制备与 体外 磁化miR修饰内皮细胞的表征

本实验的总体目标是介绍一种可同时实现细胞microRNA修饰和细胞磁化的技术。该方法有望解决再生医学领域中的一些关键挑战，例如细胞移植前的基因工程改造。

除了利用 microRNA 实现高效的细胞修饰外，还可通过氧化铁进行修饰。这可通过施加磁场来增强目标部位的细胞滞留。细胞治疗在心脏病治疗中具有广阔前景，但细胞滞留率低以及细胞存活率问题亟待改善。

按照文本方案中的描述，在准备转染复合物之前，首先开始人脐静脉内皮细胞的培养。转染前48小时，将HUVECs接种于适当大小的塑料细胞培养板孔中，起始细胞密度约为每平方厘米生长面积13,000个细胞。

接下来，制备新鲜的miR/聚乙烯亚胺/超顺磁性氧化铁纳米颗粒。首先，按照每平方厘米细胞生长面积2.5皮摩尔microRNA和5%葡萄糖溶液进行稀释，使microRNA的终浓度为每微升0.125皮摩尔。接着，将PEI用等体积的5%葡萄糖溶液稀释。

将稀释后的PEI加入microRNA溶液中，涡旋振荡所得混合物30秒。随后将miR/PEI混合物在室温下孵育30分钟。在室温下的超声水浴中对MNP进行超声处理，时间不少于20分钟。

然后将适量的MNP溶液加入已准备好的miR/PEI混合物中。涡旋振荡30秒后，于室温孵育30分钟。随后将制备好的miR/PEI/MNP混合物逐滴直接加入细胞培养液中。

转染后六小时，用新鲜培养基替换该混合物。按照文本方案中所述分析载体安全性后，通过共聚焦显微镜和超分辨率结构照明显微镜确认并表征转染复合物的细胞内定位。为此，将 HUVECs 接种于置于 24 孔培养板孔内、经明胶包被的玻璃盖玻片上，操作方式同前。

用三色标记的miR/PEI/MNP转染细胞，并在含5%二氧化碳的湿润环境中37摄氏度孵育24小时。先用2%牛血清白蛋白和磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤盖玻片，再用PBS单独洗涤。将细胞在37摄氏度下用4%多聚甲醛（PFA）孵育15分钟以固定细胞。

用 PBS 洗涤，然后按照标准方案用 DAPI 对细胞核进行染色。接着在摇床上用 PBS 洗涤细胞三次，每次 15 分钟，以去除多余的染料。将制备好的盖玻片用适当的封片剂置于显微镜载玻片上，并在用于显微镜观察前干燥至少一小时。

使用文本方案中所述SIM设置下的63倍油浸物镜采集图像。对于细胞靶向及体外模拟动态条件实验，首先将HUVECs转染至24孔板中，操作同前。孵育24小时后，洗涤细胞。

然后加入一倍体积用 PBS 稀释的 EDTA，于 37 摄氏度孵育细胞 4 分钟，随后收集细胞。将收集的细胞在 300 × g 离心 10 分钟。将一个孔中获得的细胞沉淀与 1 毫升新鲜培养基混合。

将细胞转移至12孔板中的单个孔内。使用胶带将一小块磁铁固定在局部位置。将培养板置于摇床上，于150 RPM条件下孵育细胞悬液12小时，以模拟动态环境。

然后洗涤细胞，并使用4% PFA固定细胞。用DAPI对细胞核进行染色。采用激光扫描共聚焦显微镜，以405 nm和504 nm激发激光在z轴堆叠模式下记录细胞贴附情况，以获取原始数据。

使用最大强度投影图像处理方法生成用于分析的图像。对于磁响应性与非响应性细胞的定量分析，首先在24孔板中转染HUVEC细胞。按照前述方法洗涤并收集细胞前，先将细胞孵育24小时。

用500微升预热的无菌细胞分选缓冲液重悬从每个孔中获得的细胞沉淀。将细胞悬液加入由配套磁铁固定的磁性分选柱中。然后用新鲜的细胞分选缓冲液在磁铁上洗涤分选柱三次。

收集流穿部分作为磁性无响应组分。将色谱柱从磁铁上取下，立即使用活塞将新鲜的细胞分选缓冲液推过色谱柱，收集磁性响应的细胞组分。将磁性无响应（Mag-）和磁性响应（Mag+）两组分均在300 × g下离心10分钟。

将细胞沉淀重悬于PBS中后，用台盼蓝排斥法计数细胞并评估细胞活力。人脐静脉内皮细胞（HUVECs）来源于脐带，其特征为表达内皮标志物CD31，并能在基底膜基质上形成管状结构。转染了miR/PEI/MNP的HUVECs均摄取了标记的miR。

转染后24小时，细胞存活率未受影响。此外，超分辨率显微镜显示三色标记的转染复合物定位于核周区域。miR/PEI转染细胞功能下降证实了PEI的细胞毒性。

重要的是，MNP 可恢复细胞特性。经 miR/PEI/MNP 修饰的细胞在成管能力方面与未处理细胞无差异。此外，通过光漂白后荧光恢复实验表明，这些细胞保持了细胞间缝隙连接通讯功能。

当将经miR/PEI/MNP修饰的细胞悬液接种至置于旋转摇床的培养板孔中后，细胞倾向于迁移并附着于局部磁铁作用区域。代表性图像展示了在磁铁作用区域内的细胞生长情况。无磁铁作用时。

在培养孔的中心区域，液体流动使细胞聚集。一旦掌握该技术，细胞转染可在两小时内完成。观看本视频后，您将对如何瞬时但高效地修饰内皮细胞（包括磁化过程）有非常清晰的认识。

以及如何对细胞终产品进行终末表征。在实施该操作时，必须严格遵循所规定的细胞接种数量、转染复合物制备组分用量、孵育时间，以及转染后洗涤步骤。我们非常乐观地认为，该方法将可良好地拓展应用于其他细胞类型，用于治疗其他受累器官。

通过此方法，可对经修饰的磁化细胞进行体内研究。这些研究能够进一步回答以下问题：细胞的铁负荷是否足以有效确保其在目标部位的滞留，以及明确体内磁共振成像（MRI）检测的灵敏度极限。