制备和体外磁化的表征的miR-改性内皮细胞
2017年5月2日
这个手稿描述的miR的有效的，非病毒递送通过PEI / MNP矢量和它们的磁化与内皮细胞。因此，除了遗传修饰，该方法允许用于磁性细胞的指导和MRI可检测性。该技术可以被用来改善的治疗性细胞产品的特性。
该程序的总体目标是引入一种技术，确保使用 microRNA 进行细胞修饰并并行进行细胞磁化。这种方法可以解决再生医学领域的关键挑战。例如移植前对细胞进行基因工程。
除了使用 microRNA 进行有效的细胞修饰外，他们还允许使用氧化铁进行细胞修饰。这可用于通过磁场应用来增强细胞在目标侧的保留。细胞疗法对于治疗心脏病、低细胞潴留和细胞存活亟待提高非常有前途。
从人脐静脉内皮细胞培养开始此过程，以制备文本方案中所述的转染复合物。转染前 48 小时，将 HUVEC 接种在合适大小的塑料细胞培养孔板上。起始细胞密度约为每平方厘米生长表面 13， 000 个细胞。
接下来，准备新鲜的 miR/聚乙烯亚胺/超顺磁性氧化铁纳米颗粒。首先，每平方厘米的细胞生长表面稀释 2.5 皮摩尔的 microRNA 和 5% 的葡萄糖溶液，以获得每微升 0.125 皮摩尔的 microRNA 的最终浓度。接下来，在等体积的 5% 葡萄糖溶液中稀释 PEI。
将稀释的 PEI 添加到 microRNA 溶液中，并将获得的混合物涡旋 30 秒。然后在室温下孵育 miR/PEI 混合物 30 分钟。在室温下，在超声水浴中对 MNP 进行至少 20 分钟的超声处理。
然后将适量的 MNP 溶液添加到准备好的 miR/PEI 混合物中。涡旋 30 秒后，在室温下孵育 30 分钟。接下来，将制备好的 miR/PEI/MNP 混合物直接滴加到细胞上的培养基中。
转染后 6 小时用新鲜培养基替换该混合物。按照文本方案中的描述分析载体安全性后，通过共聚焦和超分辨率结构照明显微镜确认和表征转染复合物的细胞内定位。为此，像以前一样，将 HUVEC 接种在放置在 24 孔培养板孔中的明胶涂层玻璃盖玻片上。
用 3 色标记的 miR/PEI/MNP 转染细胞，并在 37 摄氏度下在含有 5% 二氧化碳的潮湿环境中孵育 24 小时。首先用 2% 的牛血清白蛋白和磷酸盐缓冲盐水清洗盖玻片，然后只用 PBS 清洗。通过在 4% 多聚甲醛或 PFA 中于 37 摄氏度孵育 15 分钟来固定细胞。
用 PBS 洗涤，然后按照标准方案用 DAPI 对细胞核进行染色。然后在摇床上用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 15 分钟，以去除多余的染料。使用合适的安装介质将准备好的盖玻片放在显微镜载玻片上，让载玻片干燥至少一小时，然后再用于显微镜检查。
使用文本协议中 SIM 设置中的 63 倍油浸物镜采集图像。对于体外细胞靶向和模拟动态条件，首先像以前一样将 HUVEC 转染到 24 孔板中。孵育 24 小时后，洗涤细胞。
然后在 PBS 稀释的 EDTA 中加入 1 x 次，并在 37 摄氏度下孵育细胞 4 分钟，然后收集细胞。将收集的细胞以 300 倍 G 离心 10 分钟。将从一孔中获得的细胞沉淀与 1 毫升新鲜培养基混合。
并将细胞转移到 12 孔板的单个孔中。使用胶带在当地固定一个小磁铁。将培养板放在摇床上，以 150 RPM 的转速孵育细胞悬液 12 小时，以模拟动态条件。
然后洗涤细胞并使用 4% PFA 固定它们。用 DAPI 对细胞核进行染色。使用 405 和 504 十纳米激发激光器在 z 堆栈模式下使用激光扫描共聚焦显微镜记录细胞附着，以获得原始数据。
使用最大强度投影图像处理创建用于分析的图像。对于磁性反应细胞和无反应细胞的定量分析，首先在 24 孔板中转染 HUVEC。如前所述，在洗涤和收集细胞之前，将细胞孵育 24 小时。
用 500 μL 加热的无菌细胞分选缓冲液重悬从每个孔中获得的细胞沉淀。将细胞悬液涂在由随附的磁铁固定的磁性分选柱上。然后用新鲜的细胞分选缓冲液洗涤磁力架上的色谱柱 3 次。
将流出物收集为磁无响应的馏分。从磁力架上取下色谱柱，并使用柱塞将新鲜的细胞分选缓冲液推入色谱柱，立即收集具有磁响应性的细胞组分。将 Mag 和 Mag + 组分以 300 倍 G 离心 10 分钟。
将细胞沉淀重悬于 PBS 中后，对细胞进行计数，并用台盼蓝排除测定法评估细胞活力。从脐带中分离的 HUVEC 的特征是内皮标志物 CD31 的表达和在基底膜基质上形成管。转染 miR/PEI/MNP 的 HUVEC 均吸收标记的 miR。
转染后 24 小时，它们的存活率不受影响。此外，超分辨率显微镜显示 3 色标记转染复合物的核旁定位。PEI 毒性可通过 miR/PEI 转染细胞的功能减弱来证实。
重要的是，MNP 可恢复细胞特性。miR/PEI/MNP 修饰的细胞在管形成方面与未处理的细胞没有区别。此外，这些细胞保持细胞间间隙连接通讯，如光漂白后荧光恢复所示。
一旦将 miR/PEI/MNP 修饰细胞的悬浮液接种到放置在旋转摇床上的培养板的孔中，细胞往往会迁移并附着在局部磁力应用区域。代表性图像描绘了磁体应用区域的细胞生长。无需磁铁应用。
在培养孔的中心，液体流在那里浓缩细胞。一旦掌握，即可在 2 小时内完成细胞转染。看完这个视频后，您应该对如何瞬时但高效地修饰内皮细胞（包括磁化）有一个非常好的印象。
以及如何最终表征细胞产物。在尝试此程序时，请务必遵循给定的数字，了解用于制备转染复合物的组分的细胞接种量、孵育时间和转染后的洗涤步骤。我们非常乐观地认为这种方法可以很好地转移到其他细胞类型，以治疗其他受影响的器官。
按照此程序，可以使用修饰的磁化电池进行体内研究。他们可以回答其他问题，即细胞的铁负载是否能有效地确保它们保留在感兴趣的一侧。并且还定义了体内 MRI 的检测限。
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概述
本手稿介绍了一种高效、非病毒性向内皮细胞递送microRNA的技术，利用PEI/MNP载体进行磁化。该方法增强了基因修饰，并允许磁性细胞引导和MRI检测，解决了再生医学中的挑战。
关键研究组成部分
科学领域
- 再生医学
- 细胞疗法
- 基因工程
背景
- 细胞疗法在治疗心脏疾病方面很有前景。
- 改善细胞滞留和存活至关重要。
- MicroRNA修饰可以增强治疗效果。
- 磁化有助于靶向细胞递送。
研究目的
- 介绍microRNA递送和细胞磁化的方法。
- 使用磁场改善目标部位的细胞滞留。
- 解决移植过程中细胞存活和滞留的挑战。
使用的方法
- 使用PEI/MNP载体进行microRNA的非病毒性递送。
- 对内皮细胞进行磁化以进行引导。
- 应用磁场以增强细胞滞留。
- 评估基因修饰效率。
主要结果
- 成功向内皮细胞递送microRNA。
- 有效对细胞进行磁化以实现MRI可检测性。
- 改善了治疗性细胞产品的特性。
- 潜力提升细胞疗法的效果。
结论
- 该技术为细胞修饰提供了一种新颖的方法。
- 磁性引导可以显著提高治疗效果。
- 该方法解决了再生医学中的关键挑战。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol addresses critical bottlenecks in cell therapy by enabling transient microRNA delivery and simultaneous magnetization of endothelial cells, improving genetic modification efficiency and post-transplant cell retention. The approach supports predictive confidence in therapeutic cell product design by combining genetic engineering with non-invasive MRI tracking and magnetic targeting capabilities. It provides a scalable, non-viral platform for de-risking cell-based interventions in cardiovascular regenerative medicine pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of microRNA mechanisms in endothelial cells without compromising viability or intercellular communication.
- Operational Value: Provides a reproducible method for transient gene modulation to validate therapeutic targets in vascular biology.
- Predictive Value: Supports target de-risking by linking miR overexpression to functional outcomes in tube formation and gap junctional communication.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates magnetically sortable cell populations for quantitative analysis of transfection efficiency and phenotypic response.
- Operational Value: Standardizes cell preparation for downstream assays using defined transfection complex ratios and incubation timelines.
- Scalability Value: Facilitates platform reuse across cell types through modular PEI/MNP vector design and magnetic separation workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains endothelial functionality post-modification, supporting disease-relevant modeling of vascular repair and angiogenesis.
- Preclinical Continuity: Enables MRI tracking and magnetic guidance in simulated dynamic conditions, bridging in vitro findings to in vivo delivery studies.
- Risk Mitigation: Reduces mechanistic ambiguity by confirming that magnetization does not impair tube formation or gap junctional coupling.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by supplying genetically engineered, magnetically responsive endothelial cells for target validation and assay development, with direct translational relevance to preclinical cell therapy optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via controlled miR delivery and phenotypic readouts in tube formation and intercellular communication assays.
- Screening: Delivers assay-ready cells with quantifiable magnetic responsiveness for standardized compound or genetic modifier screening.
- Analytics: Enables quantitative separation of transfected and non-transfected fractions using magnetic sorting, improving data precision in flow-through and retained cell analysis.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by allowing non-invasive MRI tracing and magnetic targeting in perfusion-like conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable transfection and magnetization platform adaptable to other primary cell types for vascular and regenerative applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through combined genetic and functional modulation of endothelial cells.
- Operational Value: Standardization of transfection efficiency and reproducibility via defined PEI/miR/MNP ratios and timed incubation steps.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing late-stage failure risks associated with poor cell retention and transient engraftment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cell therapy candidates through traceable, functionally validated cellular products.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid transfection, nanoparticle handling, and fluorescence microscopy for validation.
- Depends on access to sonication equipment, magnetic separation columns, and confocal/SIM imaging systems.
- Necessitates standardization of cell seeding density (13,000 cells/cm²) and transfection complex preparation across laboratories.
- Involves adaptation considerations for varying endothelial or progenitor cell types regarding transfection efficiency and magnetic responsiveness.
- Includes practical limitations such as the need to optimize miR dosage and PEI concentration to minimize cytotoxicity while maintaining magnetization.
