Name: 脂滴隔离定量质谱分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学习脂滴分离定量质谱分析方法，用于研究Hepatitis C Virus等病原体复制机制。该技术可在六至七小时内完成，有助于深入理解脂滴在感染性疾病中的关键作用。

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我们感谢海德堡大学的 R. Bartenschlager 提供 Jc1 载体，洛克菲勒大学的 C.M. Rice 提供 Huh7.5 细胞，英国医学研究理事会病毒学分部的 J. McLauchlan 提供 JFH1 载体，日本国立传染病研究所的 T. Wakita 提供 JFH1，以及格拉德斯通病毒学与免疫学研究所的 B. Webster 和 W.C. Greene 提供 HCVcc 报告载体。本研究得到了德国研究基金会（DFG）的资助（项目编号：HE 6889/2-1（EH）、INST 337/15-1 2013 和 INST 337/16-1 2013（HS））。海因里希·佩特研究所——莱布尼茨实验病毒学研究所——由汉堡自由汉萨市和德国联邦卫生部资助。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未参与。

1. 细胞培养中氨基酸稳定同位素标记（SILAC）培养基的制备
注意：此处使用 SILAC 蛋白质定量试剂盒——DMEM 培养基中添加了 50 mg 的 13C6 L-盐酸精氨酸用于 SILAC 标记。透析胎牛血清（FCS）随 SILAC 蛋白质定量试剂盒提供。
<ol>
	<li>从每瓶 DMEM 培养基中移除 50 mL，并加入 50 mL 透析过的 FCS。</li>
	<li>将 50 mg 13C6 L-赖氨酸-2HCl 和 50 mg 13C6 L-精氨酸-HCl 溶解于 1 mL 培养基中。充分混匀后，将氨基酸加入 DMEM + FCS 培养基中。</li>
	<li>添加 1× 青霉素-链霉素溶液和 1× L-谷氨酰胺替代物。使用 0.45 µm 滤器对培养基进行无菌过滤。将该瓶培养基标记为 &#34;heavy&#34; SILAC 培养基。</li>
	<li>制备 &#34;light&#34; 培养基时，使用 50 mg L-精氨酸-HCl 和 50 mg L-赖氨酸-2HCl 重复步骤 1.1–1.3。将该瓶培养基标记为 &#34;light&#34; SILAC 培养基。</li>
</ol>
2. SILAC标记与氨基酸掺入控制
<ol>
	<li>用胰蛋白酶（1× 胰蛋白酶-EDTA）消化细胞，并将 1 × 105 个 Huh7.5 细胞分别接种至 6 孔培养板的 2 个孔中，每孔加入 2 mL 培养基，其中一孔使用含“&#34;heavy&#34;”标记氨基酸的 SILAC 培养基，另一孔使用含“&#34;light&#34;”标记氨基酸的 SILAC 培养基。</li>
	<li>将细胞连续培养至少 6 代（传代比例为 1:6）；经过 6 代培养后，“&#34;heavy&#34;”标记氨基酸的掺入率应超过 95%。</li>
	<li>分别收集 1 × 106 个“&#34;heavy&#34;”和“&#34;light&#34;”标记的细胞群体，用于分析标记掺入效率。用 1× PBS 洗涤细胞，并在 160 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟以收集细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 150 µL 质谱缓冲液（150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl pH 7.4、1 mM EDTA，并添加 1× 蛋白酶抑制剂混合物）中，冰上孵育 30 分钟。在 4 °C 条件下通过超声处理裂解细胞。 
	注意：此处使用的超声参数如下：定时模式，保持；输出控制设为 8；占空比为 80%；进行 2 次，每次 30 个脉冲。</li>
	<li>在 11,000 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟以去除细胞碎片。将上清液转移至新离心管中，并使用兼容去垢剂的蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。</li>
	<li>取 75 µg 蛋白质与 6× 上样缓冲液（375 mM Tris-HCl，pH 6.8，25.8% 甘油，123 mg/mL SDS，600 µg/mL 溴酚蓝，60 µL/mL β-巯基乙醇）混合，在 95 °C 煮沸 5 分钟，随后在 SDS 电泳运行缓冲液（3.02 g/L Tris 碱，18.8 g/L 甘氨酸，1 g/L SDS）中以 180 V 恒压电泳约 1 小时，或按照制造商说明书进行 SDS-PAGE 分离。</li>
	<li>将凝胶转移至胶体考马斯亮蓝染色液中。从每条泳道中切取相同位置的蛋白条带。用胰蛋白酶消化蛋白质，并按照文献22所述方法通过质谱分析检测氨基酸掺入效率。</li>
</ol>
3. SILAC标记的Huh7.5细胞脂滴的分离
<ol>
	<li>感染一组细胞（即&#160;那些标记有 &#34;光&#34; 氨基酸）与HCV报告病毒通过与病毒储备液孵育例如， Jc1NS5AB-mKO2-BSD，于37 °C条件下以MOI 1感染4小时，具体方法如前所述21. 
	注：Jc1NS5AB-mKO2-BSD 是一种携带荧光报告基因（单体Kusabira Orange 2，mKO2）的HCV病毒，用于监测感染率，其后接一个Blasticidin抗性基因（BSD），两者之间为重复的NS5A-NS5B切割位点，此前已有描述21,23. HCV 操作需要在 BSL2+（美国）或 S3**（德国）生物安全级别条件下进行。除 HCV 感染外，细胞也可被其他病原体感染。</li>
	<li>扩增HCV感染 &#34;光&#34; 细胞与非感染细胞 &#34;重&#34; 细胞。在传代培养过程中，用含4%多聚甲醛（PFA）的PBS固定一部分细胞，通过流式细胞术检测荧光标记蛋白以确定HCV感染率。例如， mKO2），如所述21；用于脂滴分离时，感染率应高于90%。注意：&#160;若使用 Jc1NS5AB-mKO2-BSD HCV 毒株，加入 10 µg/mL 杀稻瘟菌素 S &#34;光&#34; 用于筛选HCV阳性细胞的培养基。</li>
	<li>在脂滴分离前1天，用PBS洗涤细胞，胰酶消化，重悬于 &#34;光&#34; 和 &#34;重&#34; 培养基，并使用血细胞计数板对细胞进行计数。接种 7 x 106 每种群体细胞在150 cm²培养瓶中2 细胞培养皿。每项实验至少准备5个培养皿 &#34;光&#34; 和 &#34;重的&#34; 细胞群体。将细胞在每皿30 mL培养基中过夜培养。</li>
	<li>吸除培养基，用1x PBS洗涤细胞。使用细胞刮在1x PBS中刮下细胞。</li>
	<li>使用血细胞计数板对两种细胞群体进行计数，并将等量细胞混合于50 mL离心管中。在160 × g、4 °C条件下离心5分钟，沉淀细胞。</li>
	<li>移除 PBS，将细胞沉淀重悬于 1 mL 蔗糖缓冲液（0.25 M 蔗糖、1 mM EDTA 和 1 mM DTT，加入蛋白酶抑制剂混合物）中。将细胞悬液转移至严密切合的 Dounce 匀浆器中，在冰上进行 200 次研磨以裂解细胞。 
	注意：使用台盼蓝染色确认细胞裂解完全。</li>
	<li>将裂解液转移至1.5 mL离心管中，在4 °C、1,000 x g条件下离心10分钟，沉淀细胞核和细胞碎片。</li>
	<li>离心后，取25 µL上清核后组分（PNS），于-20 °C保存，作为输入对照。</li>
	<li>将剩余的PNS组分置于离心管（11 × 60 mm）底部，并覆盖脂滴洗涤缓冲液（约3 mL；总体积4 mL）（50 mM 磷酸钾缓冲液 pH 7.4，100 mM 氯化钾，1 mM EDTA 和 1 mM 苯甲基磺酰氟）。</li>
	<li>在 100,000 × g、4 °C 条件下离心 2 小时。使用弯头钝针从离心管顶部收集漂浮的脂滴组分（约 250–500 µL，具体体积取决于脂滴量）。将脂滴组分转移至离心管（11 × 60 mm）中，上层覆盖脂滴洗涤缓冲液（约 3.5 mL，总体积 4 mL），重复离心步骤。</li>
	<li>使用弯头钝性套管从管顶部收集漂浮的脂滴组分，并将脂滴转移至新的1.5 mL微量离心管中。加入500 µL脂滴洗涤缓冲液，在4 °C下以21,000 x g离心20分钟。 
	注意：脂滴表现为漂浮在缓冲液上方的白色条带。</li>
	<li>使用加样枪头移除底部的洗涤缓冲液，并重复此洗涤步骤三次。</li>
	<li>使用加样枪头彻底移除洗涤缓冲液后&#160;提示：将5 µL脂滴组分与10 µL NP-40裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl和1% NP-40，加入蛋白酶抑制剂混合物）混合。若处理的是感染性材料，将样品置于冰上孵育1小时以灭活病毒。使用可耐受去污剂的蛋白定量方法测定蛋白浓度；质谱分析至少需要35 µg蛋白。</li>
	<li>将脂滴组分在 -20 °C 下保存。</li>
	<li>将相应体积的脂滴组分与4倍上样染料混合。若处理的是具有感染性的材料，需在冰上孵育1小时以灭活病毒。然后在95 °C下煮沸5分钟。</li>
	<li>使用 SDS-PAGE 按照生产商说明书分离蛋白质。将凝胶转移至胶体考马斯亮蓝染色液中。从凝胶中切下所有蛋白质条带。进行胶内胰蛋白酶消化后24，蒸发样品并用0.1%甲酸溶解，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析。 
	注意：此处的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析在四极杆-飞行时间质谱仪（Q-TOF）或线性离子阱轨道阱（LTQ Orbitrap）质谱仪上进行。两种仪器均通过电喷雾电离源（ESI）与纳米超高效液相色谱（nano-UPLC）系统联用。Q-TOF 和轨道阱质谱仪上的数据分析及 LC-MS/MS 分析均按所述方法进行21,22务必小心避免样本受到人类角蛋白的污染。始终使用无角蛋白的移液器吸头和离心管。在超净工作台内使用无角蛋白的试剂配制缓冲液。使用前，用蒸馏水和乙醇清洁所有表面和设备。操作时必须佩戴手套和实验服。</li>
</ol>
4. 脂滴纯度的分析
<ol>
	<li>用 NP-40 裂解缓冲液将脂滴组分等分试样稀释 1:2，输入组分（见步骤 3.9）稀释 1:10。如果处理的是感染性材料，将样品置于冰上孵育 1 小时以灭活病毒。使用与去垢剂兼容的蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。</li>
	<li>将等量蛋白与 6× 上样缓冲液混合，如果处理的是感染性材料，则将样品置于冰上孵育 1 小时以灭活病毒。随后进行 SDS-PAGE 电泳，并在 80 V 条件下电转 90 分钟，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。 
	注意：将膜在封闭缓冲液（含 5% 脱脂奶粉的 TBS-T 缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.6、150 mM NaCl 和 0.05% Tween20））中封闭后，依次与针对脂滴标志物（e.g.,&#160;PLIN1、PLIN2 或 PLIN3）以及其他亚细胞结构标志物（e.g.,&#160;CALR、MnSOD 或 tubulin）的一抗孵育，再孵育 HRP 偶联的二抗。采用化学发光法检测蛋白信号。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种用于分离脂滴并进行定量脂滴蛋白质组分析的实验方案，以比较不同培养条件下（如病毒感染时）与脂滴相关蛋白的富集与耗竭情况。作为一种替代方法，也可采用基于总峰强度的无标记定量技术进行蛋白质组分析。该方法无动态范围限制，且可避免代谢标记相关的问题。SILAC方法的优势在于，样品在脂滴分离前即被混合，因此结果不受样品制备、酶解及液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）分析过程中操作误差的影响。我们强烈推荐将此方法用于定量脂滴蛋白质组分析。
由于质谱分析中观察到的脂滴相关蛋白的富集或减少可能反映了蛋白表达的诱导或抑制，因此建议通过定量RT-PCR和（优先选择）蛋白质印迹法分析其表达水平。此外，可采用两种方法验证特定蛋白在脂滴中的富集或减少：一是分离脂滴后进行蛋白质印迹分析，二是使用亲脂性染料（如BODIPY或LD540）对脂滴进行染色，并结合免疫荧光分析，具体方法如文献21所述。
进行交换标记条件的实验，以确保使用&#34;重&#34;同位素氨基酸标记不会影响蛋白质表达或脂滴定...

脂滴是高度动态的细胞质（以及细胞核）细胞器，由中性脂质（甘油三酯（TG）和胆固醇酯（CE））核心构成，外层包裹着含有嵌入蛋白的磷脂单分子层。1所有细胞类型均能产生脂滴，但其在大小、脂质组成和表面蛋白修饰方面存在差异。脂滴具有多种功能，包括作为能量和膜前体物质的储存库，或作为蛋白质的沉积场所。此外，通过摄取脂质，脂滴可保护细胞免受脂毒性损伤，释放脂质作为信号分子，并参与蛋白质降解以及内质网（ER）应激反应。2因此，多种蛋白质会结合到脂滴上，调控其生成、降解、转运以及与其他细胞器的相互作用。其中包括脂滴包被蛋白家族（perilipin family） 真正 脂滴结合蛋白（PLIN1-5）3.
脂滴的生成很可能起始于内质网（ER），在内质网中，定位于ER的酶催化中性脂质的合成，这些中性脂质在膜双分子层内积聚，形成中性脂质透镜结构，这一过程最近在酵母中得到了清晰的可视化展示4。随后，膜弯曲以及磷脂酸和二酰甘油水平的升高被认为会招募参与磷脂生物合成的蛋白质，因为核心中性脂质与包被性磷脂的同步合成是脂滴生成所必需的5。这一过程由含有跨膜结构域并定位于内质网的酶催化完成。脂滴进一步扩大为大型脂滴则需要另一类含有两亲性螺旋的脂质合成酶，这类酶能够从内质网转移至脂滴。脂滴中脂质的动员通过局部激活甘油三酯和二酰甘油脂肪酶——脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）和激素敏感性脂肪酶（HSL）——实现，也可通过不同的自噬途径进行，例如大脂噬、微脂噬或分子伴侣介导的自噬6。脂滴与其他细胞器存在相互作用，例如线粒体（用于β-氧化和脂质合成）和内质网（用于脂质合成和蛋白质运输），同时也与溶酶体、内体以及胞内细菌诱导形成的液泡相互作用7。事实上，细菌、病毒甚至寄生虫都会靶向脂滴以实现其复制与持续存在，其中就包括丙型肝炎病毒（HCV）8。
丙型肝炎病毒（HCV）感染是全球肝病相关发病和死亡的主要原因之一，每年约导致50万人死亡9。HCV感染的实际人数尚不明确，但近期估计显示，全球有1.3亿至1.5亿人处于慢性感染状态。目前尚无可用的疫苗，但近年来获批的直接抗病毒药物（direct-acting antivirals）相比传统的干扰素疗法显著提高了治疗应答率。然而，由于这些新药价格极为昂贵，全球范围内患者的治疗可能受到限制。约半数慢性HCV感染者会发展为脂肪肝疾病（脂肪变性），其特征是肝细胞内脂滴过度积聚。引人注目的是，脂滴也被发现是HCV复制所必需的重要细胞器，可能作为病毒组装的场所10,11。
在HCV感染的细胞中，病毒蛋白core和NS5A会定位于脂滴，该过程依赖于甘油三酯的生物合成；二酰甘油酰基转移酶1（DGAT1）抑制剂可阻碍病毒蛋白向脂滴的转运及后续HCV颗粒的产生12,13,14,15此外，核心蛋白或NS5A的脂滴结合结构域中的突变会抑制HCV的组装16,17核心蛋白和NS5A随后将所有其他病毒蛋白以及病毒RNA复制复合物募集到与脂滴密切相关的膜结构上16所有病毒蛋白的协同作用对于成功产生具有感染性的子代病毒至关重要10,11结构蛋白是病毒颗粒的组成部分，而非结构蛋白则促进此过程所需的蛋白质-蛋白质相互作用。有趣的是， 真正有效的 脂滴结合蛋白PLIN3/TIP47对丙型肝炎病毒RNA复制及病毒颗粒释放均是必需的18,19,20尽管近期取得了一些进展，但丙型肝炎病毒复制晚期阶段病毒与宿主相互作用的机制细节仍不明确，脂滴的确切功能亦不清楚。
本文介绍了一种用于相关蛋白定量质谱分析的脂滴分离方法。利用该方法，我们发现丙型肝炎病毒（HCV）感染期间脂滴蛋白质组发生显著变化，并鉴定出膜联蛋白A3是一种与脂滴共分离的宿主蛋白，对HCV的有效成熟至关重要21。

<table><tbody><tr><td>SILAC 蛋白质定量试剂盒 - DMEM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>89983&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt; L-精氨酸盐酸盐 50&amp;nbsp;mg</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>88210</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Load 1</td><td>Roth GmbH</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Blue 5x 浓缩液</td><td>Roth GmbH</td><td>A152.2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10x SDS-Tris-甘氨酸缓冲液</td><td>Geyer Th. GmbH &amp;amp; Co.KG&amp;nbsp;</td><td>A1415,0250&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX（100倍浓缩液）</td><td>Life Technologies GmbH&amp;nbsp;</td><td>350500038&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养用青霉素/链霉素溶液</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&amp;nbsp;</td><td>P4333-100ml&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1x 消息氏磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&amp;nbsp;</td><td>D8537&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&amp;nbsp;</td><td>T3924-100ML&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 &lt;em&gt;生物化学&lt;/em&gt;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1149,1000</td><td></td></tr><tr><td>Tris 超纯&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1086,5000A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EDTA &lt;em&gt;BioChemica&lt;/em&gt;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1103,0250</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物 5 mL</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&amp;nbsp;</td><td>P8340-5ML&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-蔗糖 &lt;em&gt;BioChemica&lt;/em&gt;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3935,1000</td><td></td></tr><tr><td>盐酸（HCl）37% 纯度，Ph. Eur.，NF</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A0625</td><td></td></tr><tr><td>DC 蛋白测定&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratoris GmbH&amp;nbsp;</td><td>500-0116&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>AppliChem GmbH</td><td>151339</td><td></td></tr><tr><td>SDS 超纯</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1112</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A2331</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;β-巯基乙醇&amp;nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4338</td><td></td></tr><tr><td>杀稻瘟菌素</td><td>Invivogen</td><td>ant-bl-1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾&amp;nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1039</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟&amp;nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A0999</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&amp;nbsp;</td><td>221309</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&amp;nbsp;</td><td>P3786&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DTT&amp;nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A2948</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>AppliChem</td><td>A1694</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>AppliChem</td><td>A4974</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>AppliChem</td><td>A0830</td><td></td></tr><tr><td>抗ADFP/ADRP&amp;nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab52355</td><td></td></tr><tr><td>M6PRB1/TIP47 100 &amp;micro;g</td><td>abcam</td><td>ab47639</td><td></td></tr><tr><td>钙网蛋白，多克隆抗体 200 &amp;micro;g</td><td>Enzo Life Science GmbH&amp;nbsp;</td><td>ADI-SPA-600-F&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>抗-&amp;beta;-微管蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&amp;nbsp;</td><td>T6074 200&amp;micro;l &amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（绝对）（EtOH）</td><td>Geyer Th. GmbH &amp;amp; Co.KG&amp;nbsp;</td><td>A3678,0250 &amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>抗MnSOD</td><td>Enzo Life Science GmbH&amp;nbsp;</td><td>ADI-SOD-110-F</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 HRP</td><td>赛默飞世尔科技皮尔斯</td><td>32430</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 HRP</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp; 皮尔斯</td><td>32460</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hyperfilm ECL</td><td>GE Healthcare</td><td>28906836</td><td></td></tr><tr><td>Lumi-Light 蛋白质印迹底物</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&amp;nbsp;</td><td>12015196001</td><td></td></tr><tr><td>96孔细胞培养板</td><td>Greiner Bio-One GmbH&amp;nbsp;</td><td>655 180&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Terumo 注射器 1 mL</td><td>泰尔茂</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur BT 50，500 mL，0.45 &amp;micro;m&amp;nbsp;</td><td>SARSTEDT&amp;nbsp;</td><td>83.1823.100&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX 预制胶，任意kD分离胶</td><td>Bio-Rad Laboratoris GmbH&amp;nbsp;</td><td>456-9034&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>6孔细胞培养板</td><td>Greiner Bio-One GmbH&amp;nbsp;</td><td>657160&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon 培养皿 150/20&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific GmbH&amp;nbsp;</td><td>10098720 - 168381&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>neoLab Migge GmbH&amp;nbsp;</td><td>C-8120&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Greiner Bio-One GmbH&amp;nbsp;</td><td>227261&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal 管，无 RNase&amp;nbsp;</td><td>SARSTEDT&amp;nbsp;</td><td>72.706.400&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>超透明离心管 11 x 60 mm</td><td>贝克曼库尔特有限公司&amp;nbsp;</td><td>344062&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>吸液针</td><td>Transcodent</td><td>6482</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere Fil. Tip 1000&amp;nbsp;</td><td>SARSTEDT&amp;nbsp;</td><td>70.762.211&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere Fil. Tip 200</td><td>SARSTEDT&amp;nbsp;</td><td>70.760.211&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere Fil. Tip 10</td><td>SARSTEDT&amp;nbsp;</td><td>70.1130.210&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dounce 组织研磨器</td><td>Fisher Scientific GmbH&amp;nbsp;</td><td>11883722</td><td></td></tr><tr><td>Dounce 全玻璃组织研磨器用研杵</td><td>Fisher Scientific GmbH&amp;nbsp;</td><td>10389444</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Branson 超声破碎仪 450</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer comfort，配备 Thermoblock 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>5355&amp;nbsp;000.127</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra 电泳槽、Mini Trans-Blot 转印模块和 PowerPac Basic 电源供应器，&amp;nbsp;</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>165-8033</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 3 多用制胶室</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>165-4110</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC 电源供应器</td><td>伯乐（Biorad）</td><td>164-5052</td><td></td></tr><tr><td>离心&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>离心&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K</td><td>Beckman Coulter GmbH&amp;nbsp;</td><td>365670</td><td></td></tr><tr><td>SW 60 Ti 转子</td><td>Beckman Coulter GmbH&amp;nbsp;</td><td>335649</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M1000 PRO</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

脂滴分离用于定量质谱分析

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

脂滴对多种病原体的复制至关重要，其中最显著的是丙型肝炎病毒（HCV），因其被认为是病毒颗粒形态发生的潜在位点。通过定量脂滴蛋白质组分析，可鉴定在病毒感染等条件下定位于脂滴或从脂滴上移位的蛋白质。本文描述了一种已成功用于表征HCV感染后脂滴蛋白质组变化的实验方案。我们采用细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记技术（SILAC），从而对一个细胞群体的完整蛋白质组进行标记 &#34;重&#34; 氨基酸，通过质谱法对蛋白质进行定量。对于脂滴分离，两种细胞群体（即&#160;HCV 感染的/&#34;光&#34; 氨基酸和未感染对照/&#34;重&#34; 氨基酸）以1:1比例混合，并在低渗缓冲液中进行机械裂解。通过低速离心去除细胞核和细胞碎片后，利用两次连续的超速离心步骤富集脂滴相关蛋白，随后在等渗缓冲液中洗涤三次。通过针对不同亚细胞结构的抗体进行蛋白质印迹（Western blotting）分析，评估脂滴组分的纯度。脂滴相关蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，使用考马斯亮蓝染色。经胰蛋白酶消化后，采用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）对肽段进行定量分析。利用该方法，我们鉴定了丙型肝炎病毒（HCV）感染后招募至脂滴的蛋白质，这些蛋白质可能代表促病毒或抗病毒的宿主因子。本方法可广泛应用于多种不同细胞类型及培养条件，例如病原体感染、环境应激或药物处理等情境。

脂滴在丙型肝炎病毒（HCV）感染中至关重要，被认为是病毒颗粒组装的潜在位点，但病毒颗粒形态发生与释放的分子机制在很大程度上仍不清楚。为了鉴定参与该过程的新型宿主依赖因子，我们对HCV感染细胞进行了定量脂滴蛋白质组分析21 (图1A）。我们建立了一种纯化脂滴的实验方案，常规检测到脂滴结合蛋白PLIN2/ADRP和PLIN3/TIP47显著富集，而其他细胞区室的标志物则明显减少，例如微管标志物β-tubulin、线粒体标志物MnSOD以及内质网标志物calreticulin/calnexin（图1B、C）。我们整理了一份在Huh7.5细胞中稳定与脂滴共分离的蛋白质列表（图1D）并利用同位素标记，鉴定了在丙型肝炎病毒（HCV）感染细胞中被特异性招募至脂滴或从脂滴上被置换的蛋白质（图1E我们的结果表明，丙型肝炎病毒（HCV）使脂滴脱离其正常的代谢功能和/或调控，并鉴定了潜在的宿主依赖因子和限制因子。...

脂滴是多种病原体复制的重要细胞器，包括丙型肝炎病毒（HCV）。本文描述了一种用于分离脂滴并对其相关蛋白进行定量质谱分析的方法；该方法可用于多种实验条件，如病毒感染、环境应激或药物处理。

脂滴对多种不同病原体的复制至关重要，其中最显著的是丙型肝炎病毒（HCV），因其被认为是病毒复制的可能位点……

分离脂滴用于定量质谱分析的总体目标是理解这些细胞器的功能，例如在丙型肝炎病毒等病原体复制过程中的作用。该方法可以回答传染病领域中的关键问题，例如病原体为何依赖脂滴进行复制。脂滴的分离可在六到七小时内完成。在此操作过程中，避免角蛋白污染非常重要。首先，从每瓶DMEM培养基中取出50毫升，并加入50毫升透析过的胎牛血清。接下来，将50毫克碳13标记的赖氨酸和50毫克碳13标记的精氨酸溶解于1毫升培养基中。充分混匀后，将氨基酸加入含FCS的DMEM培养基中。随后加入青霉素-链霉素溶液和谷氨酰胺替代物。使用0.45微米滤器对培养基进行无菌过滤，并将瓶身标记为重同位素标记SILAC培养基。制备轻链培养基时，使用50毫克精氨酸和50毫克赖氨酸重复上述步骤。将瓶子标记为轻链SILAC培养基。用胰蛋白酶消化细胞，并将其分种到六孔培养板的两个孔中。一个孔中应加入两毫升重链SILAC培养基，另一个孔中加入两毫升轻链SILAC培养基。细胞至少培养六代。六代培养后，重链氨基酸的掺入率应超过95%。收集一百万个重链和轻链标记的细胞群体，用于分析掺入效率。用1× PBS洗涤细胞后，在4°C条件下以160 × g离心5分钟，收集细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于150 µL MS缓冲液中。接着将细胞置于冰上孵育30分钟。然后，在 4°C 下通过超声处理裂解细胞。在 4°C、11,000 × g 条件下离心 10 分钟，去除细胞碎片。将上清液转移至新离心管中，并使用与去垢剂兼容的蛋白质检测试剂盒测定蛋白质浓度。然后，将75微克蛋白质与六倍上样缓冲液混合。在95摄氏度下煮沸5分钟后，使用SDS电泳缓冲液在180伏电压下进行SDS-PAGE电泳分离，时间约为1小时。经考马斯亮蓝染色后，切下相同的蛋白质条带，通过质谱分析检测其掺入效率。通过将轻密度细胞群与纤维状病毒原液在37摄氏度下孵育4小时，感染丙型肝炎报告病毒。按照文本方案所述，扩增HCV感染的轻密度细胞和未感染的重密度细胞。如果使用的HCV毒株携带杀稻瘟菌素抗性基因，则在轻密度培养基中加入10微克/毫升的杀稻瘟菌素S，以筛选HCV阳性细胞。在进行脂滴分离前一天，用 PBS 洗涤细胞，胰酶消化后重悬于相应的轻密度或重密度培养基中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。随后，将每种细胞群体各七百万个细胞接种至 150 平方厘米的细胞培养皿中。为每种轻、重细胞群体至少准备五个培养皿。每皿中加入30毫升培养基，将细胞在其中培养过夜。次日，弃去培养基，用1X PBS洗涤细胞。使用细胞刮刀在1X PBS中解离细胞。按照之前的方法对两种细胞群体进行计数后，将相同数量的细胞转移至50毫升离心管中。在4°C、160 ×g条件下离心5分钟，使细胞沉淀。吸除 PBS，将细胞沉淀重悬于 1 毫升蔗糖缓冲液中。将细胞悬液转移至严丝合缝的 Ounce 匀浆器中，在冰上进行 200 次匀浆以裂解细胞。然后将裂解液转移至 1.5 毫升微量离心管中，在 4°C、1,000 × g 条件下离心 10 分钟，沉淀细胞核和细胞碎片。离心后，取25 µL上清核后组分（即PNS），于-20 °C保存，作为输入对照。将剩余的PNS组分置于离心管底部，并覆盖约3 mL脂滴洗涤缓冲液。在4 °C条件下，以100,000 ×g离心2小时。离心后，使用弯头钝性套管从管顶部收集漂浮的脂滴组分。然后将脂滴组分转移至离心管中，覆盖脂滴洗涤缓冲液，并重复离心步骤。从梯度顶部收集脂滴需要一定的操作经验。并且分离的难易程度与脂滴的大小成正比，脂滴越大越容易分离。可使用脂肪细胞进行练习，或通过油酸（oleate）处理细胞以增加脂滴含量。再次使用弯头钝性套管从管子顶部收集漂浮的脂滴组分。将脂滴转移至新的1.5毫升微量离心管中，并加入500微升脂滴洗涤缓冲液。然后，在4°C条件下，以21,000 × g离心20分钟。使用加样枪头移除底层洗涤缓冲液，并重复洗涤步骤三次。最后一次移除洗涤缓冲液后，将5 µL脂滴组分与10 µL NP-40裂解缓冲液混合，用于测定蛋白含量。若操作具有感染性的材料，将样品置于冰上孵育1小时以灭活病毒。此时，脂滴组分可在零下20摄氏度保存。接下来，取相当于至少35微克蛋白的体积，与4倍上样缓冲液混合。如果操作的是感染性材料，需将混合物置于冰上孵育1小时，以灭活病毒。将样品在 95 摄氏度下煮沸 5 分钟。然后，进行 SDS-PAGE 电泳并用考马斯亮蓝染色，以制备用于液相色谱串联质谱分析的样品，具体步骤如文本方案所述。为分析脂滴纯度，用 NP-40 裂解缓冲液稀释脂滴组分的一至两份等分试样。用相同的缓冲液将输入对照组分一至十分别稀释。如果操作的是感染性材料，将样品置于冰上孵育一小时以灭活病毒。接下来，使用与去污剂兼容的蛋白质检测试定蛋白质浓度。然后，将等量蛋白质与6x上样缓冲液混合，若处理的是感染性材料，则将样品置于冰上孵育1小时以灭活病毒。最后进行SDS-PAGE电泳，并通过湿转法在80伏电压下电转90分钟，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。图中展示的是核后组分和脂滴组分的代表性Western印迹分析结果。Western 印迹清晰地显示了脂滴标志物蛋白 perilipin 2 和 perilipin 3 在脂滴组分中的富集，以及其他细胞区室标志物的耗竭。核上清和脂滴组分可通过考马斯亮蓝和银染进行进一步分析。该热图展示了在分析细胞的脂滴组分中鉴定出的蛋白质的肽段数量及蛋白质覆盖度百分比。最终的热图展示了丙型肝炎病毒（HCV）感染如何改变脂滴的每日变化。与脂滴相关且富集的蛋白质以红色表示，与脂滴相关且减少的蛋白质以蓝色表示。该方法的主要优势在于，我们在细胞分离和脂滴分离之前即对细胞进行混合，从而能够最大限度地减少细胞裂解以及分离步骤中可能产生的误差。

lipid-droplet-isolation-for-quantitative-mass-spectrometry-analysis

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

脂滴隔离定量质谱分析

我们介绍一种新的定量脂质组学方法，利用全扫描电喷雾电离质谱法（ESI/MS）鉴定酵母中的多种脂质种类。该方法在分辨各类脂质分子形式的能力、灵敏度和检测速度方面均优于目前可用的脂质鉴定与定量方法。...

利用电喷雾电离质谱法对酵母脂质组进行定量分析

本方案将演示从细胞中提取和分析游离及酯化生物活性脂肪酸的方法。采用稳定同位素稀释法、手性液相色谱-电子捕获大气压化学电离多反应监测质谱法（SID-LC-ECAPCI-MRM/MS）对脂肪酸进行准确定量。...

细胞脂质提取用于靶向稳定同位素稀释液相色谱-质谱分析

分离和表征革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）的脂质A区域，有助于深入了解基于细胞表面的抗生素耐药机制、细菌存活与适应性，以及化学结构多样的脂质A分子如何差异性地调节宿主先天免疫反应。...

革兰氏阴性菌脂质A的分离与化学表征

介绍了两种分离细胞脂滴的方法，分别来自1）酵母细胞和2）人胎盘。这两种方法的核心步骤均为密度梯度离心，其中含有脂滴的上浮层可通过肉眼清晰观察，随后可被提取，并通过蛋白质印迹分析检测其纯度。...

从酵母细胞和人胎盘中分离细胞脂滴：两种纯化技术

本文介绍了一种利用多反应监测和串联质谱/三级质谱模式分别对每种鞘磷脂组分进行定量和定性分析的实验方案。...

利用两种稳定同位素标记的鞘磷脂物种通过液相色谱-质谱法测定鞘磷脂的定量与定性方法

本方案建立了一种利用已成熟的小鼠内质网分离试剂盒，从小鼠肝脏中分离和纯化脂滴的新方法。...

使用成熟细胞器分离试剂盒快速分离脂滴的实验方案

该方法为研究复杂宿主来源中外源性脂肪酸掺入细菌膜（特别是Staphylococcus...

从鸡蛋蛋黄中分离脂蛋白颗粒以研究细菌病原体脂肪酸向膜磷脂的掺入

啮齿类动物组织的 shotgun 脂质组学

本研究建立了一种利用高效液相色谱结合蒸发光散射检测器（ELSD）对脂质纳米颗粒（LNP）RNA递送系统中四种组分进行定量分析的方法。该方法具有良好的分离效果、高灵敏度和高效率。...

通过液相色谱结合蒸发光散射检测器测定脂质纳米颗粒RNA递送系统中的四种组分

本方案描述了一种独特的临床方案，采用酚红线法采集人泪液样本，并结合基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的工作流程，用于发现泪液脂质组学特征。该简单的甲基叔丁基醚（MTBE）/甲醇双相分离方法可实现快速泪液脂质提取，具有高回收率，适用于泪液生物标志物的发现。...

基于酚红棉线采样法用于生物标志物发现中非靶向泪液脂质组学研究

学习脂滴分离定量质谱分析方法，用于研究Hepatitis C Virus等病原体复制机制。该技术可在六至七小时内完成，有助于深入理解脂滴在感染性疾病中的关键作用。

脂滴分离用于定量质谱分析

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