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Organic Chemistry

通过沉淀混合物的分离

Separation of Mixtures via Precipitation

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JoVE Science Education Organic Chemistry

Separation of Mixtures via Precipitation

2.1: Introduction to Catalysis

2.13: Performing 1D Thin Layer Chromatography

157,221 Views

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08:02 min

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April 30, 2023

Overview

资料来源: 实验室的博士安娜 · 加西亚-Sáez 中 — — 蒂宾根大学

大多数样品感兴趣的是许多不同的组件的混合物。样品制备，在分析的过程中，一个关键步骤删除可能会影响分析的干扰。因此，开发分离技术是重要的努力，不只是在学术界，但也在工业。

分离混合物的一种方法是使用他们的溶解性能。在这简短的文件，我们将处理水溶液。感兴趣的一种化合物的溶解度取决于（1）离子强度的溶液，（2）的 ph 值和温度（3）。通过操纵与这三个因素，这种化合物是不溶性条件可以用于从剩下的采样删除这种化合物的兴趣。¹

Principles

参数数目可以用于分隔感兴趣的样品从杂质通过降低其溶解度，和作为一种固体，从解决方案中移除它，如图 1所示。第一，改变溶液离子强度可以改变物质的溶解度。这常常涉及加入额外的盐（也称为盐析）或另外的反离子，形成更低的可溶性物种与化合物感兴趣。²

图 1。溶解平衡受离子强度、 ph 值和温度。利息（黄色）化合物杂质分离，（红色）通过改变其在特定溶剂中的溶解度。

更改的溶液 ph 值可能会更改该化合物的净电荷。在一定 ph 值、净电荷为零（也称为等电点），这种化合物成为不溶于水，最终形成一种固体。温度也影响溶解度，较高的温度随着溶解性固体。

固体形成率确定相对纯度 (图 2)。一般情况下，降水是指形成固体速度快，从而产生一些杂质非晶态样品内被困。这是常见的盐析和 ph 值变化诱导过程。当此过程减慢时，杂质不困在化合物和产生相对较纯的固体。这种技术被受雇于再结晶。在此过程中，一种化合物溶于足够溶剂，只是在高温下的饱和点。这饱和溶液然后允许慢慢冷静下来。当溶液冷却时，该组件的溶解度降低，和超过溶解度化合物形成有序的固体（否则为称为晶体）而不是一种无定形的固体。在溶液中的杂质做不被抓，缓慢的过程允许去除这些杂质在固体表面之前他们被困。¹

图 2。降水和再结晶之间差异。

一旦固已形成（是否作为一种晶体或沉淀），它应该从其余的混合物分离。过滤是将它们分开的一种方法。这采用多孔材料的选择性抑制作用通过固体材料，但不是解决办法。

离心法是混合物的另一种方法从其余中分离沉淀。离心向心加速度用于分离混合物基于它们的密度。自固体的密度比水溶液，固体沉积物在容器的底部。固体也称为颗粒和水溶液上, 清液。上清液可以然后倒或使用吸管或注射器抽取。晶体是脆弱和离心往往不雇用他们分开的解决方案。

这个视频将涵盖不同分离化合物通过固体形成（盐析、 ph 值的变化和再结晶）和其后续脱除水溶液通过过滤或离心的方法。

Procedure

1.沉淀的 CaCO₃

准备 1 M CaCl₂5 毫升。
准备 5 毫升 1 M Na₂CO₃。
在小离心管（1.5 毫升），添加的 CaCl₂ 750 µ L 和 Na₂CO₃750 µ L。
等待 2 分钟反应发生。该解决方案应该转阴。
离心机的混合物在拥有 10 万 × g 5 分钟。
倒上清液。
添加颗粒 1 毫升的冷水。
通过在 10 旋涡混合器混合悬小球 s。
离心机的混合物在拥有 10 万 × g 5 分钟。
倒上清液。

2.牛奶蛋白质的沉淀

倒入烧杯里的牛奶，添加搅拌棒。
轻轻地直到搅拌热板在 40 ° C 的热牛奶。不加热超过 40 ° c。
混合 7.5 毫升的乙酸和在足够的水来达到 50 毫升稀释法制备醋酸 15%(v/v)。
沉浸在温热的牛奶，pH 计电极和监测 ph 值。
将乙酸往牛奶里加一落，直到达到 ph 值为 4.6。
过滤的牛奶
1. 长笛一张过滤纸，将其放置在一个漏斗。
2. 漏斗置于烧瓶中，酸性的乳溶液倒入漏斗。
3. 如倒上的解决方案，可能会堵塞过滤纸。使用一种搅拌棒，鼓动的解决方案和过滤纸，偶尔来疏通。如果它并不能提高解决方案的通道，改变过滤纸。
4. 置于新的滤纸台式和尽可能多的湿法转移固体新的滤纸。这应吸收更多的水，从固态。
5. 如果新的滤纸获取太湿，继续改变它直到湿润滤纸上的最小金额。按下它轻轻地来吸收更多的水，如果需要的话。
6. 干燥后的固体，并重新暂停中约 70%乙醇。再次执行步骤 2.6.1 到 2.6.5 固体进行筛选。
离心法牛奶（作为过滤的替代方法）
1. 将混合物 50 毫升部分转移到 50 mL 离心管。
2. 离心机在 4,500 × g 10 分钟，然后倒上清液。
3. 将 50 毫升 70%乙醇添加到颗粒。
4. 使用一种搅拌棒，悬在乙醇中的小球。
5. 以下步骤 2.7.2 此悬浮液离心。
在缓冲区进行进一步的分析，如 SDS — PAGE 悬小球，否则将它存储在 4 ° c。

3.再结晶的氯化钾

重 50 克的氯化钾在锥形瓶，并添加 100 毫升的水
将混合物加热直到水沸腾。请确保所有的氯化钾粉溶解。一些杂质可能不溶于水。
加热混合物与另一个（空）锥形瓶和保持它很温暖。
将一个漏斗滤纸放在温暖的空瓶。
倒通过滤纸除去不溶性的杂质解决方案。接收瓶保暖确保没有温度的变化发生在过滤，否则为原油沉淀物将形成过程中。如果发生这种情况，再将混合物加热直到所有沉淀都溶解。
从热去除瓶与解决方案。
保持它在房间里阴凉的地方，让它冷却下来，慢慢地，约 30 分钟，或直到它不再是温暖去触摸。
一旦冷却至室温，将烧瓶置于冰浴，可进一步降低温度。或者，一个人可以离开烧瓶内冰箱或温度控制的房间在 4 ° c。
晶体可以收获通过筛选在 3.4-3.5 步骤（使用一个烧瓶和漏斗在室温）。

降水是一种用于分离混合物基于溶解度及其组件的技术。一种化合物的溶解度取决于离子强度的溶液，其 ph 值和温度。操纵这些因素可以导致一种化合物，成为一种不溶性的固体，并从溶液。这被所谓的降雨。

不溶固体，最初被称为，沉淀形成悬浮，也就是说，它较好地分散在溶液中。沉淀通常会聚集，然后从分离液体通过沉降、离心或过滤。本视频将介绍几种方法分离化合物沉淀，和演示实验室的过程。

通过引入反离子，可以从溶液沉淀溶解的化合物。例如，银可以沉淀从溶液中氯化钠与硝酸银反应。硝酸根离子取而代之的是一个反离子，氯离子，形成固体氯化银。

盐溶液浓度的增加，也能诱导沉淀。这种技术称为盐析，是常见的蛋白质的分离。在高盐浓度下，水分子是更容易被吸引溶解盐，离开少稳定蛋白质。因此，蛋白质分子聚合，形成固体。

在 ph 值的变化都可以引起降水。在高和低的 ph 值，蛋白是负责吸引和极性溶液。在某一时刻，净电荷的一种化合物变为零。这是的等电点或 pI。这种化合物是无法与极性溶液，造成它聚合和沉淀进行交互。

温度也影响溶解度，较高的温度随着固体的溶解度。降低温度，溶解的化合物可以重新巩固。固体形成率确定相对纯度。

以下实验就说明从牛奶使用 ph 值，并进一步通过过滤和离心方法分离蛋白酪蛋白沉淀。

要开始此过程，请添加入大烧杯搅拌棒的 250 毫升的牛奶。轻轻地温暖的牛奶到 40 ° C 搅拌放在铁板上。PH 计浸入温暖的牛奶，并监测 ph 值。将乙酸往牛奶里加一落，直到 ph 值达到酪蛋白的等电点，4.6。不溶性的牛奶蛋白质或凝乳，从解决方案的等电点沉淀。通过过滤从解决方案中移除凝乳。如果过滤纸获取堵塞、混合用刮刀把帮助解决流过。如果这不能改善过滤，改变过滤纸。将湿的固体从堵塞过滤纸转移到新的滤纸。这应吸收更多的液体或乳清，从固体。继续改变过滤纸，直到最小湿度。轻轻拍压固体可以帮助过滤纸吸收更多的乳清。

70%乙醇洗出凝乳磷脂，然后重复过滤过程中重新暂停奶粉固体。作为过滤的替代方法，蛋白质固体也可分为采用离心法。离心机 50 毫升的牛奶混合物的部分和倒上清液。再次悬浮颗粒在 50 毫升的 70%乙醇，以帮助从凝乳，删除磷脂和重复离心过程。

牛奶蛋白固体然后可以存储或重新悬浮在作进一步的分析，如 SDS — PAGE 的另一种解决方案。更多的信息，请参阅在此技术上的我们的视频。SDS — PAGE 分析表明降水启用的乳清中的大部分杂质去除。所有的酪蛋白被发现颗粒，而在上清液中，并没有发现。

降水是常用的技术，可以用于分离各种混合物或溶液。

化合物可以从使用反离子，如本例中的碳酸钙沉淀的溶液中沉淀出来。

氯化钙和碳酸钠都溶在水相中。

当他们混杂的时钙和碳酸钙形成不溶性的固体，可以用离心分离。有关本主题的详细信息，请参阅上溶度积规则的我们的教育视频。

在制备纳米级固体在广泛的在纳米技术中的应用中发现的可以利用降雨。在此示例中，纳米级种子被用于控制纳米晶体的生长。

前体加热与膦硒化反应，然后迅速冷却。甲醇被添加到冷却解决方案，从而沉淀固体。离心，随后收复了晶体和晶体结构与 x 射线衍射分析。

降水可也用于制备高分子配体中药物释放的应用。在此示例中，配体合成和共轭对白金为使用作为一种抗癌疗法。第一，以酰胺偶联反应，合成了配体。它沉淀随着反应的进行。它恢复了然后使用过滤。

固体被纯化使用再结晶，然后再过滤。配体当时络铂化合物，风干，并进行纯化水从分步沉淀用丙酮。白金耦合证实使用核磁共振波谱。化合物，可作为抗肿瘤药物研究其疗效和副作用。

你刚看了朱庇特的简介用沉淀混合物的分离。现在，您应该了解降水，以及如何执行这些实验在实验室中的各种的方法。

谢谢观赏！

Results

溶解平衡被从事许多的净化过程。钙可以从使用碳酸钠的水。CaCO₃的溶度积 (K_sp) 是 4.8 × 10^-9。混合的 CaCl₂ 1 米和 1 米的 Na₂CO₃产生 CaCO₃沉淀。沉淀分离其余的解决方案采用离心法。

酪蛋白（牛奶中的关键蛋白）等电点 ph 值为 4.6，在此 ph 值形成不溶性的凝乳。凝乳分离后从其余的解决方案（也叫乳清）使用过滤或离心（图 3a）。豆腐用乙醇去除磷脂和其他人也被困的水溶性化合物中豆腐被冲走。离心法避免损失的蛋白质比过滤一样坚持过滤纸的一些蛋白质。采用 SDS — PAGE (图 3b)，显示沉淀反应从乳清分离酪蛋白的大部分分析了分离的组分。其他的牛奶蛋白质，例如球蛋白，与酪蛋白沉淀。进一步采取的步骤可用于分离酪蛋白的其余部分。

降水从固体中, 移除的大部分杂质，然而它还可以捕获一些矩阵中的杂质。再结晶经常被雇用，进一步净化固体 (图 4)。在此实验中，固被混合溶剂中的固体并非十分易溶。然后有人溶剂的沸点混合物的温度和足够坚实添加饱和热溶剂。然后可以通过过滤步骤删除其他不溶性杂质。热溶液是逐渐冷却至室温，然后冷却进一步在冰箱/房间/冰洗冷水浴。缓慢的过程导致晶体而不是无定形沉淀。可溶性杂质不被纳入晶格和由此产生的晶体被相对比原油沉淀更纯洁。水晶然后收获使用过滤和左，干燥的空气中（或在真空中）。

图 3。沉淀的牛奶蛋白质。（A)图片牛奶蛋白分离中的不同步骤。(B) SDS — PAGE 的不同样品。

图 4。再结晶的氯化钾。

Applications and Summary

沉淀反应被适用于许多样品制备过程。如前所述，它们可以用于删除盐或特定离子根据其溶解性的平衡。它们也可以用于删除混合物中的蛋白质和其他生物分子。

再结晶经常被雇用，进一步净化固体。此过程将删除被困内固体杂质。除其他外，可以用重结晶来净化盐和有机分子。

离心和过滤技术，适用于大多数样品制备要求从溶剂分离不溶组分。过滤通常在有机化学中用于从其溶剂分离纯结晶的化合物。它也用后固-液萃取天然产物化学或化学分析。离心法通常用于分离混合物的不同密度和如图所示在这里应用于乳成分和沉淀的盐的分离。

在生物化学领域，如蛋白质、脂类和 DNA 分离的大多数过程涉及沉淀反应、离心、过滤的方法净化样品。而其中大多数的进程已完全标准化到商业套装，仍有很大的空间优化，因为不同的生物分子需要不同的条件。

References

Kotz, J., Treichel, P., Townsend, J. Chemistry and Chemical Reactivity. 8^th ed. Brooks/Cole, Belmont, CA (2012).
Arakawa, T., Timasheff, S.N. Mechanism of Protein Salting In and Salting Out by Divalent Cation Salts: Balance between Hydration and Salt Binding. Biochemistry. 23, 5912-5923 (1984).

Transcript

Precipitation is a technique used to separate a mixture based on the solubility of its components. The solubility of a compound depends on the ionic strength of the solution, its pH, and temperature. Manipulation of these factors can cause a compound to become an insoluble solid, and fall out of solution. This is called precipitation.

The insoluble solid, called the precipitate, initially forms a suspension, meaning that it is well dispersed in solution. The precipitate typically agglomerates, and then is separated from the liquid by sedimentation, centrifugation, or filtration. This video will introduce several methods of separating compounds using precipitation, and demonstrate a procedure in the laboratory.

A dissolved compound can be precipitated out of solution by introducing a counter ion. For example, silver can be precipitated out of solution in the reaction between silver nitrate and sodium chloride. The nitrate ion is replaced by a counter-ion, chloride, resulting in the formation of solid silver chloride.

Increasing the salt concentration of a solution can also induce precipitation. This technique, called salting-out, is common for the isolation of proteins. At high salt concentration, water molecules are more attracted to the dissolved salt, leaving fewer to stabilize the protein. As a result, the protein molecules aggregate and form a solid.

Precipitation can also be caused by a change in pH. At high and low pH, the protein is charged and attracted to the polar solution. At a certain point, the net charge of a compound becomes zero. This is the isoelectric point, or pI. The compound is unable to interact with the polar solution, causing it to aggregate and precipitate.

Temperature also affects solubility, as higher temperature increases the solubility of solids. By decreasing temperature, dissolved compounds can re-solidify. The rate of solid formation determines relative purity.

The following experiments will demonstrate the precipitation of the protein casein from milk using pH, and further separation via filtration and centrifugation methods.

To begin this procedure, add 250 mL of milk into a beaker with a stir bar. Gently warm the milk to 40 °C on a stirring hot plate. Immerse a pH meter into the warm milk, and monitor the pH. Add acetic acid drop-wise to the milk until the pH reaches the casein isoelectric point, 4.6. Insoluble milk proteins, or curds, precipitate out of solution at the isoelectric point. Remove the curds from solution by filtration. If the filter paper gets clogged, mix with a spatula to help the solution flow through. If this does not improve the filtration, change the filter paper. Transfer the wet solid from the clogged filter paper to new filter paper. This should absorb more liquid, or whey, from the solid. Continue changing the filter paper until there is minimal wetness. Pressing lightly on the solids may help the filter paper to absorb more whey.

Re-suspend the dried milk solids in 70% ethanol to wash the phospholipids out of the curds and then repeat the filtration process. As an alternative to filtration, protein solids can also be separated using centrifugation. Centrifuge 50 mL portions of the milk mixture and decant the supernatant. Re-suspend the pellet in 50 mL of 70% ethanol to help remove the phospholipids from the curds, and repeat the centrifugation process.

The milk protein solids can then be stored or re-suspended in another solution for further analysis, such as SDS-PAGE. For more information, see our video on this technique. SDS-PAGE analysis shows that precipitation enabled the removal of most impurities from the whey. All of the casein was found in the pellet, while none was found in the supernatant.

Precipitation is a commonly used technique, which can be applied to separate a variety of mixtures or solutions.

Compounds can be precipitated from a solution using a counter ion, as in this example of the precipitation of calcium carbonate.

Calcium chloride and sodium carbonate are both soluble in the aqueous phase.

When they are mixed, the calcium and carbonate form an insoluble solid, which can be separated with centrifugation. For more information on this topic, see our education video on solubility rules.

Precipitation can be utilized in the preparation of nano-scale solids that are found in a wide range of applications in nanotechnology. In this example, nano-scale seeds were used to control the growth of nano-crystals.

The precursors were heated, reacted with trioctylphosphine selenide, and then rapidly cooled. Methanol was added to the cooled solution, in order to precipitate the solids. The crystals were then recovered by centrifugation, and the crystal structure analyzed with X-ray Diffraction.

Precipitation can also be used in the preparation of polymeric ligands for drug delivery applications. In this example, a ligand is synthesized and conjugated to platinum for use as an anticancer therapy. First, the ligand was synthesized using an amide coupling reaction. It precipitated as the reaction progressed. It was then recovered using filtration.

The solid was then purified using recrystallization, and filtered again. The ligand was then complexed with the platinum compound, dried, and then purified using fractional precipitation from water with acetone. Platinum coupling was confirmed using nuclear magnetic resonance spectroscopy. The compounds could then be studied for their efficacy and side effects as anticancer agents.

You have just watched JoVE’s introduction to the separation of mixtures using precipitation. You should now understand the various methods of precipitation, and how to perform these experiments in the laboratory.

Thanks for watching!

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