Name: 制备和体外磁化的表征的miR-改性内皮细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学习利用PEI/MNP载体对内皮细胞进行非病毒microRNA转染与磁化修饰的技术。该方法通过磁场引导提高细胞靶向滞留能力，为再生医学和细胞治疗研究提供高效基因工程手段。

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我们感谢德国罗斯托克大学电子显微镜中心的 G. Fulda 在获取超顺磁性纳米颗粒的透射电子显微镜图像及其X射线分析方面提供的技术支持。在罗斯托克跨学科技术中心（RTC Rostock）开展的研究工作得到了德国联邦教育与研究部（资助编号：0312138A、316159 和 VIP+03VP00241）、梅克伦堡-前波美拉尼亚州政府以及欧盟结构基金（ESF/IV-WM-B34-0030/10 和 ESF/IV-BM-B35-0010/12）的支持，同时也获得了德国研究基金会（DFG，项目号 DA 1296-1）、Damp 基金会和德国心脏基金会（F/01/12）的资助。Frank Wiekhorst 的研究得到了欧盟第七框架计划“Nanomag”项目（FP7-NMP-2013-LARGE-7）的支持。

我们没有需要披露的相互竞争的财务利益。

本方案介绍了制备负载超顺磁性纳米颗粒的基因工程细胞，并实现其磁控定向引导的方法。成功应用该策略可解决细胞治疗中的一些难题，例如细胞在损伤区域的滞留率低和植入效果差2,3,4，从而提供一种可靶向的细胞移植产品。此外，同时引入适当筛选的遗传物质可增强细胞特性，进而提高其功能益处41。
本实验方案以HUVECs作为模型细胞进行开发。已知这些细胞转染难度较大，且易受毒性影响18,19,20。经PEI/MNP转染后，荧光标记miR的摄取率超过95%，该水平通常可由基于PEI的载体以及常用的阳离子脂质转染试剂（例如 Lipofectamine）实现<sup c...

基因治疗和细胞治疗是强大的工具，有望解决当前心血管疾病（CVD）治疗中的挑战。尽管这两种方法目前均已在临床试验中进行测试，但尚未准备好广泛应用于临床1。值得注意的是，应对基因治疗和细胞治疗挑战的一个共同策略是开发适用于临床应用的多功能基因递送载体。缺乏安全且高效的基因递送系统是基因治疗面临的主要问题。同时，在细胞移植前对细胞产物进行基因工程改造，有望克服细胞治疗中的严重挑战，例如效率低下（例如，在心脏领域，干细胞移植后仅实现约 5% 的功能改善1）以及在损伤部位的滞留/植入效果差（即，无论给药途径如何，细胞滞留率在给药后数分钟至数小时内即降至 5 - 10% 以下2,3,4）。
迄今为止，病毒载体在效率方面远超非病毒系统，因此在临床试验中得到了更广泛的应用（约67%）5。然而，病毒载体存在严重的风险，例如免疫原性（及其引发的炎症反应，可能导致严重并发症）、致癌性，以及所携带遗传物质大小受限等问题6。由于这些安全性问题以及病毒载体生产成本较高，在某些情况下使用非病毒系统更为可取7,8。非病毒系统尤其适用于需要短暂基因校正的疾病，例如调控血管生成的生长因子表达（e.g., 用于心血管疾病治疗）或疫苗递送。
在我们课题组中，设计了一种通过生物素-链霉亲和素相互作用将支化的25-kDa聚乙烯亚胺（PEI）与超顺磁性氧化铁纳米颗粒（MNP）结合在一起的递送系统9。该载体是一种可用于细胞基因工程的潜在工具，可在移植前实现细胞的同时磁化。后者为磁性导向/滞留提供了基础，这一点在当前尤为具有前景，因为先进的磁靶向技术正在被成功开发10。此外，所获得的磁响应性细胞有望通过磁共振成像（MRI）或磁粒子成像进行无创监测11,12。
对于PEI/MNP载体而言，聚胺能够确保核酸的压缩，从而保护其免受降解因素的影响，促进载体进入细胞以及实现内涵体逃逸5。磁性纳米颗粒（MNPs）不仅在磁导向方面补充了PEI的性能，还可降低PEI已知的细胞毒性7,13,14。此前，已利用成纤维细胞和人源间充质干细胞对PEI/MNP载体在递送效率（即质粒DNA和miRNA）和安全性方面的性能进行了优化15,16。
本文描述了应用PEI/MNPs制备miRNA修饰细胞的详细实验方案17为此，使用 HUVECs 并代表一种成熟的模型 体外 血管生成。它们难以转染，且易受毒性影响18,19,20此外，我们提供了一种用于评估此类细胞的算法 体外包括它们的靶向性、细胞间通讯以及磁共振成像检测。

<table><tbody><tr><td>PEI 25 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 脱盐柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td>含 Sephadex G-25 Medium</td></tr><tr><td>2% 茚三酮试剂溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7285</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 生物素定量试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>28005</td><td></td></tr><tr><td>微量板读数仪 Model 680</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素磁性微球</td><td>Promega</td><td>Z5481</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV PVDF 滤膜</td><td>Merck</td><td>SLHV013SL</td><td>0.45 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Libra 120 透射电子显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>加速电压 120&amp;nbsp;kV</td></tr><tr><td>Sapphire X射线探测器</td><td>EDAX-Amatek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞培养塑料器皿</td><td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NHS-酯 Atto 565</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-31</td><td></td></tr><tr><td>NHS-酯 Atto 488&amp;nbsp;</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 488-31</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 miRNA 标记试剂盒</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 9650</td><td></td></tr><tr><td>生物素-Atto 565</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-71</td><td></td></tr><tr><td>IV型胶原酶 Gibco</td><td>Thermo Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基 EGM-2</td><td>Lonza</td><td>CC-3156 &amp;amp; CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td>100 U/mL, 100 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>抗 PECAM-1 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-1506</td><td></td></tr><tr><td>MS MACS 柱</td><td>Miltenyi Biotec&amp;nbsp;</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>近红外活/死细胞染色试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 荧光标记 Pre-miR 阴性对照</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM17120</td><td>&quot;Cy3-miR&quot; 或文稿中的 &quot;Cyanine-miR3&quot;</td></tr><tr><td>Pre-miR miRNA 前体分子 - 阴性对照&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM17110</td><td>文稿中称为 &quot;scr-miR&quot;</td></tr><tr><td>抗 hsa-miR92a-3p 合成抑制剂&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM10916</td><td></td></tr><tr><td>LSM 780 ELYRA PS.1 系统</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td>PBS 中的 4% 溶液</td></tr><tr><td>DAPI 核染色剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA 提取试剂盒</td><td>Machery-Nagel</td><td>740955</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA 提取试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA 反转录试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高容量 cDNA 反转录试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>hsa-miR-92a TaqMan 检测试剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>000431</td><td>成熟 miRNA 序列：UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU</td></tr><tr><td>FastGene Taq Ready Mix</td><td>Nippon Genetics</td><td>LS27</td><td></td></tr><tr><td>ITGA5 TaqMan 检测试剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>Hs01547673_m1</td><td></td></tr><tr><td>RNU6B TaqMan 检测试剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>001093</td><td></td></tr><tr><td>18S rRNA 内参对照</td><td>Thermo Scientific</td><td>4333760F</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Calcein Red-Orange</td><td>Thermo Scientific</td><td>C34851</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS 缓冲液</td><td>Miltenyi Biotec&amp;nbsp;</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>7.1 特斯拉动物 MRI 系统</td><td>Bruker Corporation</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>美国国立卫生研究院（NIH）</td><td></td><td>升级版，配备 AngiogenesisAnalyzer（NIH）</td></tr><tr><td>MPS 设备</td><td>Bruker Biospin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab 软件</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>环形钕磁铁&amp;nbsp;</td><td>magnets4you GmbH</td><td>RM-10x04x05-G</td><td>&amp;oslash; 10 mm；剩磁约为 1.3&amp;nbsp;T，矫顽力 &amp;ge; 955 kA/m</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 成像试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>FluorSave 封片剂</td><td>Merck</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗仪</td><td>Bandelin electronic</td><td>型号：RK 100 SH</td><td></td></tr></tbody></table>

制备与 体外 磁化mir修饰内皮细胞的表征

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

迄今为止，心血管疾病（CVD）的可用外科和药物治疗手段有限，且多为对症治疗。与此同时，基因治疗和细胞治疗已成为治疗CVD极具前景的替代策略。然而，由于缺乏合适的基因递送系统，基因治疗的广泛应用受到极大限制。开发适当的基因递送载体可为当前细胞治疗面临的挑战提供解决方案。特别是通过适当的细胞工程手段，有望克服现有方法中存在的诸多缺陷，例如转导效率有限以及细胞在损伤器官中的滞留率低等问题。即， 在移植前对细胞进行遗传学修饰。本方案描述了一种利用聚乙烯亚胺超顺磁性磁性纳米颗粒（PEI/MNP）递送载体高效、安全地瞬时修饰内皮细胞的方法。同时，本文定义了细胞表征的算法与相关方法。该方法已成功将微小RNA（miR）递送至人脐静脉内皮细胞（HUVECs）胞内，且未影响细胞活力、功能或细胞间通讯。此外，该策略被证实可对导入的外源性miR产生显著的功能性效应。重要的是，采用该MNP基载体可实现细胞磁化，从而具备磁性靶向及无创MRI示踪的可能性。该技术有望为可磁引导、基因工程化细胞治疗提供基础，并实现MRI无创监测。

本方案的主要目的是制备具有磁响应性的miR修饰细胞，并对其进行精确表征（图1）。最终应获得转染效率高、可响应磁性筛选与导向，并可通过磁共振成像（MRI）检测的细胞。
首先，通过内皮细胞标志物 CD31（PECAM）的典型染色（图 2A）以及细胞在适当基底膜基质上形成管状结构的能力，确认了分离获得的 HUVEC 的身份（图 2B）。所获得的细胞对 PEI/MNP 介导导入的 miR 摄取效率很高；显微观察显示，转染后 24 小时，所有细胞均呈现标记 miR（Cy3）的阳性信号（图 3A）。重要的是，与未处理细胞相比，未观察到细胞死亡（图 3B），且细胞形态保持正常（图 3A）。共聚焦激光扫描显微镜观察显示，Cy3-miR 的信号主要位于细胞内部。此外，利...

本论文描述了一种利用PEI/MNP载体高效、非病毒性地将miR递送至内皮细胞并实现其磁化的方法。因此，该方法除了可实现遗传修饰外，还可实现磁性细胞导向和磁共振成像（MRI）检测。该技术可用于改善治疗性细胞产品的特性。

制备与 体外 磁化miR修饰内皮细胞的表征

迄今为止，心血管疾病（CVD）的可用外科手术和药物治疗手段有限，且多为对症治疗。与此同时，基因……

本实验的总体目标是介绍一种可同时实现细胞microRNA修饰和细胞磁化的技术。该方法有望解决再生医学领域中的一些关键挑战，例如细胞移植前的基因工程改造。除了利用 microRNA 实现高效的细胞修饰外，还可通过氧化铁进行修饰。这可通过施加磁场来增强目标部位的细胞滞留。细胞治疗在心脏病治疗中具有广阔前景，但细胞滞留率低以及细胞存活率问题亟待改善。按照文本方案中的描述，在准备转染复合物之前，首先开始人脐静脉内皮细胞的培养。转染前48小时，将HUVECs接种于适当大小的塑料细胞培养板孔中，起始细胞密度约为每平方厘米生长面积13,000个细胞。接下来，制备新鲜的miR/聚乙烯亚胺/超顺磁性氧化铁纳米颗粒。首先，按照每平方厘米细胞生长面积2.5皮摩尔microRNA和5%葡萄糖溶液进行稀释，使microRNA的终浓度为每微升0.125皮摩尔。接着，将PEI用等体积的5%葡萄糖溶液稀释。将稀释后的PEI加入microRNA溶液中，涡旋振荡所得混合物30秒。随后将miR/PEI混合物在室温下孵育30分钟。在室温下的超声水浴中对MNP进行超声处理，时间不少于20分钟。然后将适量的MNP溶液加入已准备好的miR/PEI混合物中。涡旋振荡30秒后，于室温孵育30分钟。随后将制备好的miR/PEI/MNP混合物逐滴直接加入细胞培养液中。转染后六小时，用新鲜培养基替换该混合物。按照文本方案中所述分析载体安全性后，通过共聚焦显微镜和超分辨率结构照明显微镜确认并表征转染复合物的细胞内定位。为此，将 HUVECs 接种于置于 24 孔培养板孔内、经明胶包被的玻璃盖玻片上，操作方式同前。用三色标记的miR/PEI/MNP转染细胞，并在含5%二氧化碳的湿润环境中37摄氏度孵育24小时。先用2%牛血清白蛋白和磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤盖玻片，再用PBS单独洗涤。将细胞在37摄氏度下用4%多聚甲醛（PFA）孵育15分钟以固定细胞。用 PBS 洗涤，然后按照标准方案用 DAPI 对细胞核进行染色。接着在摇床上用 PBS 洗涤细胞三次，每次 15 分钟，以去除多余的染料。将制备好的盖玻片用适当的封片剂置于显微镜载玻片上，并在用于显微镜观察前干燥至少一小时。使用文本方案中所述SIM设置下的63倍油浸物镜采集图像。对于细胞靶向及体外模拟动态条件实验，首先将HUVECs转染至24孔板中，操作同前。孵育24小时后，洗涤细胞。然后加入一倍体积用 PBS 稀释的 EDTA，于 37 摄氏度孵育细胞 4 分钟，随后收集细胞。将收集的细胞在 300 × g 离心 10 分钟。将一个孔中获得的细胞沉淀与 1 毫升新鲜培养基混合。将细胞转移至12孔板中的单个孔内。使用胶带将一小块磁铁固定在局部位置。将培养板置于摇床上，于150 RPM条件下孵育细胞悬液12小时，以模拟动态环境。然后洗涤细胞，并使用4% PFA固定细胞。用DAPI对细胞核进行染色。采用激光扫描共聚焦显微镜，以405 nm和504 nm激发激光在z轴堆叠模式下记录细胞贴附情况，以获取原始数据。使用最大强度投影图像处理方法生成用于分析的图像。对于磁响应性与非响应性细胞的定量分析，首先在24孔板中转染HUVEC细胞。按照前述方法洗涤并收集细胞前，先将细胞孵育24小时。用500微升预热的无菌细胞分选缓冲液重悬从每个孔中获得的细胞沉淀。将细胞悬液加入由配套磁铁固定的磁性分选柱中。然后用新鲜的细胞分选缓冲液在磁铁上洗涤分选柱三次。收集流穿部分作为磁性无响应组分。将色谱柱从磁铁上取下，立即使用活塞将新鲜的细胞分选缓冲液推过色谱柱，收集磁性响应的细胞组分。将磁性无响应（Mag-）和磁性响应（Mag+）两组分均在300 × g下离心10分钟。将细胞沉淀重悬于PBS中后，用台盼蓝排斥法计数细胞并评估细胞活力。人脐静脉内皮细胞（HUVECs）来源于脐带，其特征为表达内皮标志物CD31，并能在基底膜基质上形成管状结构。转染了miR/PEI/MNP的HUVECs均摄取了标记的miR。转染后24小时，细胞存活率未受影响。此外，超分辨率显微镜显示三色标记的转染复合物定位于核周区域。miR/PEI转染细胞功能下降证实了PEI的细胞毒性。重要的是，MNP 可恢复细胞特性。经 miR/PEI/MNP 修饰的细胞在成管能力方面与未处理细胞无差异。此外，通过光漂白后荧光恢复实验表明，这些细胞保持了细胞间缝隙连接通讯功能。当将经miR/PEI/MNP修饰的细胞悬液接种至置于旋转摇床的培养板孔中后，细胞倾向于迁移并附着于局部磁铁作用区域。代表性图像展示了在磁铁作用区域内的细胞生长情况。无磁铁作用时。在培养孔的中心区域，液体流动使细胞聚集。一旦掌握该技术，细胞转染可在两小时内完成。观看本视频后，您将对如何瞬时但高效地修饰内皮细胞（包括磁化过程）有非常清晰的认识。以及如何对细胞终产品进行终末表征。在实施该操作时，必须严格遵循所规定的细胞接种数量、转染复合物制备组分用量、孵育时间，以及转染后洗涤步骤。我们非常乐观地认为，该方法将可良好地拓展应用于其他细胞类型，用于治疗其他受累器官。通过此方法，可对经修饰的磁化细胞进行体内研究。这些研究能够进一步回答以下问题：细胞的铁负荷是否足以有效确保其在目标部位的滞留，以及明确体内磁共振成像（MRI）检测的灵敏度极限。

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制备和<em&gt;体外</em&gt;磁化的表征的miR-改性内皮细胞

本视频展示了一种利用磁性激活细胞分选（MACS）技术从培养物中纯化 CD31+ 内皮祖细胞（EPCs）的方法。首先将细胞悬液与荧光染料标记的抗体孵育，该抗体可特异性结合 EPCs 上的 CD31 分子。随后加入抗体复合物，该复合物可结合荧光染料，再加入聚合物包被的磁性纳米颗粒，该颗粒可结合抗体复合物，从而完成对 CD31+ EPCs 的标记。最后通过磁场对标记的细胞进行纯化，弃去 CD31-...

使用磁性激活细胞分选法纯化CD31+内皮前体细胞

原代细胞培养是一种用于分析特定细胞群体的有用技术，尤其适用于特定发育阶段的转基因小鼠胚胎。本文中，通过分离和解离胚胎心室，利用抗体偶联磁珠识别并分离内皮细胞，以进行后续分析。...

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人诱导性多能干细胞向具有成熟免疫表型的脑微血管内皮样细胞的分化

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一种磁分离辅助的高速均质化方法用于大规模制备内体来源囊泡

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制备与体外磁化miR修饰内皮细胞的表征

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