
		<li>用 10 mL 的 20 mM Tris（pH 8.0）洗涤层析柱。</li>
		<li>使用 0–30% 的梯度（B 缓冲液为 20 mM Tris，pH 8.0，含 1 M NaCl）对层析柱进行洗脱，总体积为 19 个柱体积（CV，95 mL）。收集 5 mL 的组分。</li>
		<li>取每管 10 µL 等分试样，使用 MES SDS-PAGE 配合考马斯亮蓝染色进行分析。以恒定电压（20 V/cm）电泳 30 分钟。</li>
		<li>合并含有 S100A12 的组分。S100A12 在变性凝胶上的迁移分子量约为 10 kDa。</li>
		<li>使用超滤装置（截留分子量 10 kDa）将组分浓缩至 5 mL。在约 8 分钟内以 3,000 × g 离心，取上层组分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>凝胶过滤层析
	<ol>
		<li>用 1 个柱体积（120 mL）的 20 mM Tris（pH 8.0）、100 mM NaCl 缓冲液平衡 S75 柱。</li>
		<li>注入 &#60; 5 mL 浓缩后的 S100A12 组分（来自离子交换层析）。</li>
		<li>以 1 mL/min 的流速在 120 mL 范围内进行洗脱，收集 5 mL 的组分。</li>
		<li>取每管 10 µL 等分试样，使用 SDS-PAGE 配合考马斯亮蓝染色进行分析。通过 Western 印迹或质谱法验证蛋白质身份（单体亚基的计算分子质量为 10,575.0 Da，实测值为 10575.4 Da）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>合并组分
	<ol>
		<li>使用分光光度计测定蛋白质在 A280 处的吸光度，以 SEC 缓冲液作为空白对照。S100A12 同源二聚体的计算消光系数为 5960 M-1 cm-1。 
		注：每 50 mL 培养物通常可获得 35–45 mg 的 S100A12。</li>
		<li>将 S100A12 分装至 1.5 mL 微量离心管中（每管 1 mg），在液氮中快速冷冻后于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 抗微生物活性检测
<ol>
	<li>将幽门螺杆菌（H. pylori）G27菌株划线接种于添加5%绵羊血的胰蛋白胨大豆琼脂平板（血琼脂平板）上。在37 °C、含5%二氧化碳的空气中培养2-3天。</li>
	<li>将幽门螺杆菌（H. pylori）接种至添加1×胆固醇的布氏肉汤中。在37 °C、含5%二氧化碳的空气中，以250 rpm振荡培养过夜。</li>
	<li>将幽门螺杆菌（H. pylori）按1:10比例稀释至50%布氏肉汤和50%钙卫蛋白缓冲液中，加入1×胆固醇，分别培养于仅含基础培养基，或添加100 µM氯化锌及0、100或1,000 µg/mL纯化S100A12的培养基中。在37 °C、含5%二氧化碳的空气中，以250 rpm振荡培养过夜。</li>
	<li>次日，进行系列稀释后涂布于血琼脂平板。在37 °C、含5%二氧化碳的空气中培养2-3天，使细菌菌落生长。计数菌落形成单位，以计算在有或无S100A12和/或外源性锌条件下细菌的生长情况。</li>
</ol>

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文介绍了一种高效表达和纯化人源S100A12蛋白的实验方案。E. coli表达系统是生产重组蛋白最常用的工具，尤其适用于生化与生物物理研究中所需毫克级蛋白的制备。本方案的一个关键改进是采用自诱导培养基26，与标准的LB培养基相比，该方法可使纯化蛋白的产量提高近三十倍18。此外，自诱导培养基显著简化了蛋白表达的操作流程。使用传统培养基时，必须持续监测菌液生长状态，以便在对数生长期加入诱导剂；而使用自诱导培养基则无需监测倍增时间，菌液可直接培养至饱和状态。在自诱导培养基的初始生长阶段，E. coli以葡萄糖作为碳源；当葡萄糖耗尽后，细菌会转而利用乳糖作为碳源，从而启动蛋白表达26。自诱导培养基的组分经过精确优化，可支持高密度菌体生长，进而提高重组蛋白的表达水平。根据我们对S100A12蛋白的实验经验，自诱导培养基能显著增加目标蛋白的表达量，但需注意该效果可能因蛋白而异，应通过实验加以验证。
E. c...

S100蛋白是一类属于EF-手型钙结合蛋白家族的蛋白质，具有多种多样的功能1。它们以组织和细胞特异性的方式表达，调控广泛的细胞功能2,3。与其他钙结合蛋白不同的是，S100蛋白兼具细胞内和细胞外功能4,5。在细胞内，Ca2+的结合会诱导构象变化，暴露出一个疏水表面，从而特异性地结合靶蛋白伴侣6。这种细胞内机制调控着细胞增殖、分化和能量代谢等重要过程。在细胞外环境中，S100蛋白表现出两种功能7。其一，它们作为损伤相关分子模式（DAMP）蛋白，通过与模式识别受体相互作用，启动促炎性免疫反应8,9。此外，S100蛋白家族中的多个成员能够螯合过渡金属，这一功能在一种称为营养免疫的过程中起到剥夺微生物病原体必需金属的作用10,11。
S100A12（也称为钙粒蛋白C和EN-RAGE）在巨噬细胞和中性粒细胞中高表达，已被鉴定为炎症性疾病的潜在生物标志物12,13。除了在其EF-手结构域结合钙离子外，S100A12在二聚体界面的两端还具有两个高亲和力的过渡金属结合位点14,15。每个结合位点由三个组氨酸残基和一个天冬氨酸残基组成，能够螯合锌或铜16,17。最近，我们报道了S100A12依赖性的锌饥饿在调控幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）生长及促炎性毒力因子活性中具有重要作用18。
H. pylori 感染了全球约一半人口的胃部，可以说是最成功的一种细菌病原体19。感染 H. pylori 可导致多种严重的胃部疾病，包括胃炎、消化性溃疡和十二指肠溃疡、黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤以及侵袭性胃腺癌（胃癌）。胃癌是全球非贲门癌相关死亡的首要原因，而胃癌最主要的危险因素就是 H. pylori 感染。
H. pylori 尽管受到机体对病原体的强烈免疫反应，仍能在胃部生态位中持续存在，这凸显了深入理解控制该细菌感染的免疫机制的重要性20,21,22,23。H. pylori 相关的炎症特征表现为大量多形核细胞（即中性粒细胞）浸润，这些细胞在感染部位释放一系列抗菌蛋白，包括 S100A1218,24,25。为了理解宿主与病原体之间复杂相互作用的机制，我们致力于优化 S100A12 的纯化技术，并利用该蛋白研究其对该临床重要病原菌的抗菌作用。以下方案概述了一种改进的 S100A12 纯化方法，可获得具有生物学活性的蛋白，能够高亲和力结合营养性金属离子，并将其螯合脱离入侵的微生物。此外，以下方法还强调了该蛋白作为关键试剂在研究天然抗菌分子如何限制细菌病原体生长机制中的应用价值。
S100A家族蛋白作为先天免疫系统的重要分子，参与免疫信号传导和宿主防御，近年来受到广泛关注27。其中研究最为深入的是钙卫蛋白（MRP-8/14、钙粒蛋白A/B、S100A8/A9）28,29,30。钙卫蛋白是一种与中性粒细胞相关的蛋白，由S100A8和S100A9两个亚基组成异源二聚体，并在二聚体界面结合过渡金属31。研究表明，钙卫蛋白具有两个金属结合位点：位点1可结合Zn2+、Mn2+或Fe2+，位点2可结合Zn2+31,32。大量研究报道显示，钙卫蛋白对多种病原体具有抗菌活性，包括Staphylococcus aureus、Candida albicans、Acinetobacter baumannii、Klebsiella pneumoniae、Escherichia coli和H. pylori，其抑制作用归因于钙卫蛋白的金属螯合活性25,28,29。
先前的研究表明，钙卫蛋白对H. pylori具有多种作用，包括改变外膜中脂质A的结构、抑制cag型IV型分泌系统（该系统是H. pylori中主要的促炎性毒力因子）、诱导生物膜形成，并以剂量依赖的方式抑制H. pylori的生长和存活能力25,33。此外，遗传学和生化实验揭示，钙卫蛋白对H. pylori的抗菌活性主要源于其结合营养性锌的能力25。H. pylori的生长和增殖需要锌，这一点已通过先前使用化学成分明确培养基的研究得以证实，该研究确定了该病原体增殖所需的微量营养素34。此外，在H. pylori感染的组织中钙卫蛋白含量极为丰富，并与中性粒细胞浸润相关，表明宿主可能在感染及后续炎症过程中利用钙卫蛋白作为一种抗菌防御策略25,35。
近期基于非偏倚性蛋白质组学筛选技术的研究证据表明，在活性氧大量存在的条件下，钙卫蛋白会发生翻译后修饰，从而改变其六组氨酸结合位点，进而抑制该蛋白的金属结合活性36。因此，我们推测，在众多S100A家族蛋白中，其他成员也可能具有辅助性金属螯合功能。我们选择S100A12进行深入研究，原因是该蛋白未在前述翻译后修饰筛选实验中被检出，具有结合锌的能力，且在来源于幽门螺杆菌（H. pylori）感染个体的人体组织中含量丰富。
我们的研究结果表明，S100A12 能够抑制 H. pylori 以剂量依赖性方式影响G27菌株的生长和存活能力 H. pylori，且该蛋白的抗菌活性可通过添加过量的营养性锌而被逆转。这项工作补充了我们之前的研究结果，表明S100A12对PMSS1和7.13菌株具有抗菌活性 H. pylori，表明其对多种临床分离株和实验室适应菌株具有广谱抗菌活性 H. pylori18综上所述，这些结果证实了S100A12通过营养免疫机制控制细菌生长与增殖的重要性。未来针对这一重要宿主-细菌相互作用的研究可包括利用S100A12的活性以减少宿主组织中的细菌负荷，或明确该蛋白在免疫信号传导中的作用。 H. pylori 感染

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;S100A12 表达&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;表达细胞&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL 21 (DE3) 感受态细胞</td><td>New England Biolabs</td><td>C25271</td><td></td></tr><tr><td>自诱导培养基组分</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Research Products International</td><td>Y20020-250.0</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International</td><td>S23020-500.0</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Research Products International</td><td>T60060-250.0</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2877</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Research Products International</td><td>M65240-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Research Products International</td><td>S23100-500.0</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Research Products International</td><td>P41200-500.0</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Research Products International</td><td>A20424-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Research Products International</td><td>S25150-500.0</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Research Products International</td><td>G22020-1.0</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Research Products International</td><td>G32040-500.0</td><td></td></tr><tr><td>乳糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2643</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;筛选剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Research Products International</td><td>A40040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;S100A12 纯化&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA Start 层析系统</td><td>GE</td><td>29-220-94</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q Sepharose Fast Flow</td><td>GE</td><td>17-5156-01</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 16/60 S-200 HR</td><td>GE</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop Lite 分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-LITE</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Research Products International</td><td>T60040-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;H. pylori &lt;/em&gt;培养</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>血琼脂平板</td><td>Lab Supply Company</td><td>BBL221261</td><td></td></tr><tr><td>布鲁氏菌肉汤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3051</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇（250倍）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12531018</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>氯化锌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229997</td><td></td></tr></tbody></table>

s100a12的表达、纯化及其抗菌活性

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

钙粒蛋白是一类重要的天然免疫介质，属于EF手家族钙结合蛋白中的S100蛋白类。某些S100蛋白能够以高亲和力结合过渡金属，并在称为“营养免疫”的过程中有效地将这些金属隔离，使其无法被侵入的微生物病原体利用。S100A12（EN-RAGE）可结合锌和铜，在巨噬细胞和中性粒细胞等天然免疫细胞中含量丰富。本文报道了一种优化的方法，用于表达、富集和纯化具有活性并能结合金属的S100A12蛋白。将该蛋白应用于细菌生长和存活分析发现，S100A12对细菌病原体Helicobacter pylori具有抗菌活性。这种抗菌活性依赖于S100A12的锌结合能力，其通过螯合营养性锌，使需要锌进行生长和增殖的H. pylori处于缺锌状态，从而抑制其生长。

S100A12 的表达与纯化
三步纯化法从 50 mL 细菌培养物中获得了约 40 mg 的重组 S100A12。第一步为硫酸铵沉淀法去除内源性杂质。 E. coli 蛋白质。随后进行阴离子交换层析（图1A）。通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE追踪蛋白质图1B). 纯化过程的最后一步是合并含有 S100A12 的组分，进行凝胶过滤层析，该方法依据蛋白质的分子量和形状进行分离。图2A）。S100A12 是一种同源二聚体（每个亚基含 92 个氨基酸），总分子量约为 21 kDa。通过尺寸排阻色谱收集的组分经 SDS-PAGE 分析，并通过考马斯亮蓝染色显影（图2B).
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本文介绍了一种表达和纯化S100A12（钙粒蛋白C）的方法，并描述了一种检测其对人类病原体H. pylori抗菌活性的实验方案。

S100A12的表达、纯化及其抗菌活性

钙结合蛋白EF手家族中的S100类成员钙粒蛋白在先天免疫中发挥重要的介导作用。某些……

本实验方案的总体目标是促进以活性形式分离和纯化S100A12，以便将其用于抗菌活性检测。该方法有助于回答微生物学领域中的关键问题，例如：S100A12作为一种抗菌肽，在致病菌感染后被诱导产生，其具体作用是什么？该技术的主要优势在于，我们优化后的实验流程能够获得高产量且稳定的纯化S100A12二聚体，该二聚体具有结合并螯合营养性金属离子的能力。通常，初次使用该方法的研究人员可能会遇到困难，因为 S100A12 在特定条件下会形成大小不一的寡聚体，而这些寡聚体在体外的抗菌活性会降低。我们最初产生该方法的想法，是在开始纯化并研究一种相关的 S100A 家族蛋白——钙卫蛋白的抗菌活性时。该方法在最终纯化步骤中的分子大小测定和柱层析过程的可视化演示至关重要。抗菌实验对于该过程的成功至关重要。开始此操作时，按照文本方案中所述，将感受态BL21 DE3细胞进行转化。接下来，将1至5微升质粒加入盛有50微升细菌的微量离心管中，置于冰上。孵育20分钟。随后在42摄氏度下热激细胞30秒。冰上孵育2分钟。然后，加入 500 µL SOC 培养基。在 37 °C 下于 250 rpm 的摇床中孵育 1 小时。接着，取 150 µL 转化反应液接种至含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 琼脂培养基平板上。在37摄氏度下孵育12至16小时。孵育结束后，挑取单菌落，接种于含氨苄青霉素的2毫升LB培养基中。在37摄氏度、300 rpm条件下，于摇床中振荡培养4至6小时。接下来，将500 µL的预培养菌液加入50 mL添加了氨苄青霉素的ZYM 5052自诱导培养基中。在37°C下以300 rpm振荡培养24小时。然后，将菌液转移至离心管中。在4,000 × g、4°C条件下离心10分钟。离心后，弃去上清液，记录样品信息，并将细胞沉淀在-80°C下保存。开始实验时，将细胞沉淀重悬于30毫升pH 8.0的20毫摩尔Tris缓冲液中。接着，将悬浮液置于冰上进行超声处理，功率20瓦，采用开5秒、关5秒的循环模式，持续5分钟，以裂解细胞。将超声处理后的溶液转移至高速离心管中。在4°C条件下以20,000 × g离心30分钟，以澄清细胞裂解液。随后，将上清液倾入洁净的100毫升聚丙烯烧杯中。将烧杯置于冰上以冷却溶液。加入一个搅拌子，缓慢加入11.20克硫酸铵。在冰上搅拌溶液一小时。然后，将溶液转移至离心管中，在 4°C 条件下以 20,000 × g 离心 20 分钟，使沉淀的蛋白质形成沉淀物。将上清液倾入透析管中，在 4°C、pH 8.0 的 20 毫摩尔 Tris 缓冲液（1 升）中透析。每隔 4 小时更换一次透析缓冲液，共更换两次。此后，用 10 毫升 20 毫摩尔 Tris 平衡 5 毫升 Sepharose 柱。使用样品泵上样约 40 毫升 S100A12 溶液。收集穿流液。接下来，用 20 毫摩尔 Tris 缓冲液洗涤层析柱。以 0 至 30% 的梯度在 19 倍柱体积范围内洗脱层析柱。收集 5 毫升的组分。使用 MES SDS-PAGE 并结合考马斯亮蓝染色分析每份组分的 10 微升等分试样。随后，收集含有 S100A12 的组分。利用超滤装置将这些组分浓缩至 5 毫升。此后，使用 120 毫升含 20 毫摩尔 Tris 和 100 毫摩尔氯化钠的溶液平衡 S75 柱。上样 5 毫升浓缩组分。接着，以每分钟 1 毫升的流速在 120 毫升洗脱体积内进行柱层析。收集5 mL的组分。使用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析每个样品的20 µL等分试样。然后根据文本方案中所述，验证蛋白质身份并合并相应组分。首先，将 H.pylori 划线接种至添加了 1X 胆固醇的布鲁氏菌肉汤中。在 37 摄氏度下振荡培养过夜，转速为 250 rpm，并通入含 5% 二氧化碳的空气。将 H.pylori 按 1:10 的比例稀释至由 50% 布鲁氏菌肉汤和 50% 钙卫蛋白缓冲液组成的混合液中，同时添加 1X 胆固醇。根据需要添加 S100A12 蛋白和/或外源性金属。抗菌实验是关键步骤。必须使用钙卫蛋白缓冲液以确保 S100A12 二聚体的稳定性，并在细菌生长实验中提供一种金属缺乏的矿物培养基，以避免蛋白质被过量的微量营养素所淹没，因为这些微量营养素通常存在于富含营养的复杂细菌培养基中。第二天，将样品进行系列稀释。随后接种于血琼脂平板上。在含5%二氧化碳的空气中，于37摄氏度培养细菌菌落2至3天。此后，按照文本方案中所述计算细菌生长情况。本研究提出了一种改进的方法，用于表达并纯化处于活性金属结合构象的 S100A12。该三步纯化过程首先对大肠杆菌内源性蛋白进行硫酸铵沉淀，随后进行阴离子交换色谱。通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE追踪蛋白后，将含有S100A12的组分收集并进行凝胶过滤层析。S100A12是一种同源二聚体，每个亚基含有92个氨基酸，总分子量约为21千道尔顿。随后通过定量微生物培养技术研究S100A12的抗菌活性。细菌细胞计数结果显示，在有或无外源性营养锌存在的情况下，暴露于100微克/毫升S100A12并未显著抑制细菌活力。然而，在仅含培养基的条件下，暴露于1,000微克/毫升S100A12可导致细菌活力下降69倍。添加外源性锌营养可逆转此结果，表明S100A12的抗菌活性依赖于其螯合锌的能力。若操作得当，掌握该技术后可在三至四天内完成蛋白质的表达与纯化。在完成该步骤后，可进一步采用电感耦合等离子体质谱等其他方法，以回答更多科学问题。例如，金属螯合如何限制微生物的生长？该技术建立后，为微生物学领域的研究人员探索幽门螺杆菌（H. pylori）的营养免疫机制提供了途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何表达、纯化并定量抗菌蛋白S100A12的活性。请注意，操作幽门螺杆菌（H.pylori）可能具有极高危险性。进行该实验操作时，必须采取相应预防措施，例如在符合BS2标准的实验空间内操作。该技术的应用意义涉及多种胃部疾病，包括溃疡、胃炎以及侵袭性附属腺癌。通过理解这些过程，我们将更有能力构建靶向这些过程的新型抗菌分子。尽管该方法可揭示S100A家族蛋白的生物化学特性，也可用于研究其在免疫信号传导以及多种疾病进程（如癌症、关节炎和传染病）中的作用。

expression-purification-and-antimicrobial-activity-of-s100a12

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科研

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Biochemistry

生物化学

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S100A12的表达、纯化及其抗菌活性

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