Name: 用荧光PCR毛细管电泳技术在基因型CRISPR / Cas9介导的敲除突变体的高通量形式 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 学习使用荧光PCR结合毛细管凝胶电泳技术对CRISPR/Cas9诱导的基因敲除突变体进行高通量基因分型。该方法适用于人类、干细胞及非人类细胞，为遗传学和癌症生物学研究提供经济高效的解决方案。

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作者谨此感谢谭诗敏女士、翁海伦女士和赵毅博士在毛细管凝胶电泳实验中提供的帮助。本研究得到了新加坡国家医学研究委员会独立研究者基金（NMRC/IRG）项目编号NMRC/1314/2011以及新加坡教育部学术研究基金第二层次基金（MOE AcRF Tier 2 Fund）项目编号MOE2011-T2-1-051的资助。

1. 获得CRISPR/Cas9靶向的单细胞克隆
<ol>
	<li>在6孔板中接种HEPG2细胞，每孔500,000个细胞，加入2 mL不含抗生素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），并添加10%胎牛血清（FBS）。于37 °C、5% CO₂条件下培养24小时。2.</li>
	<li>使用适当的转染试剂，按照制造商说明书将共表达Cas9和针对目的基因的特异性sgRNA的质粒转染至细胞中。 
	注意：例如，sgRNA 可按照先前所述方法克隆至 pSpCas9(BB)-2A-GFP 载体中4.</li>
	<li>转染后4至16小时，用2 mL新鲜的无抗生素培养基更换培养液。</li>
	<li>转染约48小时后，用胰蛋白酶消化细胞，收集单细胞悬液。
	<ol>
		<li>用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液0.2 mL消化细胞，37 °C孵育5 min。加入1 mL培养基，充分重悬。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据之前所述方法对细胞进行分选，以获得GFP阳性克隆12，收集约 3,500 个细胞。</li>
	<li>将GFP阳性分选细胞以每皿500、1,000和2,000个细胞的密度接种于10 cm培养皿中，每皿加入8 mL含青霉素/链霉素的培养基。于37 °C、5% CO₂条件下培养细胞2.</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养2每隔五天更换一次培养基，直至细胞生长为肉眼可见的单细胞克隆。对于大多数癌细胞系而言，从接种之日起大约需要两周时间。</li>
	<li>当菌落达到适当大小时（即， 肉眼可见后，将单个菌落转移至含有200 µL添加10%胎牛血清的DMEM的96孔细胞培养板的孔中。
	<ol>
		<li>使用200 µL移液器吸取单细胞克隆，并保留少量培养基。通过反复吹打，将各孔中的细胞充分重悬。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养2每隔五天更换一次培养基，直至细胞融合度达到50%–90%。对于大多数癌细胞系，此过程约需24–48小时。</li>
</ol>
2. 使用直接裂解法提取粗制基因组DNA
<ol>
	<li>当细胞达到50 - 90%融合度时，使用多通道真空抽吸装置或多通道移液器尽可能吸除孔中的培养基。</li>
	<li>向每孔中加入25 µL含0.05%胰蛋白酶-EDTA（不含酚红）的溶液，在37 °C下孵育7分钟。</li>
	<li>通过反复吹打数次充分重悬胰蛋白酶消化后的细胞。在显微镜下观察细胞，确认其已从塑料表面脱离。</li>
	<li>通过将约5 µL单细胞悬液转移至新的空96孔培养板中，建立单克隆的复制培养。向每孔中加入200 µL培养基，并继续培养细胞，直至通过荧光PCR-毛细管凝胶电泳鉴定出阳性克隆（见下文）。随后将细胞逐级扩增至10 cm培养皿或其他合适规模（见第7节）。</li>
	<li>在96孔PCR板中，将步骤2.3中的5 µL单细胞悬液加入10 µL自制直接裂解缓冲液（10 mM Tris pH 8.0、2.5 mM EDTA、0.2 M NaCl、0.15% SDS和0.3% Tween-20）中12，并通过反复吹打数次充分混匀。短暂离心（使液体沉降至孔底）。</li>
	<li>向步骤2.3剩余的约15 µL细胞悬液中加入200 µL培养基，并与步骤2.4中的复制培养物一同在37 °C、5% CO2条件下孵育。</li>
	<li>将步骤2.5获得的裂解物进行如下热循环程序处理，以确保细胞完全裂解并释放基因组DNA：65 °C 30秒，8 °C 30秒，65 °C 1.5分钟，97 °C 3分钟，8 °C 1分钟，65 °C 3分钟，97 °C 1分钟，65 °C 1分钟，80 °C 10分钟。处理后短暂离心裂解物。</li>
	<li>向裂解物中加入40 µL无核酸酶水进行稀释，并使用涡旋振荡器充分混匀。短暂离心。稀释后的裂解物可立即使用，或在-20 °C保存数月而不显著影响质量。</li>
</ol>
3. 进行荧光PCR以扩增CRISPR/Cas9靶向区域
<ol>
	<li>为每个 CRISPR/Cas9 靶区域设计两条在 5' 端标记荧光团的正向引物；若切割位点之间的距离超过 300 bp，则应将其视为两个独立的靶区域（例如，未靶向的野生型对照使用绿色荧光团标记的引物，CRISPR/Cas9 靶向克隆使用蓝色荧光团标记的引物；参见材料表）。
	<ol>
		<li>根据设计获取这些标记的正向引物和未标记的反向引物。请注意，引物可使用任意选择的工具进行设计，扩增子长度应为 200–500 bp。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照先前所述方法12，使用标记引物进行 PCR 以扩增靶区域。
	<ol>
		<li>在 20 µL 反应体系中加入步骤 2.8 中稀释后的裂解液 3 µL（参见表 1），并采用以下热循环程序：94 °C 预变性 10 min（1 个循环）；94 °C 变性 10 s，64 °C 退火 30 s，68 °C 延伸 1 min（4 个循环）；94 °C 变性 10 s，61 °C 退火 30 s，68 °C 延伸 1 min（4 个循环）；94 °C 变性 10 s，58 °C 退火 30 s，68 °C 延伸 1 min（4 个循环）；94 °C 变性 10 s，55 °C 退火 30 s，68 °C 延伸 1 min（35 个循环）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取 5 µL PCR 扩增产物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，以检测扩增片段的大小及相对含量12。 
	注意：建议对所有样本执行此步骤，但非必需；仅检测部分代表性样本已足以大致评估各样本中扩增产物的量。</li>
</ol>
4. 毛细管凝胶电泳样品的制备
<ol>
	<li>将野生型（未靶向的亲本细胞）和CRISPR/Cas9靶向DNA的扩增子用无核酸酶水稀释至约2.5 ng/µL。确保野生型DNA样本的稀释量足够用于添加至每个靶向DNA样本中（每个靶向样本至少需要加入0.5 µL稀释后的野生型样本）。</li>
	<li>将稀释后的野生型和靶向DNA样本等比例混合（例如， 将1 µL野生型样品与1 µL靶向样品混合。</li>
	<li>在适用于遗传分析仪的96孔PCR板中，加入1 µL混合扩增子、8.7 µL去离子甲酰胺和0.3 µL荧光标记的大小标准品。 
	注意：使用甲酰胺和大小标准品的预混液（master mix）的形式（即， 建议在添加扩增子之前，先将甲酰胺与大小标准品按29:1的比例预先混合，以确保用量标准化。</li>
	<li>用PCR仪将样品在95 °C下加热3分钟，并确保板子密封严密。</li>
	<li>加热步骤后立即将培养板置于冰上，孵育至少3分钟。</li>
</ol>
5. 在基因分析仪上进行毛细管凝胶电泳
<ol>
	<li>在连接至基因分析仪的毛细管凝胶电泳软件中设置检测参数、仪器程序和片段大小命名规则。 
	注意：此步骤仅在首次电泳运行时需要；程序可保存以供后续使用。对于后续运行，直接进入步骤 5.2。
	<ol>
		<li>点击 &#34;创建新培养板&#34; 软件仪表板上的图标</li>
		<li>为运行指定一个临时名称，并选择以下选项：孔数，96；板类型，Fragment；毛细管长度，50 cm；聚合物，POP7。点击 &#34;分配孔板内容&#34; 按钮</li>
		<li>下 &#34;检测方法&#34; 点击 &#34;创建新检测方法&#34;；将出现一个新面板。</li>
		<li>命名该检测方法 &#34;FPCR-CGE 检测&#34; 并检查 &#34;应用类型&#34; 正确设置为 &#34;片段。&#34;</li>
		<li>通过点击来设置仪器程序 &#34;新建&#34; 按钮下方 &#34;仪器操作规程&#34;
		<ol>
			<li>在相应区域设置或选择以下选项和参数：应用类型，片段分析；毛细管长度，50 cm；聚合物，POP7；染料组合，G5；运行模块，FragmentAnalysis；协议名称，FPCR-CGE仪器协议； oven温度，60 °C；运行电压，19.5 kV；预运行电压，15 kV；进样电压，1.6 kV；运行时间，1,330 s；预运行时间，180 s；进样时间，15 s；数据延迟，1 s。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>点击 &#34;应用于检测&#34; 按钮，然后 &#34;保存到库&#34; 单击按钮以保存程序。关闭面板以继续。</li>
		<li>通过点击来设置一个片段大小分析方案 &#34;新建&#34; 按钮下方 &#34;大小标记分析方案&#34;
		<ol>
			<li>在相应区域设置或选择以下选项和参数：方案名称，FPCR-CGE 片段大小分析方案；片段大小标准，GS500(-250)LIZ；片段分析软件，SizeCaller v1.1.0；分析设置，-；分析范围，全范围；定尺范围，全范围；片段大小判定方法，局部 Southern 法；引物峰，存在；蓝色、绿色、橙色通道，（勾选）；最小峰高，所有通道均为 175；使用平滑处理，无；使用基线校正（基线窗口（点）），（勾选）51；最小峰半高宽，2；峰检测窗口大小，15；多项式阶数，3；峰起始斜率阈值，0.0；峰结束斜率阈值，0.0；质控设置，-；大小质量，-；若数值为 &#60;0.25；若数值符合则通过 &#60;0.75；假设从 0 bp 到 800 bp 范围内呈线性；若拉上比值 ≤ 0.1 且拉上扫描 ≤ 1，则触发拉上标志。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>点击 &#34;应用于检测&#34; 按钮，然后 &#34;保存至文献库&#34; 单击按钮以保存程序。关闭面板以继续。</li>
		<li>通过点击确保保存检测方案 &#34;保存至文献库&#34; 再次点击按钮，并通过点击退出面板 &#34;关闭&#34; 按钮。</li>
		<li>回到 &#34;分配板孔内容&#34; 页，点击 &#34;创建新文件命名规范&#34; 链接位于下方 &#34;文件命名规范&#34;</li>
		<li>命名程序 &#34;FPCR-CGE 文件名&#34;</li>
		<li>下 &#34;可用属性,&#34; 选择将出现在文件名中的所需属性（例如 &#34;运行日期,&#34; &#34;运行时间，&#34; &#34;孔位&#34; 和 &#34;样本名称&#34;）。选择用于存储运行结果的所需文件位置。</li>
		<li>点击 &#34;应用于检测&#34; 按钮，然后 &#34;保存至文献库&#34; 单击按钮以保存程序。关闭面板以继续。</li>
		<li>回到 &#34;分配板孔内容&#34; 页面，点击 &#34;创建新的结果组&#34; 链接位于下方 &#34;结果分组。&#34;</li>
		<li>命名程序 &#34;FPCR-CGE 结果分组&#34;</li>
		<li>在下方 &#34;可用属性,&#34; 选择将出现在文件名中的所需属性（例如 &#34;检测名称&#34;选择用于存储运行结果的目标文件位置。</li>
		<li>点击 &#34;应用于检测&#34; 按钮，然后 &#34;保存至文献库&#34; 单击按钮以保存程序。关闭面板以继续。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤设置电泳运行程序。
	<ol>
		<li>进入仪表板并点击 &#34;创建新培养板&#34; 图标。</li>
		<li>根据需要命名运行文件（为便于参考，建议包含日期、细胞系和基因名称）。选择以下选项：孔数，96；板类型，Fragment；毛细管长度，50 cm；聚合物，POP7。点击 &#34;分配孔板内容&#34; 按钮</li>
		<li>根据需要标记样品的每个孔（例如， 样品可以命名 &#34;NC&#34; 以表明该孔为阴性对照。</li>
		<li>在……之下 &#34;检测方法&#34; &#34;文件命名规范，&#34; 和 &#34;结果分组&#34; 盒子，点击 &#34;从库中添加&#34; 链接并选择在步骤 5.1.3 至 5.1.17 中创建的程序。</li>
		<li>高亮所有待分析的孔，并在下方选择相关程序 &#34;检测方法&#34; &#34;文件命名规范&#34; 和 &#34;结果分组&#34; 通过勾选其旁边的复选框。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在将96孔板加载到基因分析仪的托盘上之前，先在96孔板上安装橡胶密封垫，并将密封后的96孔板放入基因分析仪配套的塑料盒中。</li>
	<li>推入 &#34;托盘&#34; 按下基因分析仪前方的按钮，当托盘移至仪器前方时，打开门并将装有样品的板放入托盘中。确保板已固定到位，然后关闭门。</li>
	<li>点击 &#34;连接板用于运行&#34; 按钮</li>
	<li>在 &#34;加载运行用的板&#34; 完成页面操作后，进行最终检查，以确保所有试剂和条件均正确且顺序无误。</li>
	<li>点击 &#34;开始运行&#34; 按钮。每轮24个样本（96孔板的前3×8孔）的运行时间少于55分钟。</li>
</ol>
6. 分析电泳图以确定碱基对差异
<ol>
	<li>毛细管凝胶电泳运行结束后，打开分析软件以分析结果。</li>
	<li>点击 &#34;将样本添加到项目中&#34; 图标并搜索包含运行文件的文件夹。请回顾步骤 5.1.12 中指定的结果文件存储位置。</li>
	<li>选择已完成运行中每次进样的所有结果文件，然后单击 &#34;添加到列表&#34; 按钮；这些文件的名称以 &#34;注射&#34; 并包含运行的详细信息。</li>
	<li>点击 &#34;添加并分析&#34; 单击按钮以继续分析。</li>
	<li>通过点击第一个样本并向下拖动光标至最后一个样本来选中运行中的所有样本，然后单击 &#34;显示图表&#34; 图标。</li>
	<li>为检查大小标准的质量，需选中橙色图标并取消选中其余彩色图标，以打开结果的橙色通道；此步骤对于确保大小判读的准确性和可靠性至关重要。</li>
	<li>要查看来自非靶向对照和靶向克隆片段对应的峰，请勾选蓝色和绿色图标以打开这些通道的读数。</li>
	<li>将光标悬停在第一个结果图的横轴上，右键单击以选择 &#34;完整视图。&#34; 向下滚动，一目了然地查看所有结果，以判断运行过程中是否存在任何重大问题。要放大查看特定数值范围，可在图表的相关坐标轴上单击鼠标右键，然后选择 &#34;放大至…，&#34; 以及在感兴趣值范围内的关键参数。 
	注意：一个可能的主要问题是所有样本均出现低强度峰。这通常是由于在毛细管电泳运行前荧光标记的扩增子储存时间过长，或扩增子过度稀释所致。上述问题可通过重新进行PCR步骤，或采用较低的稀释倍数重新稀释扩增子来分别纠正。</li>
	<li>为保存结果，请按照以下步骤操作。
	<ol>
		<li>确保已选中蓝色和绿色通道，然后单击 &#34;尺寸对照表&#34; 图标。</li>
		<li>以制表符分隔的文本（.txt）格式保存数值表，方法是打开 &#34;文件&#34; 并选择 &#34;导出表格。&#34; 根据需要命名文件，并选择文件保存位置。</li>
		<li>要将运行结果的图表以 PDF 格式保存，请前往 &#34;文件&#34; 并点击 &#34;打印&#34; 选项。选择相应的 PDF 驱动程序并按下 &#34;打印。&#34; 根据需要命名文件，并选择文件保存位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为计算非靶向野生型对照与CRISPR/Cas9靶向克隆所产生的片段大小差异，请遵循以下步骤。
	<ol>
		<li>使用电子表格程序打开步骤 6.9.2 中的制表符分隔文本（.txt）文件。该表格应包含以下四个重要列： &#34;染料/样品峰&#34; （表示蓝色或绿色通道）， &#34;样本文件名&#34; （前几个字符表示孔或样品名称）， &#34;大小&#34; （表示所检测片段的大小），以及 &#34;高度&#34; （表示峰的荧光强度）。</li>
		<li>通过排除不在预期大小范围内的峰，筛选出相关峰。 
		注意：通常情况下，插入缺失突变（indel突变）导致的片段大小差异很少超过100 bp；因此，与野生型对照峰（绿色通道中的主峰）相比，大小差异超过100 bp的峰应予以排除。此操作可通过使用 &#34;介于&#34; 选项下的选项 &#34;条件格式&#34; 电子表格中的函数功能。</li>
		<li>为去除与背景水平无法区分的非特异性峰，请使用 &#34;小于&#34; 选项位于下方 &#34;条件格式&#34; 使用电子表格程序中的函数排除峰高低于 2,000 单位的峰。该截断值为经验确定，因此可根据实际情况进行调整。</li>
		<li>通过从蓝色通道（CRISPR/Cas9靶向克隆）中各结果峰的片段大小减去绿色通道（未靶向野生型对照）中唯一峰的片段大小，计算两者之间的片段大小差异。 
		注意：必须使用每个毛细管电泳样品对应的数值，因为野生型对照样品间的片段大小可能存在差异。</li>
		<li>将数值四舍五入至最接近的整数，以确定目标基因组序列中是否存在插入或缺失的碱基对数目。若目标为基因敲除，应选择插入缺失突变长度非3 bp倍数的克隆，以确保编码序列发生移码突变。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 克隆株基因敲除状态的验证
<ol>
	<li>使用 25 µL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化细胞，并在 37 °C 下孵育 5 分钟，将来自 96 孔板（步骤 2.4 和 2.6）的单个基因敲除克隆扩增至 24 孔板。</li>
	<li>向消化后的细胞中加入 125 µL 培养基（含 10% FBS 的 DMEM），充分重悬细胞。</li>
	<li>将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，在室温下以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>尽可能吸除上清液（使用真空抽吸或移液器），将细胞沉淀重悬于 500 µL 培养基中，然后将细胞悬液转移至 24 孔板的一个孔中。在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育，直至细胞融合度达到 80–90%。</li>
	<li>当细胞融合度达到 80–90% 时，通过重复步骤 7.1 至 7.4，将单个克隆从 24 孔板连续扩增至 6 孔板，再从 6 孔板扩增至 10 cm 培养皿；扩增过程中使用以下体积：从 24 孔板扩增至 6 孔板时使用 50 µL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 和 150 µL 培养基；从 6 孔板扩增至 10 cm 培养皿时使用 200 µL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 和 1 mL 培养基。</li>
	<li>当细胞融合度达到 80–90% 时，使用 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化细胞，并在 37 °C 下孵育 5 分钟，收集克隆细胞。</li>
	<li>向消化后的细胞中加入 5 mL 培养基（含 10% FBS 的 DMEM），充分重悬细胞。</li>
	<li>将细胞悬液均等地分装至两个 15 mL 离心管中，在室温下以 400 × g 离心 5 分钟，并尽可能去除上清液。其中一份细胞用于基因组 DNA 提取，另一份用于总蛋白提取。</li>
	<li>若通过 Sanger 测序进行验证，请按以下步骤操作：
	<ol>
		<li>按照先前所述方法12从克隆中提取基因组 DNA。</li>
		<li>对跨越 CRISPR/Cas9 靶位点的区域进行 PCR 扩增，方法如第 3.2 节所述，但使用未标记引物。此步骤中不得使用标记引物，因为标签的荧光会干扰后续的 Sanger 测序步骤。</li>
		<li>使用 PCR 纯化试剂盒对扩增产物进行纯化，方法如先前所述12。</li>
		<li>使用步骤 7.9.2 中的 PCR 引物对纯化后的扩增产物进行测序，以确定克隆的基因型，方法如先前所述12。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若通过 Western 印迹分析进行验证，请按照先前所述方法12从野生型细胞和靶向克隆中提取总蛋白。
	<ol>
		<li>使用针对目标基因蛋白的特异性抗体进行 Western 印迹分析，方法如先前所述12；真正的基因敲除克隆中该蛋白表达缺失。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2Fcas9%2C+a+novel+genomic+tool+to+knock+down+microRNA+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo.</a> Sci. Rep. 6, 22312(2016).</li>
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<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154, 1380-1389 (2013).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

在特定的模式细胞系中敲除某个特定基因，已成为阐明该基因在特定细胞环境中所起作用的常规手段。事实上，目前已有多种全基因组范围的筛选方法，利用CRISPR/Cas9系统靶向基因组中几乎所有已知的人类基因14,15,16。在进行这些大规模筛选（或甚至针对个别感兴趣基因的小规模靶向实验）时，设计并使用靶向同一基因不同位点的单导向RNA（sgRNA）至关重要。若不同sgRNA所获得的结果一致，则可明确揭示该基因缺失的真实效应。因此，针对单个基因的靶向研究需要进行高通量的基因分型步骤，以准确鉴定每种sgRNA所获得的大量克隆。本文所述的荧光PCR-毛细管凝胶电泳技术可精确完成此项任务。
尽管现有的大多数基因分型方法适用于高通量应用，但每种方法都存在某些固有的局限性，使其难以达到理想效果。SURVEYOR 或 T7E1 检测法通过识别 DNA 双链中的错配位点10...

反向遗传学方法使科学家能够阐明基因组中特定改变对细胞或完整生物体的影响。例如，可以通过基因敲低1,2（部分减少）或基因敲除3,4（完全消除）某一特定基因的表达，以确定这种改变对细胞功能或生物体发育所产生的影响。
自从序列特异性的可编程核酸酶（如锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs））问世以来，基因敲除实验已变得更加简便。然而，近年来对成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9系统的深入表征，使得全球任何实验室都能极为便捷地开展基因敲除实验。本质上，CRISPR/Cas9系统包含两个关键组分：一种单链向导RNA（sgRNA），可通过碱基互补配对识别并结合基因组中的特定序列；以及一种名为Cas9的内切核酸酶。sgRNA-Cas9复合物在基因组DNA上特异性结合并发挥作用后，会导致DNA发生双链断裂。这继而会激活细胞内的DNA损伤应答机制，并通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）途径进行修复。由于NHEJ修复机制（而非HR机制）常在修复位点随机插入或删除核苷酸，从而产生插入/缺失（indel）突变，可能导致外显子的阅读框发生移位。这可能进一步导致翻译提前终止以及无义介导的mRNA降解5,6,7。
尽管CRISPR/Cas9系统的引入为基因敲除带来了便利，但对靶向细胞克隆进行基因分型仍然是一个瓶颈，尤其是在高通量实验条件下8,9。现有的技术方法要么存在显著的固有局限性，要么成本高昂。例如，SURVEYOR或T7E1检测是一种通过识别DNA双链中的错配来检测突变的酶法检测技术10，但其无法区分野生型克隆与纯合突变体克隆（即等位基因发生相同突变的克隆），因为这些克隆具有相同的等位基因，其DNA序列中不存在错配11。此外，虽然Sanger测序被公认为基因分型的金标准，但在高通量条件下使用该方法因成本过高而不切实际。本文介绍了一种荧光PCR-毛细管凝胶电泳技术的详细实验方案，该方法可克服现有其他基因分型技术的局限性，特别适用于核酸酶介导的基因敲除克隆的高通量筛选。该方法在技术上操作简便，可节省时间和成本。

<table><tbody><tr><td>HEPG2 细胞</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 改良杜尔贝科必需培养基（DMEM）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>pSpCas9(BB)-2A-GFP 质粒</td><td>Addgene</td><td>PX458</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 分子生物学级水</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR sgRNA 插入寡核苷酸（正义链）</td><td>AITbiotech</td><td>None</td><td>序列：5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'</td></tr><tr><td>CRISPR sgRNA 插入寡核苷酸（反义链）</td><td>AITbiotech</td><td>None</td><td>序列：5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'</td></tr><tr><td>未标记的 PCR 扩增正向引物</td><td>AITbiotech</td><td>None</td><td>序列：5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'；该引物也用于测序 PCR 扩增的等位基因</td></tr><tr><td>6-FAM 标记的荧光 PCR 正向引物</td><td>AITbiotech</td><td>None</td><td>序列：5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'</td></tr><tr><td>HEX 标记的荧光 PCR 正向引物</td><td>AITbiotech</td><td>None</td><td>序列：5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'</td></tr><tr><td>未标记的 PCR 反向引物</td><td>AITbiotech</td><td>None</td><td>序列：5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'</td></tr><tr><td>Taq PCR 核心试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>201223</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Di 甲酰胺</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311320</td><td></td></tr><tr><td>GeneScan 500 LIZ 染料大小标准品</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4322682</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 光学 96 孔反应板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>3500xL 遗传分析仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4405633</td><td></td></tr><tr><td>3500 系列 2 程序</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4476988</td><td></td></tr><tr><td>Gene Mapper 5 程序</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4475073</td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene 细胞试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>1045696</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV 凝胶和 PCR 纯化系统</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>NAP1L1 抗体（N 端）</td><td>Abgent</td><td>AP1920b</td><td></td></tr><tr><td>核基质蛋白 p84 抗体 [5E10]</td><td>GeneTex</td><td>GTX70220</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的 AffiniPure 山羊抗兔 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的 AffiniPure 羊抗小鼠 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>515-035-003</td><td></td></tr></tbody></table>

使用荧光pcr-毛细管凝胶电泳技术高通量基因分型crispr/cas9介导的敲除突变体

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

可编程基因组编辑工具的发展促进了反向遗传学的应用，有助于理解特定基因组序列在细胞及完整生物体功能中所起的作用。近年来CRISPR/Cas9系统的引入极大地推动了这一研究进程——该系统是一种多功能工具，使研究人员能够以靶向方式操控基因组和转录组，实现基因的敲除、敲低或敲入等操作。在基因敲除方面，CRISPR/Cas9介导的双链断裂会招募非同源末端连接DNA修复通路，从而在断裂位点插入或缺失核苷酸，导致移码突变。然而，单个向导RNA可能引发非预期的脱靶效应，为排除此类效应，必须使用多个向导RNA。这种多靶点策略也意味着需要对大量克隆进行高通量筛选，因此迫切需要一种高效的高通量技术对敲除克隆进行基因分型。现有的基因分型技术要么存在固有局限性，要么成本较高，因而难以适用于高通量需求。本文详细描述了一种荧光PCR方法，该方法以粗提细胞裂解液中的基因组DNA为模板，通过毛细管凝胶电泳分离PCR扩增片段。该技术的分辨率足以区分片段间单个碱基对的差异，因此能够准确判断目标基因编码序列中是否存在移码突变。这种精确的检测结果有效避免了后续验证性测序步骤的必要性，帮助用户节省时间和成本。此外，如本文及其他研究所示，该方法在对多种组织来源的哺乳动物细胞进行基因分型方面表现出良好的通用性，适用于针对多个基因设计的向导RNA所介导的基因编辑分析。

本文所述的荧光PCR-毛细管凝胶电泳技术预计可适用于几乎所有可通过外源DNA递送进行基因操作的细胞系中基因组的任何可靶向区域。我们此前已通过靶向结直肠癌细胞系中的三个基因验证了该技术的应用12。本文中，我们展示了该技术在对肝细胞癌细胞系HEPG2进行基因分型中的有效性，该细胞系经CRISPR/Cas9载体靶向Nucleosome Assembly Protein 1 Like 1（NAP1L1）基因。事实上，我们已成功将荧光PCR-毛细管凝胶电泳技术应用于多种其他细胞的基因分型，包括非人哺乳动物细胞系，并靶向多个其他基因12,13。
从实验角度来看，荧光PCR-毛细管凝胶电泳技术操作简便且快速。在将Cas9和sgRNA表达载体导入细胞并筛选出阳性克隆后，可直接使用我们自制的裂解缓冲液（Di...

本文所述的基因分型技术将荧光聚合酶链式反应（PCR）与毛细管凝胶电泳相结合，可实现对核酸酶介导的基因敲除克隆进行高通量基因分型。该方法克服了其他基因分型技术所面临的局限性，且比测序方法更具成本效益。

使用荧光PCR-毛细管凝胶电泳技术高通量基因分型CRISPR/Cas9介导的敲除突变体

可编程基因组编辑工具的发展促进了反向遗传学的应用，有助于阐明特定基因组序列所发挥的作用……

本技术的总体目标是以高通量方式对 CRISPR/Cas9 诱导的插入缺失突变克隆进行基因型鉴定。该方法有助于回答遗传学领域的关键问题，例如在选定的 SAIL 模型中敲除特定基因所产生的表型效应。该技术的主要优势在于可实现从低通量到高通量的筛选，具有高度的多功能灵活性。尽管该方法可为人类癌症遗传学研究提供见解，但也可应用于其他系统，例如人类干细胞、原代细胞或非人类来源的细胞。我们最初是在进行短串联重复序列（STR）分型检测时提出了该方法的设想。实验开始时，用表达荧光标记Cas9和单链向导RNA的质粒共转染选定的细胞。用胰蛋白酶消化细胞，挑选约3,500个荧光标记的克隆。将克隆按每份500、1,000和2,000个细胞的数量分别接种至10厘米培养皿中，每皿加入8毫升含青霉素-链霉素的完全生长培养基。于37°C、5% CO2 培养箱中培养细胞，每5天更换一次培养基，直至肉眼可见单细胞形成的克隆集落。然后用200微升移液枪吸取约5微升培养基，将单个菌落吸入枪头中。将每个菌落转移至含有200微升培养基的独立孔中。反复吹打每种混合物，以重新悬浮细胞。将细胞在前述条件下孵育，直至细胞达到50%至90%汇合度。移除孔中多余的培养基，每孔加入25 µL不含酚红的0.05%胰蛋白酶EDTA。于37 °C孵育细胞7分钟。然后反复吹打混合液，以重新悬浮胰蛋白酶消化后的细胞。在显微镜下观察各孔，确认细胞已从孔壁上脱落。为制备单个克隆的重复样本，将每种细胞悬液各取5 µL转移至新的96孔培养板中。向每个孔中加入 200 微升培养基。然后向一个空的 96 孔 PCR 板的各孔中加入 10 微升裂解缓冲液。再将每种细胞悬液各 5 微升转移至该 96 孔板中。轻轻离心培养板，直至液体全部沉降至孔底。向每种细胞悬液剩余的15微升中加入200微升生长培养基。将原始悬液及重复样本置于培养条件下保存，以备后续验证克隆的基因敲除状态。然后使用热循环在裂解缓冲液中完全裂解细胞。短暂离心裂解物。用40 µL无核酸酶水稀释裂解物。涡旋并短暂离心稀释后的裂解液。在进行荧光PCR之前，设计并测试多对未标记引物在裂解的野生型细胞上的特异性。确定最佳引物对，并获取荧光标记的正向引物和未标记的反向引物。务必使用涡旋细胞并采用自制裂解缓冲液进行裂解后测试引物的特异性，因为使用纯化的基因组DNA可能会导致结果存在差异。使用标记引物，以3微升稀释后的裂解液进行20微升的荧光PCR反应，以扩增目标区域。取5微升PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，以分析扩增片段的大小和相对含量。开始样品制备时，使用无核酸酶水将野生型和CRISPR/Cas9靶向DNA的扩增子稀释至约2.5 纳克/微升的浓度。取等体积稀释后的野生型和靶向DNA样品混合。向96孔PCR板的各孔中加入9微升去离子甲酰胺与荧光标记的大小标准品按29:1比例混合的溶液，以及1微升混合后的扩增子。将反应板密封后，使用PCR仪在95摄氏度下加热样品3分钟。加热后立即置于冰上冷却3分钟。随后使用遗传分析仪进行毛细管凝胶电泳。电泳完成后，将数据导入分析软件并绘制图表。通过查看相应荧光染料通道的数据，验证片段大小标准品的质量。然后将非靶向野生型对照样本和靶向克隆样本的荧光染料通道数值导出为 txt 格式。从此文件中将染料名称、样本文件名、片段大小和峰高值导入电子表格软件。计算每个样本中目标克隆与非目标野生型对照之间的片段大小差异。鉴定出插入缺失突变且突变长度不是三的倍数的克隆。从保存的重复样本中连续扩增所选克隆。进行Sanger测序和蛋白质印迹分析，以确定克隆的基因型并验证克隆的基因敲除状态。使用针对Nap1L1基因的CRISPR/Cas9载体对肝细胞癌细胞系HEPG2进行靶向编辑。使用分别标记绿色和蓝色荧光染料的引物，对非靶向的野生型等位基因和CRISPR/Cas9靶向的等位基因进行PCR扩增。通过采用特别优化的荧光PCR方案，可高效获得靶向克隆的扩增产物。在单个克隆的样品中，未观察到绿色与蓝色荧光染料之间存在干扰。通过毛细管凝胶电泳测定的片段大小分析显示，此处所示的两个克隆分别缺失了1个和10个碱基对。Sanger测序结果与毛细管凝胶电泳分析结果一致。外周血分析证实，所选克隆不表达NAP1L1。在进行该实验操作时，务必仔细标记样本，因为涉及的样本数量较多，同时还应尽量减少荧光标记扩增产物的光照暴露时间，因其对光敏感。完成本实验步骤后，可进一步采用其他方法，如定量 RT-PCR、Western 印迹分析和 Sanger 测序，以回答更多问题，例如目标基因是否完全敲除。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用荧光 PCR 联用毛细管凝胶电泳技术，以高通量方式对 CRISPR/Cas9 诱导的突变克隆进行基因型鉴定。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

用荧光PCR毛细管电泳技术在基因型CRISPR / Cas9介导的敲除突变体的高通量形式

CRISPR/Cas9 是一种强大的系统，可用于破坏基因和遗传元件。本文介绍了一种利用 CRISPR/Cas9...

利用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞系中产生基因组缺失

近年来，在体细胞系中进行基因操作的能力取得了显著进展，为基础研究和应用研究带来了巨大潜力。本文介绍了两种在哺乳动物细胞系中利用CRISPR/Cas9技术生成基因敲除并进行筛选的方法，一种使用可选择标记，另一种则不使用可选择标记。...

基于选择依赖性与非依赖性的CRISPR/Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除生成方法

关键词：CRISPR/Cas9，基因敲除，哺乳动物细胞，选择标记，非选择性筛选，基因编辑

高效构建与鉴定模式生物Danio rerio中CRISPR/Cas9介导的基因敲除

本文描述了一种在小鼠和人类原代造血细胞中快速进行CRISPR/Cas9介导基因敲除的实验方案。通过电穿孔将Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物导入细胞，其中sgRNA通过体外转录生成 体外...

利用CRISPR/Cas9高效破坏小鼠和人类造血祖细胞中的基因

本文介绍了一种利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白和同源依赖性修复模板对秀丽隐杆线虫（C.

使用 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白在 C. elegans 中快速简便地生成基因组点突变的流程

CRISPR-Cas9 技术提供了一种高效的方法，可精确编辑任何细胞类型的哺乳动物基因组，并代表了一种进行全基因组遗传筛选的新手段。本文提供了一个详细方案，阐述了成功实施混合式全基因组 CRISPR-Cas9...

哺乳动物细胞中基于CRISPR的 pooled 遗传筛选

直接递送预先组装的Cas9/向导RNA核糖核蛋白复合物是实现造血细胞基因组编辑的一种快速高效的方法。在此，我们利用该方法删除RUNX1基因内含子中的沉默子，并检测OCI-AML3白血病细胞中的转录应答。...

利用 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白在急性髓系白血病细胞中研究 RUNX1 内含子沉默子的转录调控作用

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利用全基因组规模的CRISPR/Cas9遗传筛选鉴定细胞表面受体

关键词：细胞表面受体，CRISPR/Cas9，全基因组筛选，遗传筛选，功能基因组学，基因敲除，sgRNA文库，流式细胞术，高通量筛选

本方案描述了一种高通量的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）基因编辑工作流程，用于微小RNA（miRNA）簇网络分析，可在单次实验中快速构建一系列基因修饰的细胞系，这些细胞系携带不同miRNA簇成员的特异性缺失组合，缺失片段长度可达35...

用于微小RNA簇网络分析的CRISPR基因编辑工具

CRISPR-Cas 技术已彻底改变了基因组编辑领域。然而，发现并分离出理想的种系编辑仍是一个主要瓶颈。因此，本实验方案描述了一种可靠的方法，利用标准的 PCR、限制性酶切和凝胶电泳技术，快速筛选经 CRISPR 注射的 F0...

斑马鱼生殖系编辑的精子筛选快速分离方法

本文介绍了一种通过将稳定的zpc:cas9基因敲入品系与Tol2介导的sgRNA表达盒递送相结合，以产生母源突变体的实验方案。...

利用zpc:cas9基因敲入斑马鱼产生母源突变体

学习使用荧光PCR结合毛细管凝胶电泳技术对CRISPR/Cas9诱导的基因敲除突变体进行高通量基因分型。该方法适用于人类、干细胞及非人类细胞，为遗传学和癌症生物学研究提供经济高效的解决方案。

使用荧光PCR-毛细管凝胶电泳技术高通量基因分型CRISPR/Cas9介导的敲除突变体

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