脂滴分离用于定量质谱分析

分离脂滴用于定量质谱分析的总体目标是理解这些细胞器的功能，例如在丙型肝炎病毒等病原体复制过程中的作用。该方法可以回答传染病领域中的关键问题，例如病原体为何依赖脂滴进行复制。脂滴的分离可在六到七小时内完成。

在此操作过程中，避免角蛋白污染非常重要。首先，从每瓶DMEM培养基中取出50毫升，并加入50毫升透析过的胎牛血清。接下来，将50毫克碳13标记的赖氨酸和50毫克碳13标记的精氨酸溶解于1毫升培养基中。

充分混匀后，将氨基酸加入含FCS的DMEM培养基中。随后加入青霉素-链霉素溶液和谷氨酰胺替代物。使用0.45微米滤器对培养基进行无菌过滤，并将瓶身标记为重同位素标记SILAC培养基。

制备轻链培养基时，使用50毫克精氨酸和50毫克赖氨酸重复上述步骤。将瓶子标记为轻链SILAC培养基。用胰蛋白酶消化细胞，并将其分种到六孔培养板的两个孔中。

一个孔中应加入两毫升重链SILAC培养基，另一个孔中加入两毫升轻链SILAC培养基。细胞至少培养六代。六代培养后，重链氨基酸的掺入率应超过95%。收集一百万个重链和轻链标记的细胞群体，用于分析掺入效率。

用1× PBS洗涤细胞后，在4°C条件下以160 × g离心5分钟，收集细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于150 µL MS缓冲液中。接着将细胞置于冰上孵育30分钟。

然后，在 4°C 下通过超声处理裂解细胞。在 4°C、11,000 × g 条件下离心 10 分钟，去除细胞碎片。将上清液转移至新离心管中，并使用与去垢剂兼容的蛋白质检测试剂盒测定蛋白质浓度。

然后，将75微克蛋白质与六倍上样缓冲液混合。在95摄氏度下煮沸5分钟后，使用SDS电泳缓冲液在180伏电压下进行SDS-PAGE电泳分离，时间约为1小时。经考马斯亮蓝染色后，切下相同的蛋白质条带，通过质谱分析检测其掺入效率。

通过将轻密度细胞群与纤维状病毒原液在37摄氏度下孵育4小时，感染丙型肝炎报告病毒。按照文本方案所述，扩增HCV感染的轻密度细胞和未感染的重密度细胞。如果使用的HCV毒株携带杀稻瘟菌素抗性基因，则在轻密度培养基中加入10微克/毫升的杀稻瘟菌素S，以筛选HCV阳性细胞。

在进行脂滴分离前一天，用 PBS 洗涤细胞，胰酶消化后重悬于相应的轻密度或重密度培养基中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。随后，将每种细胞群体各七百万个细胞接种至 150 平方厘米的细胞培养皿中。

为每种轻、重细胞群体至少准备五个培养皿。每皿中加入30毫升培养基，将细胞在其中培养过夜。次日，弃去培养基，用1X PBS洗涤细胞。

使用细胞刮刀在1X PBS中解离细胞。按照之前的方法对两种细胞群体进行计数后，将相同数量的细胞转移至50毫升离心管中。在4°C、160 ×g条件下离心5分钟，使细胞沉淀。

吸除 PBS，将细胞沉淀重悬于 1 毫升蔗糖缓冲液中。将细胞悬液转移至严丝合缝的 Ounce 匀浆器中，在冰上进行 200 次匀浆以裂解细胞。然后将裂解液转移至 1.5 毫升微量离心管中，在 4°C、1,000 × g 条件下离心 10 分钟，沉淀细胞核和细胞碎片。

离心后，取25 µL上清核后组分（即PNS），于-20 °C保存，作为输入对照。将剩余的PNS组分置于离心管底部，并覆盖约3 mL脂滴洗涤缓冲液。在4 °C条件下，以100,000 ×g离心2小时。

离心后，使用弯头钝性套管从管顶部收集漂浮的脂滴组分。然后将脂滴组分转移至离心管中，覆盖脂滴洗涤缓冲液，并重复离心步骤。从梯度顶部收集脂滴需要一定的操作经验。

并且分离的难易程度与脂滴的大小成正比，脂滴越大越容易分离。可使用脂肪细胞进行练习，或通过油酸（oleate）处理细胞以增加脂滴含量。

再次使用弯头钝性套管从管子顶部收集漂浮的脂滴组分。将脂滴转移至新的1.5毫升微量离心管中，并加入500微升脂滴洗涤缓冲液。然后，在4°C条件下，以21,000 × g离心20分钟。

使用加样枪头移除底层洗涤缓冲液，并重复洗涤步骤三次。最后一次移除洗涤缓冲液后，将5 µL脂滴组分与10 µL NP-40裂解缓冲液混合，用于测定蛋白含量。若操作具有感染性的材料，将样品置于冰上孵育1小时以灭活病毒。

此时，脂滴组分可在零下20摄氏度保存。接下来，取相当于至少35微克蛋白的体积，与4倍上样缓冲液混合。如果操作的是感染性材料，需将混合物置于冰上孵育1小时，以灭活病毒。

将样品在 95 摄氏度下煮沸 5 分钟。然后，进行 SDS-PAGE 电泳并用考马斯亮蓝染色，以制备用于液相色谱串联质谱分析的样品，具体步骤如文本方案所述。为分析脂滴纯度，用 NP-40 裂解缓冲液稀释脂滴组分的一至两份等分试样。

用相同的缓冲液将输入对照组分一至十分别稀释。如果操作的是感染性材料，将样品置于冰上孵育一小时以灭活病毒。接下来，使用与去污剂兼容的蛋白质检测试定蛋白质浓度。

然后，将等量蛋白质与6x上样缓冲液混合，若处理的是感染性材料，则将样品置于冰上孵育1小时以灭活病毒。最后进行SDS-PAGE电泳，并通过湿转法在80伏电压下电转90分钟，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。图中展示的是核后组分和脂滴组分的代表性Western印迹分析结果。

Western 印迹清晰地显示了脂滴标志物蛋白 perilipin 2 和 perilipin 3 在脂滴组分中的富集，以及其他细胞区室标志物的耗竭。核上清和脂滴组分可通过考马斯亮蓝和银染进行进一步分析。该热图展示了在分析细胞的脂滴组分中鉴定出的蛋白质的肽段数量及蛋白质覆盖度百分比。

最终的热图展示了丙型肝炎病毒（HCV）感染如何改变脂滴的每日变化。与脂滴相关且富集的蛋白质以红色表示，与脂滴相关且减少的蛋白质以蓝色表示。该方法的主要优势在于，我们在细胞分离和脂滴分离之前即对细胞进行混合，从而能够最大限度地减少细胞裂解以及分离步骤中可能产生的误差。