重组蛋白表达，结晶和生物物理研究芽孢杆菌 - 保守的核苷酸焦磷酸化酶，BcMazG
2017年5月16日
炭疽芽孢杆菌是致命性吸入性炭疽的专性病原体，因此对其基因和蛋白质的研究受到严格管制。另一种方法是研究直系同源基因。我们描述了蜡状芽孢杆菌Bc1531中的炭疽杆菌直系同源物的生物物理化学研究，需要最少的实验设备和缺乏严重的安全性问题。
该程序的总体目标是从非病原菌制备重组蛋白，以促进生物物理化学研究，例如蛋白质 X 射线晶体学或酶动力学。该方法可以帮助回答如何使用非致病菌制备目标重组蛋白以进行初步生物物理表征的关键问题。该技术的主要优点是，可以在任何配备常用仪器（如细胞培养箱和分光光度计）的实验室中对目标蛋白质进行生物物理表征。
要开始此过程，请按照文本方案中的概述准备连接反应。将 3 微升制备的连接反应物移液到含有 50 微升化学感受态大肠杆菌 DH5 α 细胞的试管中。使用移液管轻轻混合溶液。
将溶液冰敷 30 分钟。接下来，在 42 摄氏度下热休克 45 秒。之后，加入 1 毫升 LB 培养基，在 37 摄氏度下以每分钟 250 转的速度剧烈摇晃 45 分钟，同时培养细胞。
将 100 微升转化的细胞涂布到补充有 100 微克/毫升卡那霉素的 LB 螺旋板上。在 18 摄氏度下孵育 37 小时。使用无菌吸头，从板中挑取菌落。
在 3 毫升补充的 LB 培养基中培养细胞，在 18 摄氏度下以每分钟 250 转的速度剧烈摇动 18 小时。然后，准备血浆 DNA 并确认文本方案中概述的核苷酸序列。重新转化大肠杆菌 BL21 菌株后，使用无菌尖端选择一个菌落，并接种 10 毫升含有 150 微克/毫升卡那霉素的 LB 培养基。
在 37 摄氏度下孵育 18 小时，并以每分钟 250 转的速度剧烈摇晃。接下来，将 10 毫升过夜培养物转移到 1 升 LB 和卡那霉素培养基中。在 37 摄氏度下生长，直到 600 纳米处的光密度达到 0.7。
然后将培养物浸入冰冷的水中 15 分钟。将 IPTG 添加到培养物中，使最终浓度为 1 毫摩尔。在 18 摄氏度下再孵育 16 至 18 小时。
之后，在 4 摄氏度下以 5， 000 倍 G 离心 30 分钟。小心去除上清液。将细胞重悬于 50 微升含有 10 毫摩尔咪唑的 PBS 中。
接下来，按照文本方案中的详细说明在冰上裂解细胞两次。在 4 摄氏度下以 25， 000 倍 G 离心 30 分钟，以清除细胞裂解物。然后，在 50 毫升锥形管中混合 3 毫升镍珠和 47 毫升含有 10 毫摩尔咪唑的 PBS。
重力流额外的缓冲液，使平衡的微珠沉降在 2.5 x 10 cm 玻璃色谱柱中。使用移液管将上清液转移到色谱柱上。在 4 摄氏度下以每分钟 20 转的速度在纺车上孵育 2 小时。
在此之后，让上清液在重力作用下沥干。每次洗涤使用 100 毫升含有 10 毫摩尔咪唑的 PBS 洗涤镍珠 3 次。然后，应用 5 毫升含有 250 毫摩尔咪唑的 PBS 以洗脱 RBC 1531 蛋白。
按照文本方案中的概述，通过 SDS 页面分析 15 μL 洗脱液。将收集的馏分移液到透析管中。将试管放入装有 4 升凝血酶切割兼容缓冲液的烧杯中，在 4 摄氏度下过夜。
第二天，使用移液器将馏分转移到 15 mL 锥形管中。测量 280 纳米处的吸光度以估计文本方案中概述的蛋白质浓度。接下来将 50 μL RBC 1531 蛋白转移到几根试管中。
向每个试管中加入不同量的凝血酶，并在 20 摄氏度下孵育 3 小时。在确定所需的最低凝血酶量后，将 10 毫克蛋白质和 60 单位凝血酶加入 15 毫升试管中。在 20 摄氏度下孵育 3 小时。
接下来，将凝血酶消化的蛋白质转移到离心过滤管中。在 4 摄氏度下以 3， 000 倍 G 离心，以将体积减小至 5 毫升以下。在此之后，将浓缩的蛋白质应用于制备的尺寸排阻色谱柱上。
收集 60 个洗脱馏分，每管 0.5 mL。按照文本方案中的说明，在 15%SDS Page 凝胶上运行 15 μL 的每个馏分。然后混合含有 RBC 1531 蛋白的组分。
首先，将合并的馏分转移到离心过滤管中。在 4 摄氏度下以 3， 000 倍 G 离心，以将蛋白质浓缩至约 18.5 毫克/毫升。接下来，将 50 微升每种结晶筛选溶液添加到 96 孔坐滴结晶板的孔中。
在坐床上加入 0.5 μL 浓缩蛋白溶液。将蛋白质溶液与 0.5 μL 孔溶液单独混合。用透明胶膜盖住板。
在 18 摄氏度下孵育，并允许蒸汽扩散。使用光学显微镜，以 20 至 40 倍的放大倍率扫描液滴，以每天监测晶体形成，持续 2 至 3 周。制备 NTP 底物后，将每种底物添加到 96 孔板中。
使用移液管向每个孔中加入 20 μg RBC 1531 蛋白混合。盖上板盖，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。之后，将板转移到 70 摄氏度的水浴中 15 分钟，以停止 RBC 1531 介导的催化反应。
接下来，向每个孔中加入 1 微升酿酒酵母无机焦磷酸酶。在 20 摄氏度下孵育 30 分钟。然后在反应板中加入 16 微升钼酸盐酸溶液以显色。
15 分钟后，读取 690 纳米处的光密度。在这项研究中，B 严重的 BC1531 基因的蛋白产物在分子水平上进行了表征。通过镍亲和层析纯化后，进行凝血酶消化跟踪。
0.3 单位凝血酶被认为是从 RBC 1531 中完全去除亲和标签所需的最低量。消化后，使用体积排阻色谱将无标签蛋白纯化至约 99% 纯度。然后，通过体积排阻色谱法估计寡聚状态。
由于 RBC 1531 的洗脱量约为 84 mL，因此其分子量估计为 55 道尔顿。单体的计算分子量约为 13 道尔顿。因此，RBC 1531 组装为四聚体。
然后使用坐滴蒸汽扩散法进行结晶筛选。两天后，用 1 摩尔柠檬酸钠和 20% 聚乙二醇 3， 000，以及 0.1 摩尔二甲胂酸钠和 1 摩尔柠檬酸钠出现晶体。确定此 NTPase 活性后。
将钼酸盐添加到 RBC 1531 介导的水解反应中后，未见明显的颜色变化。然而，当添加焦磷酸酶时，颜色会变为深蓝色。然后使用非线性回归分析 690 nm 处的光密度和 NTP 浓度。
确定 RBC 1531 酶的最大速度为 0.75，米歇尔常数为 10 微摩尔。在尝试此过程时，请务必立即制备蛋白质样品，并丢弃含有任何阻碍蛋白质结晶或在酶测定中引入错误的杂质的馏分。开发后，这项技术为酶学和其他蛋白质科学领域的研究人员铺平了道路，他们可以使用大多数实验室装饰的分光光度计来表征感兴趣的蛋白质。
虽然这种方法可以深入了解重组蛋白制备、结晶筛选和酶动力学的一般概念，但它也可以应用于我们感兴趣的其他蛋白质的生物物理化学分析。在处理蛋白质时不要忘记小心，因为它们可能非常不稳定。需要采取预防措施，例如将样品放在冰上并在 80 度下冷藏以进行长期储存。
观看此视频后，您应该对如何从非病原菌制备重组蛋白以获得蛋白质晶体以通过 X 射线晶体学进行结构测定，以及如何使用比色法表征酶活性有很好的了解。
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概述
本研究聚焦于从非致病菌（特别是苏云金芽孢杆菌）制备重组蛋白，以促进生物物理化学研究。所描述的方法允许使用标准实验室设备对蛋白质进行表征，最大限度地减少与致病菌株相关的安全问题。
研究的主要组成部分
科学领域
- 生物化学
- 微生物学
- 生物物理学
背景
- 炭疽杆菌是吸入性炭疽的致病因子。
- 由于安全问题，对炭疽杆菌的研究受到严格监管。
- 研究非致病亲属中的直系同源基因可以提供洞见，而不会有相关的风险。
- 苏云金芽孢杆菌作为这些研究的合适模型。
研究目的
- 开发一种安全制备重组蛋白的方法。
- 使用非致病菌对蛋白质进行生物物理表征。
- 促进具备标准设备的实验室中的研究。
使用的方法
- 重组DNA的连接反应的准备。
- 用重组质粒转化大肠杆菌DH5 alpha细胞。
- 使用常见实验室仪器对蛋白质进行表征。
- 应用X射线晶体学和酶动力学等技术。
主要结果
- 成功从苏云金芽孢杆菌制备重组蛋白。
- 在标准实验室环境中展示生物物理表征方法。
- 为研究炭疽杆菌蛋白提供一种安全的替代方法。
- 提供一个对具有基本实验室设备的研究人员可访问的协议。
结论
- 该方法允许安全有效地研究与炭疽杆菌相关的蛋白质。
- 无需特殊安全措施即可进行研究。
- 这种方法为微生物学中的生物物理研究开辟了新途径。
常见问题
Executive Industry Relevance
Recombinant protein expression in non-pathogenic Bacillus cereus enables biophysical and structural studies of pathogen-conserved targets without biosafety restrictions. This approach supports early-stage target validation and mechanistic de-risking for infectious disease portfolios. The method provides a scalable, accessible workflow for R&D teams seeking predictive confidence in target characterization before advancing to higher-risk systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional and structural interrogation of pathogen-conserved targets using safe model organisms.
- Supports mechanistic de-risking by providing purified protein for biochemical and kinetic analysis.
- Facilitates predictive confidence in target selection through quantitative biophysical characterization.
Screening & Assay Development
- Prepares validated recombinant protein for downstream assay development and screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible protein samples suitable for high-throughput crystallization and enzymatic assays.
- Enables reliable compound evaluation by ensuring protein quality and purity.
Translational & Preclinical Research
- Provides structural and kinetic data that inform translational biomarker strategies when relevant.
- Ensures continuity from discovery to preclinical validation by establishing robust protein production protocols.
- Reduces biological risk prior to pathogen-based studies by leveraging non-pathogenic surrogates.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical research, supporting lead identification and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling safe, quantitative protein studies.
- Screening: Provides assay-ready protein with reproducible quality for downstream screening platforms.
- Analytics: Delivers quantitative readouts such as enzymatic kinetics and crystallographic data for comparative analysis.
- Translational Research: Aligns with preclinical workflows by establishing protein characterization protocols transferable to disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for expressing and characterizing diverse pathogen-conserved targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes protein production and characterization using widely available laboratory infrastructure.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of infectious disease targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by de-risking targets before pathogen-based studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, protein purification, and biophysical assay design.
- Needs access to standard cell culture, chromatography, and spectrophotometry equipment.
- Demands cross-team standardization of protein quality and assay protocols for reproducibility.
- May require adaptation for different protein classes or orthologs across Bacillus species.
- Protein instability and purity must be managed to avoid artifacts in downstream analyses.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
10:31
Conclusion
8:33
Results: Purification, Characterization, and Crystallization of rBC1531
0:55
Recombinant Protein Production and Purification of rBC1531
4:47
Removal of Affinity Tags by Thrombin Proteolysis
6:32
Crystallization Screening and Optimization of rBC1531
7:30
Colorimetric NTPase Assay
