荧光为基础的神经氨酸酶抑制测定流感病毒的易感性评估抗病毒药的神经氨酸酶抑制剂类

该方法的总体目标是通过使用基于荧光的测定来评估甲型和乙型流感病毒对神经氨酸酶抑制剂的敏感性。该方法可以帮助确定流感病毒是否对神经氨酸酶抑制剂类抗病毒药物耐药或敏感。测定的主要原理是看神经氨酸酶抑制剂抗病毒是否阻断神经氨酸酶活性的作用。

在进行抗病毒药物敏感性试验之前，病毒必须通过在细胞培养物（如 MDCK 细胞）或胚胎鸡蛋中传代而生长至高病毒滴度。在本演示中，我将使用 H1N1 和 H3N2 亚型的活甲型流感病毒。从 96 孔 U 底板开始，每孔将 120 μL 未稀释的培养流感病毒分配到第一列中。

将 60 微升含有 0.1% NP40 的一次性测定缓冲液加入其余 11 根色谱柱中。使用多通道移液器，在板上连续进行两次完全稀释，将第 12 列留为空白，仅包含 1 倍测定缓冲液。将 50 μL 从每个孔中转移到透明的 96 孔平底板中。

每孔加入 50 微升 300 微摩尔 MUNANA。然后轻轻敲击板子进行混合。然后使用封板机盖住板以防止蒸发。

并将板在 37 摄氏度下孵育 1 小时。每孔加入 100 μL 终止液以终止反应。然后轻轻敲击板子进行混合。

使用荧光计读取板。然后，根据文本方案绘制 RFU 与病毒稀释度的关系图后，确定适当的病毒浓度，以使用最佳目标信号作为参考点来评估病毒对 NA 抑制剂的敏感性，以选择病毒 NA 活性曲线线性部分的中点。要在 amivir 中制备 300 微摩尔，请将 5 mg 扎那米韦溶解在 50 ml 2 倍测定缓冲液中。

通过将 5.8 毫克奥司他韦羧酸盐溶解在 50 毫升两次测定缓冲液中，制备 300 微摩尔的奥司他韦羧酸盐。将 5.7 毫克帕拉米韦三水合物溶解在 50 毫升两次测定缓冲液中，储备浓度为 300 微摩尔。然后通过将 5.2 毫克溶解在 50 毫升两次测定缓冲液中来制备 300 微摩尔拉尼酰胺韦。

从主储备液中，在 50 毫升离心管中制备 10 倍稀释的 NA 抑制剂的工作储备液，浓度如下。在制备 NA 抑制剂系列浓度时必须注意。NA 抑制剂浓度的任何不规则性在抑制曲线中都很明显。

使用基于本视频前面确定的 NA 活性的病毒稀释液，在 96 深孔块中含有 0.1% NP40 表面活性剂的一次性测定缓冲液中制备两毫升病毒稀释液。稀释病毒时，请确保将其直接加入一次性检测缓冲液中。这一点尤其重要，尤其是在病毒数量非常少时。

将所需体积的 NA 抑制剂分配到 8 深的孔储液器中。然后分配 50 微升 NA 抑制剂，稀释度范围为 0 至 30， 000 纳摩尔。将每孔 50 μL 稀释的测试病毒添加到第 1 至第 11 列中。

以及每孔 50 μL 的一次性检测缓冲液至第 12 列。轻轻敲击板以混合并盖上盖子以防止蒸发。然后将板在室温下孵育 45 分钟。

孵育后，向每个孔中加入 50 微升 300 微摩尔 MUNANA。然后轻轻敲击板子以混合并盖上盖子。将板在 37 摄氏度下孵育 1 小时。

向每个孔中加入 100 μL 终止液。然后轻轻敲击板子以混合。然后使用荧光计读取板。

要计算 IC 50 值，请将荧光计输出的原始数据复制并粘贴到 12 柱板格式的电子表格中，从单元格 A1 开始。打开拟合软件，然后单击实验选项卡。选择替代 2 药物 Fluoro 11 样品。单击选项选项卡并勾选 Generate Graphs。

再次单击 options 并选择 New Key 选项卡。然后将抑制键 SEV 文件保存在与原始数据电子表格文件相同的文件夹中。在 inhibition_key 文件中，列出 ID 下方的所有样品名称。如果测试了四种 NA 抑制剂，请在奥司他韦下方插入另外两行的空格，并键入帕拉米韦和拉尼米韦。

保存对 inhibition_key 文件所做的更改。返回到 jasprv1.2 抑制曲线拟合窗口，并选择原始数据文件作为实验文件。inhibition_key 作为密钥文件。

运行分析。然后，将结果保存为 CSV 和 PDF 格式。检查 IS50 值和软件生成的曲线形状。

所有数据点都应落在曲线上或靠近曲线。如果他们没有，请重复 NA 抑制测定。如该抑制曲线所示，绘制了 A（H1N1）pdn09 病毒 A/Perth/82/2015 针对 NA 抑制剂浓度增加的荧光。

IC50 在此处表示。通过将 IC50 与中位数进行比较，将正常抑制、降低抑制或高度降低抑制的结果分配给测试病毒。在每个实验室中，应使用测试具有正常抑制的病毒生成的数据得出中位 IC50 值。

以及在墨尔本 WHO 流感合作中心为相应类型和亚型确定的中位 IC50 值的示例。对于甲型流感病毒，正常抑制病毒是指 IC50 值小于其各自亚型的参考中位数 IC50 的 10 倍的病毒。低抑制病毒是指 IC50 值比其各自亚型的参考中位数 IC50 高 10 到 100 倍的病毒。

而高度降低抑制病毒的 IC50 值比参考中位数 IC50 高 100 倍。对于乙型流感病毒，正常抑制病毒的 IC50 值比参考中位数 IC50 的 5 倍以下。抑制性降低的病毒在 5 到 50 倍之间，HRI 病毒的值比参考中位数 IC50 高 50 倍。

下表列出了过去五年中检测到的 NA 氨基酸取代列表，这些取代对神经氨酸酶抑制剂的抑制作用降低。本视频中所示的基于荧光的 NA 抑制测定是一种高度稳健且可重复的测定。观看此视频并阅读实验步骤后，您应该对如何确定流感病毒对神经氨酸酶抑制剂类抗病毒药物的敏感性有很好的了解。