Name: 重组蛋白表达，结晶和生物物理研究芽孢杆菌 - 保守的核苷酸焦磷酸化酶，BcMazG (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: 学习利用非致病性蜡样芽孢杆菌制备重组蛋白并进行生物物理化学研究的方法。本技术可在配备常规仪器的实验室中完成蛋白质晶体学和酶动力学分析，为安全研究炭疽相关蛋白提供新途径。

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X射线衍射数据集在韩国浦项加速器实验室（Korea）的7A光束线上收集。本研究由韩国国家研究基金会（NRF）管理的基础科学研究中心项目资助，资金来自韩国科学、信息通信技术与未来规划部（2015R1A1A01057574，MH）。

1. 重组蛋白 rBC1531 的表达与纯化
<ol>
	<li>重组BC1531蛋白（rBC1531）表达质粒的制备
	<ol>
		<li>制备基因组DNA B. cereus10.</li>
		<li>扩增 bc1531 基因来自模板 B. cereus 使用正向和反向引物（见材料列表）通过聚合酶链式反应（PCR）扩增基因组DNA，以生成 Bam高感染性（HI）和 SalI 限制性内切酶位点，分别10.</li>
		<li>使用限制性内切酶消化PCR产物和经修饰的pET49b载体（pET49bm） Bam高碘酸和 盐我，如上所述11.</li>
		<li>将步骤 1.1.3 中获得的消化后 PCR 产物与载体按 3:1 的比例混合，使用 T4 DNA 连接酶进行 10 µL 体系的连接反应，具体操作如下所述11在18 °C下孵育30分钟。</li>
		<li>将3 µL连接反应液加入50 µL感受态细胞中 E. coli DH5α细胞置于离心管中，用移液器轻轻吹打混匀，冰上放置30分钟。42 °C热激45秒。加入1 mL LB（Luria-Bertani）培养基，于37 °C、250 rpm剧烈振荡培养45分钟。</li>
		<li>取1.1.6步骤中转化后的细胞100 µL，均匀涂布于含100 µg/mL卡那霉素（Kan）的LB-琼脂平板上，37 °C培养约18 h。</li>
		<li>使用无菌枪头挑取菌落，将菌体接种于含 100 µg/mL Kan 的 3 mL LB 培养基中，剧烈振荡培养（250 rpm，37 °C，18 h）。</li>
		<li>使用碱性-SDS 裂解法提取质粒 DNA，具体步骤如下所述10.</li>
		<li>使用DNA测序确认rBC1531表达载体的核苷酸序列12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>rBC1531蛋白的过表达
	<ol>
		<li>重新转化 E. coli BL21 (DE3) 菌株携带 rBC1531 表达质粒，用于过表达，具体步骤见 1.1.5–1.1.6。</li>
		<li>挑选单菌落，接种于10 mL含50 µg/mL卡那霉素的LB培养基（LB+Kan）中，37 °C剧烈振荡培养18 h。</li>
		<li>将10 mL过夜培养物接种至1 L LB+Kan培养基中，于37 °C培养至OD600 （600 nm 处的光密度）达到约 0.7。</li>
		<li>将培养物浸入冰水中约15分钟，使其温度降至18 °C，然后向培养物中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），终浓度为1 mM，以诱导重组蛋白表达。在18 °C下继续培养约16–18小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>rBC1531的纯化
	<ol>
		<li>通过离心收集细胞（5,000 × g，4 °C，30 分钟）。小心弃去上清液，避免扰动细胞沉淀。将细胞重悬于 50 mL 含 10 mM 咪唑的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中。</li>
		<li>在冰上进行两次超声处理以裂解细胞，防止细胞裂解物过热（时间：2分30秒；开启周期：5秒；关闭周期：10秒；振幅：38%）。</li>
		<li>通过离心澄清细胞裂解液（约 25,000 x g，4 °C，30 分钟）。</li>
		<li>将3 mL镍珠与60 mL含10 mM咪唑的PBS混合，倒入2.5 × 10 cm玻璃层析柱中，通过重力流排出多余缓冲液，使镍珠在柱中沉降平衡。</li>
		<li>使用移液器将步骤1.3.3中的上清液转移至已预平衡的镍珠柱中，于4 °C、低速（约20 rpm）旋转摇床中孵育2小时。</li>
		<li>让上清液依靠重力自然流尽，然后用含有10 mM咪唑的PBS缓冲液洗涤柱中的镍珠3次，每次100 mL。</li>
		<li>用 4 × 5 mL 含 250 mM 咪唑的 PBS 缓冲液洗脱 rBC1531 蛋白。</li>
		<li>取1.3.7步骤洗脱液15 µL，进行15% SDS-PAGE电泳。使用考马斯亮蓝染色法在凝胶上显色蛋白质条带10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过凝血酶蛋白水解去除rBC1531蛋白的亲和标签
	<ol>
		<li>将各组分用移液器转移至透析管（截留分子量：3 kDa）中，将透析管置于含有4 L凝血酶切割兼容缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.4，150 mM NaCl，1.5 mM β-巯基乙醇）的烧杯中，4 °C下透析过夜。</li>
		<li>用移液器吸取各组分并转移至锥形管中。</li>
		<li>在280 nm处测定吸光度，并按照所述方法估算rBC1531蛋白浓度13.</li>
		<li>取50 µg rBC1531于0.5 mL离心管中，加入不同量的凝血酶（即， 2、1、0.6 和 0.3 单位）。将 rBC1531 与凝血酶的反应体系在 20 °C 下孵育约 3 小时，以确定切割 N 端亲和标签所需的最低凝血酶用量。</li>
		<li>在15% SDS-PAGE上进行rBC1531和凝血酶反应，并确定凝血酶的最低用量（例如， 每50 µg rBC1531使用0.3单位凝血酶，以完全消化N端亲和标签，获得无标签的rBC1531。</li>
		<li>向15 mL离心管中加入10 mg rBC1531蛋白和60单位凝血酶，于20 °C孵育约3小时，进行凝血酶蛋白水解反应。</li>
		<li>将凝胶过滤标准品上样至尺寸排阻色谱（SEC）柱，以制备分子量与洗脱体积的标准曲线，具体方法如下所述13.</li>
		<li>将1.4.6步骤中经凝血酶消化的rBC1531蛋白置于离心过滤管（分子量截留值：3 kDa）中，在4 °C、3,000 g条件下离心，浓缩至体积小于5 mL。</li>
		<li>将浓缩的rBC1531蛋白上样至SEC柱，每管收集0.5 mL，共收集60个洗脱组分13.</li>
		<li>取每种组分15 µL，在15% SDS-PAGE上电泳，并按所述方法使用考马斯亮蓝染色液（0.15% (w/v) 考马斯亮蓝R-250、40% (v/v) 甲醇和10% (v/v) 冰乙酸）染色凝胶10.</li>
		<li>用移液器收集含有 rBC1531 的组分，并将其合并至同一离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. rBC1531 的结晶筛选与优化
<ol>
	<li>rBC1531蛋白结晶条件的筛选
	<ol>
		<li>使用离心滤管将步骤 1.4.11 中的 rBC1531 浓缩至约 18.5 mg/mL，操作方法同步骤 1.4.8 所述。</li>
		<li>加入50 µL每种结晶筛选溶液（见第2.2节）14 将96孔坐滴结晶板的各孔中加入0.5 µL浓度为18.5 mg/mL的rBC1531蛋白溶液，置于坐滴基底上。再向每孔加入0.5 µL储液，与蛋白溶液混合，重复此操作完成整块板的加样。</li>
		<li>用透明粘性封板膜覆盖平板。将96孔板置于18 °C条件下，进行蒸汽扩散。</li>
		<li>使用光学显微镜以20-40倍放大倍数扫描液滴，每天监测晶体形成情况，持续2-3周。</li>
		<li>收集X射线衍射数据12 使用获得的 rBC1531 蛋白晶体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>rBC1531 结晶条件的优化
	<ol>
		<li>配制500 µL选定的初始结晶条件溶液（例如， 0.1 M 二甲胂酸钠，pH 6.5，以及 1.0 M 柠檬酸钠）并填充至24孔结晶板中用于悬滴法结晶。</li>
		<li>向坐滴板中加入0.5 µL的18.5 mg/mL rBC1531蛋白溶液，与0.5 µL储液混合，立即用透明粘性膜封板。将板置于18 °C条件下。</li>
		<li>在光学显微镜下观察晶体生长，持续一周。</li>
		<li>通过改变pH值优化各种结晶条件即， pH 5.5–6.8）的0.1 M 卡可基酸缓冲液，并通过改变盐浓度（即， 0.9–1.2 M 的柠檬酸钠以获得单晶。监测晶体生长约 1 周，并收集 X 射线衍射数据12.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. rBC1531 核苷三磷酸酶（NTPase）活性的表征
<ol>
	<li>无机磷酸盐依赖性比色法研究的验证
	<ol>
		<li>配制焦磷酸盐储备液（100 mM），并用反应缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.4；150 mM NaCl；2 mM MgCl₂）稀释至终体积为 200 µL，终浓度分别为 0.1、0.25、0.5、1.0、5.0、10、50、100 和 250 µM。2在两个96孔板中进行平行实验。第一个孔板作为空白对照（不含焦磷酸酶）。根据步骤3.1.2的指示，确保第二个孔板含有焦磷酸酶，作为工作板使用。</li>
		<li>加入0.01单位的 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 向工作板的各孔中加入无机焦磷酸酶（1 µL），在20 °C孵育30–60分钟。</li>
		<li>将钼酸铵溶液（0.86% v/v）与抗坏血酸溶液（14% v/v）按7:3体积比混合，配制钼酸溶液。向工作孔和对照孔中各加入16 µL钼酸溶液，室温避光孵育15分钟。</li>
		<li>在 690 nm 处读取光密度（OD）690 nm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>比色法NTP酶活性检测
	<ol>
		<li>制备100 mM核苷三磷酸（NTP）底物储备液，并稀释至所需浓度（例如， 0、0.2、4.4、11、22、44、88 或 132 µM）溶于 180 µL 检测缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.4；150 mM NaCl；2 mM MgCl₂）中2).</li>
		<li>在96孔板中，每孔加入20 µg rBC1531（1.5 mM）及步骤3.2.1中的NTP底物，总体积补至200 µL，用移液器吹打混匀。盖上板盖，置于37 °C培养箱中孵育30 min，以进行底物水解反应。</li>
		<li>将培养板转移至70 °C水浴中，静置15 min，以终止rBC1531介导的催化反应。</li>
		<li>加入0.01单位的 S. cerevisiae 无机焦磷酸酶（1 µL）加入反应板的每孔中（来自步骤 3.2.3），20 °C 孵育 30 分钟。向反应板中加入 16 µL 钼酸溶液以显色（约 15 分钟）。在 OD 处读数690 nm.</li>
		<li>使用米氏方程进行分析，具体方法如前所述12.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于安全限制和法规要求，对真正病原体的研究受到限制。作为替代方案，可利用进化上相关的非致病菌或低致病性物种来研究病原体。在B. anthracis中，ba1554基因被认为是一个关键基因。幸运的是，在非临床来源的B. cereus中也存在一个完全相同的基因。因此，在无重大安全顾虑的情况下，可使用重组BC1531蛋白进行生物物理和酶学特性分析。本文详细描述了从基因到纯化重组蛋白的完整实验流程。利用该重组蛋白，我们开展了生物物理特性分析，结果表明四聚体形式的rBC1531能够催化NTP水解生成NMP和PPi。
凝胶过滤层析（SEC）被用作蛋白质纯化的最后一步，以去除来自细胞裂解液中与rBC1531分子大小不同的任何蛋白质污染物。同时使用SEC柱测定rBC1531的寡聚状态，结果显示其为四聚体。rBC1531的晶体结构也一致确定为四聚体形式12。
在生物物理技术中，X射线晶体学是获得蛋白质原子模型的最佳技术。通常，X射线衍射需要尺寸...

重组蛋白表达被广泛用于解决天然蛋白来源相关的问题，例如蛋白产量有限和有害污染。此外，在致病基因和蛋白的研究中，可以使用无需额外安全防护措施的替代实验室菌株。例如，由于进化关系密切，Bacillus cereus 是研究 Bacillus anthracis 的有用模型1。
B. anthracis 是一种专性病原体，可导致人类和家畜致命的吸入性炭疽病，并且有可能被用作生物武器2。因此，针对 B. anthracis 的实验室研究受到美国疾病控制与预防中心的严格监管，要求在生物安全三级（BSL-3）条件下进行操作，其中包括将实验室区域隔离并维持负压环境。与 B. anthracis 不同，B. cereus 被归类为生物安全一级（BSL-1）病原体，因此其安全风险极低。B. cereus 是一种机会性病原体，感染后通常引起食物中毒，且多数情况下无需医疗干预即可自愈。然而，由于 B. cereus 与 B. anthracis 共享许多关键基因，因此可通过研究 B. cereus 中的同源蛋白来揭示 B. anthracis 蛋白的功能1。
这 ba1554 - ba1558 基因簇 B. anthracis 高度保守，与 bc1531- bc1535 簇 的 B. cereus以及与 bt1364-bt1368 簇 Bacillus thuringiensis，在基因结构和序列方面。此外，前几个基因（ba1554, bc1531，以及 bt1364）各自的簇是绝对保守的（即， 100% 核苷酸序列一致性），暗示该基因产物具有关键作用 芽孢杆菌属 物种。由于其位于这些基因簇中的位置， ba1554 被错误鉴定为一种假定的转录调控因子3然而，对氨基酸序列的分析表明 ba1554 产物表明其属于MazG家族，具有核苷酸焦磷酸水解酶活性，且不具有转录因子活性4,5尽管属于MazG家族的蛋白质在整体序列和长度上具有多样性，但它们共享一个约100个残基的MazG结构域，该结构域的特征为EXXE基序12-28EXXD基序&#34;X&#34; 代表任意氨基酸残基，数字表示X残基的数量。
MazG 结构域并不总是直接对应某种特定的催化活性。来自大肠杆菌（Escherichia coli）的 MazG 成员（EcMazG）含有两个 MazG 结构域，但只有C端的 MazG 结构域具有酶活性6。此外，MazG 酶的底物特异性各不相同，从非特异性的核苷三磷酸（如 EcMazG）到特异性的 dCTP/dATP（如整合素相关 MazG）以及 dUTP（如 dUTPase）均有所报道6,7,8,9。因此，有必要对 BA1554 蛋白进行生物物理化学分析，以确认其 NTPase 活性并阐明其底物特异性。
本文提供了一种分步实验方案，大多数不具备BSL-3设施的实验室均可遵循该方案在分子水平上表征B. cereus bc1531基因的蛋白质产物，该基因是B. anthracis ba1554的直系同源基因。简言之，将重组BC1531蛋白（rBC1531）在E. coli中表达，并利用亲和标签进行纯化。针对X射线晶体学实验，对rBC1531蛋白的结晶条件进行了筛选与优化。为评估rBC1531的酶活性，采用比色法检测其NTP酶活性，以避免传统方法中使用放射性标记核苷酸。最后，通过对所获得的生物物理化学数据进行分析，确定了rBC1531的寡聚状态和催化参数，并从rBC1531晶体获得了X射线衍射数据。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Bacillus cereus&lt;/em&gt; ATCC14579</td><td>韩国组织培养收藏中心</td><td>3624</td><td></td></tr><tr><td>基因组DNA提取试剂盒</td><td>GeneAll</td><td>106-101</td><td>基因组DNA制备</td></tr><tr><td>正向引物</td><td>Macrogen</td><td>GAAGGATCCGGAAGCAAAAA&lt;br/&gt; CGATGAAAGATATGCA</td><td>&lt;em&gt;Bam&lt;/em&gt;HI位点已加下划线</td></tr><tr><td>反向引物</td><td>Macrogen</td><td>CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT&lt;br/&gt; CCCTCATCAATACGTG</td><td>&lt;em&gt;Sal&lt;/em&gt;I位点已加下划线</td></tr><tr><td>nPfu-Forte</td><td>Enzynomics</td><td>P410</td><td>PCR聚合酶</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bam&lt;/em&gt;HI</td><td>Enzynomics</td><td>R003S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sal&lt;/em&gt;I</td><td>Enzynomics</td><td>R009S</td><td></td></tr><tr><td>pET49b表达载体</td><td>Novagen</td><td>71463</td><td>表达载体经改造以添加亲和标签及BamHI/SalI位点&lt;sup&gt;10&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>Enzynomics</td><td>M001S</td><td></td></tr><tr><td>透析膜</td><td>Thermofisher</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>干式恒温仪</td><td>JSR</td><td>JSBL-02T</td><td></td></tr><tr><td>LB肉汤（Luria-Bertani）</td><td>LPS solution</td><td>LB-05</td><td></td></tr><tr><td>LB琼脂，Miller型（Luria-Bertani）</td><td>贝克顿·迪金森公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>LPS solution</td><td>KAN025</td><td></td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>Favorgen</td><td>FAPDE300</td><td>质粒DNA制备</td></tr><tr><td>BL21(DE3)感受态细胞</td><td>Novagen</td><td>69450-3CN</td><td></td></tr><tr><td>异丙基-&amp;beta;-D-硫代半乳糖苷（IPTG）</td><td>Fisher BioReagents</td><td>50-213-378</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Daejung</td><td>7548-4100</td><td>PBS组分</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Daejung</td><td>6566-4405</td><td>PBS组分</td></tr><tr><td>磷酸钾</td><td>Bio Basic Inc</td><td>PB0445</td><td>PBS组分</td></tr><tr><td>磷酸钠</td><td>Bio Basic Inc</td><td>S0404</td><td>PBS组分</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Bio Basic Inc</td><td>IB0277</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Sonics</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA琼脂糖</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>镍珠</td></tr><tr><td>旋转混合仪</td><td>Finepcr</td><td>AG</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein双色蛋白标准品</td><td>Bio-rad</td><td>1610374</td><td>SDS-PAGE蛋白标准品</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝R-250</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP101-25</td><td>考马斯亮蓝染色液</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Samchun chemical</td><td>M0585</td><td>考马斯亮蓝染色液</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Daejung</td><td>1002-4105</td><td>考马斯亮蓝染色液</td></tr><tr><td>透析膜</td><td>Thermofisher</td><td>68035</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>凝血酶</td><td>Merckmillipore</td><td>605157-1KUCN</td><td>分装为20 &amp;mu;L（每&amp;mu;L含1单位），于-70 &amp;deg;C保存，使用前解冻</td></tr><tr><td>Superdex 200 16/600</td><td>通用电气</td><td>28989335</td><td>凝胶过滤层析</td></tr><tr><td>凝胶过滤标准品</td><td>Bio-rad</td><td>151-1901</td><td></td></tr><tr><td>离心过滤器</td><td>Amicon</td><td>UFC800396</td><td></td></tr><tr><td>结晶板</td><td>Hampton research</td><td>HR3-083</td><td>96孔坐滴板</td></tr><tr><td>JCSG核心试剂套装I-IV</td><td>Qiagen</td><td>130924-130927</td><td>结晶筛选溶液</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>Cryschem板</td><td>Hampton research</td><td>HR3-158</td><td>24孔坐滴板</td></tr><tr><td>无机焦磷酸酶</td><td>Sigma</td><td>10108987001</td><td></td></tr><tr><td>钼酸铵溶液</td><td>Sigma</td><td>13106-76-8</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Sigma</td><td>50-81-7</td><td></td></tr><tr><td>NTP底物</td><td>Startagene</td><td>200415-51</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Biotek</td><td>SynergyH1</td><td>微孔板读板仪</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5</td><td>GraphPad</td><td>Prism 5 for Window</td><td></td></tr></tbody></table>

重组蛋白表达、结晶及生物物理研究 芽孢杆菌属保守的核苷酸焦磷酸化酶，bcmazg

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

为克服研究真实病原体基因和蛋白质时面临的安全限制与法规，可转而研究其同源物。 炭疽杆菌 是一种专性病原体，可引起致命的吸入性炭疽。 Bacillus cereus 被认为是研究的有用模型 B. anthracis 由于其密切的进化关系。该基因簇 ba1554 - ba1558 的 B. anthracis 高度保守，与 bc1531- bc1535 簇集 B. cereus以及与 bt1364-bt1368 簇集 苏云金芽孢杆菌 表明相关基因在其中的关键作用 芽孢杆菌属 属。本文描述了制备和表征第一个基因的蛋白质产物的方法ba1554) 来自基因簇中的基因 B. anthracis 使用其直系同源物的重组蛋白 B. cereus, bc1531

本研究中目标蛋白的表征首先需要制备足量的重组 B. cereus bc1531（rBC1531）蛋白，理想情况下应超过数毫克。通过 PCR 扩增编码 BC1531 蛋白的 DNA 片段，以 B. cereus 的基因组 DNA 作为模板，因其含有与 ba1554 相同的直系同源基因。rBC1531 在 E. coli 细胞中以可溶性蛋白的形式过表达。rBC1531 蛋白在其 N 端带有 6x-His 标签和凝血酶切割位点12。纯化的第一步采用镍亲和层析法对 rBC1531 进行纯化（图 1A）。随后进行凝血酶消化实验，以确定完全切除 rBC1531 上亲和标签所需的最低凝血酶用量（图 1A）。在本实验室条件下，0.3 单位的凝血酶足以完全去除 rBC1531 上的亲和标签。因此，在放大实验中，每 10 mg rBC1531 使用 60 单位凝血酶进行标签切除。凝血酶消化后，将去标签的 r...

Bacillus anthracis 是致命性吸入性炭疽病的专性病原体，因此对其基因和蛋白质的研究受到严格管制。一种替代方法是研究其直系同源基因。本文描述了对 B. anthracis 在 B. cereus 中的直系同源基因 bc1531 所开展的生物物理化学研究，该研究仅需最少的实验设备，且无重大安全顾虑。

重组蛋白表达、结晶及生物物理研究 芽孢杆菌属保守的核苷酸焦磷酸化酶，BcMazG

为克服在研究真实病原体的基因和蛋白时所面临的安全限制与监管规定，可转而研究其同源物。Bacillus anthracis ...

本实验的总体目标是从非致病性细菌中制备重组蛋白，以促进蛋白质X射线晶体学或酶动力学等生物物理化学研究。该方法有助于回答如何利用非致病性细菌制备目标重组蛋白以进行初步生物物理表征的关键问题。该技术的主要优势在于，只要实验室配备细胞培养摇床和分光光度计等常规仪器，即可对目标蛋白进行生物物理表征。开始此实验步骤时，按照文本方案中所述准备连接反应。将3 µL已准备好的连接反应液加入含有50 µL化学感受态E.coli DH5 alpha细胞的离心管中。使用移液器轻轻混匀溶液。将溶液置于冰上孵育30分钟。接着，在42摄氏度下热激45秒。之后，加入1毫升LB培养基，于37摄氏度、250转/分钟剧烈振荡培养细胞45分钟。将100微升转化后的细胞涂布于含有100微克/毫升卡那霉素的LB琼脂平板上。在37摄氏度下培养18小时。使用无菌枪头从平板上挑取菌落。将细胞在3 mL添加了补充物的LB培养基中，于18 °C、250 rpm剧烈振荡培养18小时。然后，制备质粒DNA，并按照文本方案中所述确认核苷酸序列。将质粒重新转化至E.coli BL21菌株后，用无菌枪头挑取单克隆菌落，接种于10 mL含有150 µg/mL卡那霉素的LB培养基中。在37摄氏度、250转/分钟剧烈振荡条件下孵育18小时。随后，将10毫升过夜培养物转移至1升LB加卡那霉素培养基中。在37摄氏度培养，直至600纳米处的光密度达到0.7。然后将培养物浸入冰水中15分钟。向培养物中加入IPTG，使其终浓度为1毫摩尔。在18摄氏度下继续培养16至18小时。此后，在 4°C 条件下以 5,000 × g 离心 30 分钟。小心移除上清液。将细胞重悬于 50 µL 含 10 mM 咪唑的 PBS 中。接下来，按照文本方案中的详细步骤，在冰上裂解细胞两次。在4°C条件下，以25,000 × g离心30分钟，以澄清细胞裂解液。然后，在50毫升锥形管中混合3毫升镍珠和47毫升含有10毫摩尔咪唑的PBS溶液。将多余的缓冲液依靠重力流过，使平衡后的珠子沉降于一根2.5 × 10厘米的玻璃层析柱中。使用移液器将上清液转移至该层析柱中。在4°C下于旋转轮上以每分钟20转的速度孵育两小时。此后，让上清液依靠重力自然流尽。每次使用 100 毫升含 10 毫摩尔咪唑的 PBS 缓冲液，将镍珠洗涤三次。然后，加入 5 毫升含 250 毫摩尔咪唑的 PBS 缓冲液，以洗脱 RBC 1531 蛋白。按照文本方案中所述，通过 SDS-PAGE 分析 15 微升洗脱液。将收集的组分用移液器加入透析管中。将透析管置于含有 4 升凝血酶切割兼容缓冲液的烧杯中，在 4 摄氏度下透析过夜。第二天，使用移液器将组分转移至15毫升锥形管中。在280纳米处测定吸光度，以估算蛋白质浓度，具体方法如文本方案所述。随后，将50微升RBC 1531蛋白质转移至多个试管中。向每根试管中加入不同量的凝血酶，在20摄氏度下孵育3小时。在确定所需最小凝血酶量后，向一个15毫升试管中加入10毫克蛋白质和60单位凝血酶。在20摄氏度下孵育3小时。接下来，将凝血酶消化后的蛋白质转移至离心过滤管中。在4°C条件下以3,000 × g离心，浓缩体积至小于5毫升。随后，将浓缩后的蛋白质上样至预先准备好的尺寸排阻色谱柱中。每管收集0.5毫升，共收集60个洗脱组分。按照文本方案中的说明，取每管15微升在15% SDS-PAGE凝胶上进行电泳。然后合并含有RBC 1531蛋白的组分。首先，将合并的组分转移至离心过滤管中。在4°C条件下以3,000 × g离心，浓缩蛋白质至约18.5毫克/毫升。随后，向96孔坐滴结晶板的每个孔中加入50微升结晶筛选溶液。在坐滴板上加入0.5微升浓缩蛋白质溶液。将蛋白质溶液与0.5微升储液槽溶液单独混合。用透明粘性膜封住板子。在18摄氏度下孵育，并进行蒸汽扩散。使用光学显微镜，在20至40倍放大倍数下每日观察液滴，监测晶体形成，持续两到三周。制备NTP底物后，将其分别加入96孔板中。使用移液器将20微克RBC 1531蛋白加入每个孔中并混匀。盖上板盖，在37摄氏度孵育30分钟。随后，将板转移至70摄氏度水浴中15分钟，以终止RBC 1531介导的催化反应。接下来，向每个孔中加入 1 µL 的酿酒酵母无机焦磷酸酶。在 20 °C 下孵育 30 分钟。然后向反应板中加入 16 µL 钼酸溶液以显色。15分钟后，在690纳米处读取光密度。本研究在分子水平上对B型严重感染相关基因BC1531的蛋白质产物进行了表征。通过镍亲和层析纯化后，进行凝血酶消化实验。0.3 单位的凝血酶被证实是完全去除红细胞 1531 上亲和标签所需的最低用量。消化后，通过尺寸排阻色谱法将去标签蛋白纯化至约 99% 的纯度。随后，采用尺寸排阻色谱法评估其寡聚状态。由于RBC 1531在约84毫升处被洗脱，其分子量估计为55千道尔顿。该单体的计算分子量约为13千道尔顿。因此，RBC 1531以四聚体形式组装。随后采用悬滴蒸汽扩散法进行结晶筛选。在含有1摩尔柠檬酸钠和20%聚乙二醇3,000，或0.1摩尔二甲胂酸钠和1摩尔柠檬酸钠的条件下，两天后观察到晶体。随后测定NTP酶活性。加入钼酸盐后，RBC 1531 介导的水解反应未见明显的颜色变化。然而，当加入焦磷酸酶后，溶液颜色变为深蓝色。随后采用非线性回归分析在 690 纳米处的光密度与 NTP 浓度之间的关系。RBC 1531 酶的最大反应速率为 0.75，米氏常数为 10 微摩尔。在进行该实验操作时，需及时制备蛋白质样品，并弃去含有任何可能阻碍蛋白质结晶或导致酶学测定误差的杂质的组分。该技术建立后，为酶学及其他蛋白质科学研究领域的研究人员利用大多数实验室中配备的分光光度计来表征目标蛋白质铺平了道路。尽管该方法可用于了解重组蛋白制备、结晶筛选以及酶动力学的一般原理，但它也可应用于我们感兴趣的其他蛋白质的生物物理化学分析。操作蛋白质时务必小心，因为它们可能极不稳定。建议采取一些预防措施，例如将样品置于冰上操作，并在长期保存时于 -80 °C 条件下冷冻。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用非致病性细菌制备重组蛋白，以获得用于X射线晶体学结构解析的蛋白晶体，以及如何使用比色法表征酶活性。

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Research

科研

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Biochemistry

生物化学

重组蛋白表达，结晶和生物物理研究<em&gt;芽孢杆菌</em&gt; - 保守的核苷酸焦磷酸化酶，BcMazG

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