Name: 评估在鼠标模型中执行唤醒膀胱测压的过程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学习在清醒小鼠模型中进行膀胱内置管植入的显微外科手术方法，用于记录下尿路功能并获取可重复的膀胱测压实验数据。该技术为神经泌尿学研究提供了标准化方案。

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本研究由佛蒙特大学外科系、丹麦独立研究理事会以及欧登塞大学医院资助。

动物饲养于佛蒙特大学动物护理设施，遵循机构制定的指导原则。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行。
1. 膀胱内导管植入
<ol>
	<li>手术器械和导管管路的准备
	<ol>
		<li>截取一段7厘米长的PE10管，用于制作植入用导管。</li>
		<li>将PE10管的一端缓慢靠近明火，形成喇叭口。 
		注意：一旦喇叭口形成，应立即撤回导管。</li>
		<li>使用低温设置的热熔胶枪，在PE10管外侧距离喇叭口端4.5、5和5.5 cm处各施加一滴通用热熔胶。这些胶点有助于将导管固定在动物背部。（图1）</li>
		<li>通过将导管浸泡于70%乙醇中进行灭菌，使用前再用无菌0.9% NaCl冲洗。保持导管内充满液体，以避免系统中引入气泡。</li>
		<li>通过手动左右摆动30号针头的近端，将其从针座上分离，制成一个30号塞子，用于密封PE10导管的末端。在末端滴加一滴热熔胶，确保密封完全防水。（图2）</li>
		<li>使用以下显微外科器械：两对Dumont #7弯显微镊、两对Dumont #5弯显微镊、一支21 G针头、超细直止血钳、显微剪刀、小型解剖剪刀和显微持针器。</li>
		<li>在开始手术前对所有器械进行灭菌处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动物准备
	<ol>
		<li>麻醉动物后，先剃除腹部下半部分的毛发，然后将动物转为俯卧位，用70%酒精和碘伏清洁上背部区域。在眼睛上涂抹兽用眼膏以防止干燥。接着，使用一对直头钝头剪刀和一对Dumont #7弯显微镊，在肩胛骨之间做一条1.5 cm长的皮肤切口，并将动物仰卧放置在覆盖无菌巾的加热垫（37 °C）上。</li>
		<li>最后，用酒精和碘伏清洁腹部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术操作 
	注意：所有手术操作均应在手术显微镜下进行，放大倍数范围为3.15X至20X。将动物放置于无菌巾上后，戴上无菌手套。整个手术过程中持续采用无菌操作。
	<ol>
		<li>将动物放入诱导箱，使用2%吸入式异氟烷（氧气流速1 L/min）进行麻醉。手术过程中通过将动物头部置于鼻罩中，持续使用2%吸入式异氟烷（氧气流速1 L/min）维持麻醉状态。在脚趾夹捏试验无反应后开始手术。</li>
		<li>使用一对直头钝头剪刀和一对Dumont #7弯显微镊，在皮肤上做一条1.5 cm长的下腹正中切口。随后沿腹白线和肌肉层在筋膜上做相应切口，暴露膀胱顶部及上半部分。使用Dumont #7弯显微镊对各组织层施加向上牵引力，避免损伤膀胱。通过滴加温热的生理盐水防止腹腔内脏干燥。</li>
		<li>将动物旋转至侧卧位，以便接触颈部背侧切口。将一把窄止血钳经皮下从切口插入，皮下通道应从背部开始，沿体侧延伸。</li>
		<li>当器械尖端到达肋笼底部时，将尖端转向腹中线并向腹腔内推进（穿刺腹壁肌肉时会有轻微“弹响”感）。继续推进止血钳，直至其尖端在肌肉层下方的腹部切口处露出。（图3）</li>
		<li>用止血钳夹住&#34;非喇叭口&#34;端的导管，缓慢回撤工具，将导管末端从颈部切口拉出。调整导管的喇叭口端，使其正对膀胱顶部上方。</li>
		<li>在膀胱顶部上方打一个松散的6-0单丝缝线结（不可吸收），并将该结置于膀胱顶部。此结稍后用于固定导管。</li>
		<li>在腹腔内膀胱后方放置一小卷无尘纸巾，以帮助稳定并抬高膀胱。</li>
		<li>准备将PE10导管的喇叭口端插入膀胱。
		<ol>
			<li>用非优势手持Dumont #7弯显微镊夹住膀胱顶部，并在整个导管置入过程中保持此操作。</li>
			<li>使用21号针头在膀胱顶部顶端做膀胱切开术。用闭合的#5弯显微镊轻轻探查切口，确保导管可顺利通过。</li>
			<li>在非优势手仍夹持膀胱顶部的同时，将PE10导管的喇叭口端插入膀胱（将喇叭口推至膀胱颈部，以防固定时滑脱）。</li>
			<li>在膀胱顶部和导管周围打结6-0单丝缝线，结的位置应位于导管前方。务必尽可能在膀胱较高位置打结，以避免人为减少膀胱容量。（图4）</li>
			<li>或者，可采用荷包缝合法固定导管，具体如下：使用6-0单丝缝线在膀胱顶部打一个松散的荷包缝合。按照步骤1.3.8.1–1.3.8.3进行膀胱切开并插入导管，然后收紧荷包缝线以固定导管。（图5）</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过在导管远端连接一支带有30号针头的0.5 mL胰岛素注射器，测试导管在膀胱内的通畅性和密封性。缓慢注入0.1–0.2 mL的0.9% NaCl至膀胱，直至尿道口出现液滴，然后通过抽吸排空膀胱。重要的是，膀胱应能顺利完成充盈和排空。</li>
		<li>若膀胱顶部无渗漏，用一对弯显微镊支撑膀胱，并轻拉导管，使喇叭口紧贴膀胱顶部内壁。</li>
		<li>缝合前，移除腹腔内的纸巾卷，并确认膀胱处于正常位置。</li>
		<li>使用6-0连续缝线分两层（肌肉层和皮肤层）关闭腹壁。建议仅缝合腹直肌前筋膜边缘（腹直肌鞘前壁）以对齐腹直肌。</li>
		<li>为固定动物背部的导管，轻柔地将动物转为俯卧位。将金属锚的皮下部分插入肩胛间切口。（图12）使用6-0缝线通过垂直褥式缝合环绕导管和锚，将其固定。</li>
		<li>确保皮肤上下方均保留热熔胶泡，以防止导管被拉出。在皮肤上方约2 cm处剪断导管。</li>
		<li>将30号塞子（步骤1.1.5制备）轻轻插入导管末端，防止尿液泄漏。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>皮下注射0.5 mL 0.9% NaCl以补充水分。术后立即给予镇痛治疗，并持续48小时。
	<ol>
		<li>将动物放回位于红外灯下的笼子中。持续观察，直至动物能够在笼内自由活动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每日监测动物状态，术后恢复5天后再开始记录实验数据。</li>
</ol>
2. 清醒状态下的膀胱测压记录
<ol>
	<li>记录程序、压力传感器和输液泵的准备。
	<ol>
		<li>在麻醉动物之前，使用 PE50 管将输液泵、压力传感器和 22 G 旋转接头连接起来。（图6）</li>
		<li>在计算机上打开记录程序（参见材料表中的示例），以校准系统压力并准备开始记录。确保在校准和记录过程中使用相同的设置。
		<ol>
			<li>用 10–15 mL 室温的 0.9% NaCl 充满一个 20 mL 注射器，并将其装入输液泵中。将泵设置为以 0.6 mL/h 的速率输注。</li>
			<li>将压力传感器固定在与动物膀胱或记录笼底部相同高度的位置。</li>
			<li>将 22 号旋转接头连接到压力传感器末端（PE50 管—压力传感器—旋转接头） 
			注：当动物活动时，旋转接头可防止管道扭曲或弯折。</li>
			<li>推进注射泵，使 0.9% NaCl 流经整个系统。在校准前务必清除所有气泡。</li>
			<li>在运行记录程序的同时，使用直尺对压力（cm/H2O）进行校准。缓慢将 PE50 系管末端从 0 cm 移动至 30 cm。如有需要，调整零点。 
			注：0 cm 标记应与记录笼底面和压力传感器处于同一高度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将 22 号旋转接头悬挂在记录笼正中央上方。确保笼底允许尿液直接滴落到位于笼子下方天平上的收集装置中。调整系管的高度，使小鼠能够在笼内自由活动，而不会拉扯或过度牵拉管道。（图7）</li>
		<li>完成后，检查系统及外部 PE50 管是否已完全充满 0.9% NaCl，并确认所有气泡均已排除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动物记录前的准备
	<ol>
		<li>使用 2% 吸入式异氟烷麻醉动物，并将其置于腹部卧位。移除 30 号堵头，将 PE10 管（膀胱导管）插入 PE50 系管末端。使用热熔胶密封，确保不漏水。</li>
		<li>关闭麻醉装置，将动物放入具有平行金属丝底网的记录笼中，以便尿液可直接滴落到放置于分析天平上的收集装置中。（图7）</li>
		<li>动物放入笼中后开始记录，但暂不开始输注。持续监测动物，直至其完全从麻醉中恢复。当膀胱压力稳定后，开始以 0.6 mL/h 的速率输注 0.9% NaCl。 
		注：在记录程序中标注所有操作变更。记录输注开始、停止或出现异常的时间点非常重要。</li>
		<li>检查系统是否存在泄漏，并确保动物能够方便地获取食物和饮水。</li>
		<li>在安静环境中持续记录，直至获得三个可重复的排尿周期。 
		注：记录过程中应完全避免干扰动物。建议使用远程视频监控来观察动物行为。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Lemack, G. E., Zimmern, P. E., Vazquez, D., Connell, J. D., Lin, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+response+to+partial+bladder+outlet+obstruction+in+mice+lacking+inducible+nitric+oxide+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Altered response to partial bladder outlet obstruction in mice lacking inducible nitric oxide synthase.</a> J Urol. 163 (6), 1981-1987 (2000).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

膀胱内导管的最佳材料与尺寸
为了确定导管直径对压力记录的影响，我们测试了不同的微流控导管：PE50（内径0.58 mm）、聚氨酯PU027（内径0.4 mm）、PE25（内径0.46 mm）和PE10（内径0.28 mm）。对于每种导管，在输液泵以1 mL/h运行的同时，将导管在垂直方向上从0快速移动至30 cm，并记录压力变化。最初的在体实验尝试使用PE50导管，但由于导管尺寸相对于小鼠膀胱过大而未成功（图4A）。这一结果支持Smith和Kuchel的研究发现，即在清醒小鼠膀胱测压中使用PE50导管会产生伪影，从而难以解读数据12；但需要注意的是，其他研究者已在清醒无束缚、清醒束缚以及麻醉状态下的小鼠膀胱测压中成功使用PE50导管9,13,14。与PE50相比，PE10更具柔韧性，当小鼠活动时可减少导管对膀胱施加的张力，...

充盈性膀胱测压（FC）是一种诊断方法，通过将导管置入膀胱，在缓慢充盈膀胱的过程中记录压力变化。该方法最早于1927年作为临床诊断手段被提出，用于评估下尿路功能，至今仍被广泛应用。1 在科研领域，FC可用于检测健康和疾病动物模型的膀胱功能，并研究药理学制剂的作用效果。啮齿类动物模型常被用于探究下尿路功能。2 在这类哺乳动物中，FC技术最初在大鼠中建立。3 目前，向膀胱植入导管并进行FC的操作方法已有详尽描述，并被众多研究者采用，具有可接受的可重复性。4 由于转基因和基因敲除小鼠品系的可获得性，小鼠已成为包括下尿路功能障碍在内的多个研究领域的重要物种。然而，不同实验室在小鼠膀胱测压操作方法上存在显著差异，导致实验结果难以比较。5
与离体（ex vivo）模型相比，清醒自由活动状态下的膀胱功能检测（FC）可保留下尿路的解剖结构，从而能够评估储尿和排尿阶段膀胱与其出口之间的协调功能。既往研究表明，多种常用麻醉剂会抑制排尿收缩。尽管某些药物（如乌拉坦、α-氯醛糖、氯胺酮和赛拉嗪）可在一定程度上保留膀胱平滑肌的收缩功能，使动物能够排尿，但仍会显著降低膀胱的功能容量并抑制神经传递。6,7,8,9 尽管在技术上更具挑战性，但在清醒且可自由活动的动物中进行的FC能够更好地维持排尿反射的功能完整性。
下尿路功能受多种因素影响，包括术后膀胱壁肿胀、疼痛和不适引起的压力以及环境因素。采用在导管植入过程中最大限度减少组织损伤的手术技术，以及使用可减少导管移动并同时允许动物自由活动的记录方法，对于获得准确且可重复的记录至关重要。
如果操作得当，体内实验 在自由活动的动物中进行膀胱功能监测可提供可靠反映生理状态下膀胱功能的数据。10 在自由活动动物中进行的膀胱测压（FC）可提供以下参数的数据：基础压或基线压：两次排尿间期的最低压力。间歇排尿压：两次排尿间期的平均压力。阈压：排尿即将开始前的膀胱内压。最大压：排尿周期中膀胱内的最高压力。自发性活动（或平均间歇排尿振荡压）：间歇排尿压减去基础压。非排尿性收缩：充盈期膀胱内压升高，但未伴随液体排出。膀胱顺应性：膀胱容量除以阈压与基础压之差。排尿频率：单位时间内的排尿次数。间歇排尿间隔：两次最大排尿压之间的时间段。膀胱容量：灌注液体积除以排尿次数。上述参数的详细描述及标准化术语此前已有发表。11
FC 可采用连续或单周期膀胱内灌注法进行。连续膀胱测压法可记录多次排尿周期，并根据可重复性选择代表性数据。由于残余尿量未知，该方法在测量膀胱容量方面的准确性有限。此外，在自由活动的小鼠中收集少量排尿量（根据品系和性别不同，范围为 30 至 184 µL）具有挑战性。与麻醉状态下的实验相比，该方法在记录排尿量时准确性较低，但其优势在于避免了麻醉剂对膀胱功能的抑制作用。单周期膀胱测压法应用于评估膀胱容量。在此方法中，灌注前通过抽吸排空膀胱，膀胱容量则通过灌注速率乘以达到最大压力所需时间来计算。
尽管已有文献报道了在小型啮齿类动物中进行膀胱测压的技术，但该文献描述的是大鼠的手术操作，并建议小鼠膀胱测压应在乌拉坦麻醉下进行10。本论文的目的是描述两种技术：一是显微外科技术，用于将膀胱内导管植入小鼠膀胱顶部；二是实验装置的设置，用于在清醒、自由活动的小鼠中连续灌注膀胱并记录排尿过程中下尿路功能的体内数据。此外，还开展了一系列实验，以探讨导管长度、直径、材质以及体内连续灌注膀胱测压（FC）的操作方法对记录结果的影响。本实验方案总结了既往发表的技术，并基于实验结果提出若干改进措施。

<table><tbody><tr><td>聚乙烯（PE）10 管</td><td>Instech</td><td>BTPE-10</td><td>适用于 30G 连接器/堵头</td></tr><tr><td>聚乙烯（PE）50 管</td><td>Instech</td><td>BTPE-50</td><td>适用于 22G 连接器/堵头</td></tr><tr><td>22 G 单通道不锈钢旋转接头</td><td>Instech</td><td>375/22</td><td></td></tr><tr><td>高碳钢通用延伸弹簧（9/64&quot; 外径）</td><td>Grainger</td><td>1NAH1</td><td>用于保护 PE50 管——按需剪裁长度</td></tr><tr><td>22 G 连接器</td><td>Instech</td><td>SP22/12</td><td></td></tr><tr><td>Yutaoz 专业热熔胶枪</td><td>Yutaoz</td><td></td><td>使用低温设置（100 &amp;deg;C）——任何具有可调温度范围的热熔胶枪均可使用</td></tr><tr><td>Surebonder DT-2010 通用胶棒</td><td>Surebonder</td><td></td><td>任何通用热熔胶均可使用</td></tr><tr><td>Dumont #5 弯头显微镊</td><td>World Precision Instruments</td><td>500232</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 弯头显微镊</td><td>World Precision Instruments</td><td>14188</td><td></td></tr><tr><td>微型解剖剪刀——直头</td><td>World Precision Instruments</td><td>503240</td><td></td></tr><tr><td>微型蚊式钳（12.5 cm）</td><td>World Precision Instruments</td><td>500451</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀——直头</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo 持针器</td><td>World Precision Instruments</td><td>503258</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷，USP</td><td>Phoenix</td><td></td><td>2%，1 L/min 流速</td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td></td><td></td><td>0.05 mg/kg</td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠冲洗液，USP</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-0 Ethilon 黑色单丝不可吸收缝线</td><td>Ethicon</td><td></td><td>膀胱结扎</td></tr><tr><td>6-0 Vicryl 紫色编织可吸收缝线</td><td>Ethicon</td><td></td><td>肌肉缝合，连续缝合</td></tr><tr><td>6-0 Prolene 蓝色单丝不可吸收缝线</td><td>Ethicon</td><td></td><td>皮肤缝合，垂直褥式，埋藏间断缝合</td></tr><tr><td>KD Legato 210 注射/抽取泵</td><td>KD Scientific</td><td></td><td>1.5 mL/hr</td></tr><tr><td>一次性压力传感器</td><td>Digitimer</td><td>NL108T2</td><td></td></tr><tr><td>压力放大器</td><td>Digitimer</td><td>NL108A</td><td></td></tr><tr><td>Power1401-3 数据采集接口</td><td>Digitimer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spike2&amp;nbsp;</td><td>Cambridge Electronic Design Limited</td><td></td><td>PC 压力记录软件</td></tr><tr><td>Leica MZ6 外科手术显微镜（3.2 - 20X）</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>放大倍数</td></tr></tbody></table>

评估在小鼠模型中进行清醒状态下膀胱测压的操作流程

Evaluating the Procedure for Performing Awake Cystometry in a Mouse Model

清醒状态下充盈性膀胱测压长期以来被用于评估自由活动小鼠的膀胱功能，然而不同实验室所采用的具体方法存在差异。本研究旨在描述用于植入膀胱内导管的显微外科手术操作步骤，以及在清醒、自由活动小鼠中记录膀胱压力的实验技术。此外，本文还提供了实验数据，以展示手术操作以及导管类型和尺寸对下尿路功能和记录灵敏度的影响。通过不同内径的聚乙烯和聚氨酯导管，评估了导管直径对压力记录的影响。随后，从两种材料中选择性能最佳的导管，外科植入雄性C57BL/6小鼠膀胱顶部。在健康完整动物以及术后第2、3、5和7天的动物中，记录了12小时夜间排尿频率。处死动物后，通过肉眼观察评估膀胱是否存在肿胀，并进一步进行病理学分析。膀胱肿胀最明显的时期为术后第2天和第3天，这与行为学排尿数据一致，显示膀胱功能显著受损。至术后第5天，膀胱组织学表现和排尿频率均已恢复正常。结合文献资料及本研究提供的证据，我们提出在清醒小鼠中进行膀胱内压和排尿量体内记录的以下建议步骤：1）使用手术显微镜和显微外科器械进行手术；2）采用聚乙烯-10导管以最小化运动伪影；3）在术后第5天进行膀胱测压，此时膀胱肿胀已消退。

在导管阻塞期间，系统内压力上升和下降的稳定性方面，不同导管材料和直径之间无显著差异。膀胱内导管植入后，聚乙烯（PE）和聚氨酯（PU）两种材料均引起显著的膀胱壁肿胀。术后第2天，出现严重的黏膜下层肿胀，占据膀胱横截面的一半，导致管腔阻塞。术后第5天，水肿完全消退，黏膜下区域可见炎性细胞浸润，并部分侵入肌层。术后第7天，炎性浸润显著减轻，膀胱壁组织学恢复正常（图8）。组织肿胀最明显的时期为术后第2天和第3天，这与行为排尿数据中显示的膀胱功能显著受损相一致（图9）。术后第5天，排尿频率恢复正常。
清醒且自由活动的小鼠（运动伪影极小）的膀胱内压表现为10–15 cm H2O的基线压力，在充盈周期中该压力可能保持不变或逐渐升高，但升高幅度不超过10 cm H2O，随后在排尿时出现突然的脉冲式压力上升，紧接着压力下降（图10</stron...

本研究描述了在自由活动的小鼠中进行清醒状态下膀胱测压的手术操作及实验技术，并提供了支持其优化与标准化的实验依据。

清醒状态下充盈性膀胱测压长期以来被用于评估自由活动小鼠的膀胱功能，然而所采用的具体方法在不同研究之间存在差异……

本显微外科手术的总体目标是将膀胱内导管植入小鼠的膀胱中，以记录清醒状态下小鼠下尿路的功能。该方法有助于从小鼠清醒状态下的膀胱测压实验中获得可重复的实验数据，并可用于健康及疾病小鼠模型中膀胱功能的检测。该技术的主要目标是基于实验数据，为小鼠模型中的充盈期膀胱测压提供一种标准化的方法。为准备植入用导管，首先截取一段7厘米长的PE10导管，将一端缓慢靠近明火以形成喇叭口，一旦喇叭口形成则立即撤回导管。然后使用胶枪的低温设置，在距喇叭口端4.5、5和5.5厘米处各施加一滴通用热熔胶，共三滴。使用剪刀修剪胶滴表面的不规则突起。在30号针头的一端涂上热熔胶，该针头将用于植入后堵塞pe10导管。接着确认动物对脚趾夹捏无反应，并在其眼睛上涂抹眼膏。用酒精和碘伏消毒动物上背部和下腹部后，在肩胛骨之间做一处1.5厘米长的切口，并将动物仰卧置于覆盖无菌敷料的37°C加热垫上，在解剖显微镜下进行操作。现在做一个1.5厘米长的下腹部正中皮肤切口。随后沿腹白线的筋膜和肌肉做相应切口，暴露膀胱顶部及上半部分。用温热的生理盐水保持腹腔脏器湿润，将动物旋转至侧卧位，以接触颈部背侧的切口。通过切口将一把窄的止血钳皮下穿入，在动物背部建立一条皮下通路，并沿动物体侧继续推进。当器械尖端到达肋笼底部时，将尖端转向腹腔内侧的中线位置，并继续推进止血钳，直至其尖端在腹肌层下方的腹部切口处露出。一旦止血钳尖端进入切口，捏住肩部上方的皮肤并施加牵引力，以帮助固定动物体位，直至器械尖端在腹部切口处可见。现在使用止血钳夹住导管无扩口的一端，缓慢回拉止血钳，将导管末端从颈部后方的切口拉出，并调整导管的扩口端，使其正对膀胱顶部上方。用一小卷无绒纸巾固定膀胱。在膀胱顶部放置一根松扎、不可吸收的6-0单股缝线。用非优势手持 Dumont 7 号弯显微镊夹住膀胱顶部，用优势手持 21 号针头在膀胱顶点处行膀胱切开术。用闭合的 5 号弯显微镊轻轻探查膀胱切口，确保导管可顺利通过，然后将 PE10 导管的扩口端插入膀胱，将扩口部分推至膀胱颈，以防止在固定过程中滑脱。将单丝结置于导管前方，用 6-0 缝线尽可能靠近膀胱顶端收紧，环绕膀胱顶部和导管进行结扎，以避免人为减小膀胱容量。或者，在膀胱顶部放置一针松散的荷包缝线，按前述方法行膀胱切开术，并将导管的扩口端插入穿刺口。然后按平面缝合所示方法，将缝线围绕膀胱顶部和导管进行结扎。无论采用哪种方法，均需注意固定导管时避免对膀胱壁造成严重损伤。如果取用的组织过多，膀胱容量会减小；如果取用过少，则连接处会出现渗漏。为检测导管在膀胱内的密封性和位置，将一支装有30号针头的0.5毫升胰岛素注射器连接至导管远端，缓慢注入0.1至0.2毫升0.9%氯化钠溶液，直至尿道口出现液滴。如果密封不完全，将缝线尾端环绕膀胱并重新打结。然后通过抽吸排空膀胱。若膀胱顶部无渗漏，用一对弯头显微镊子支撑膀胱，并轻柔牵拉导管，直至扩口端紧贴膀胱顶部内壁。使用先前所述方法重新测试密封性。修剪缝线线尾，移除组织卷，并将膀胱复位至正常位置。然后使用连续的6-0缝线以两层缝合腹壁。轻轻将动物翻转至腹部朝上。将金属锚的皮下部分插入肩胛间切口，使用6-0单股缝线以垂直褥式缝合法固定导管和锚。确认皮肤上下方均有胶状物形成气泡，以防止导管脱出，并在皮肤上方约2厘米处剪断导管。然后轻轻将一根30号插头插入管子末端，以防止尿液泄漏。在进行读数前，使用PE50导管将输注泵、压力传感器和22号旋转接头连接。随后将麻醉后的实验动物置于俯卧位，并移除30号插头。将系绳连接至锚点，将膀胱导管插入PE50管末端，并使用热熔胶形成防水密封。将小鼠放置于金属丝网底上，开始记录。然后，当动物从麻醉中恢复且膀胱压力稳定后，开始以每小时0.6毫升的速度输注0.9%氯化钠溶液。通常，在导管插入后的第二天，膀胱横切面的一半区域会出现严重的黏膜下水肿，导致管腔阻塞。到第五天，水肿完全消退，黏膜下区域被炎性细胞浸润，部分炎性细胞已侵入肌层。在术后第二天和第三天观察到的组织肿胀程度最为明显，与相应的行为排尿表现相关，动物在这些时间点表现出显著受损的膀胱功能。根据组织学数据的预期，排尿频率在术后第五天恢复正常。在清醒且自由活动的动物中，膀胱内压的基线压力为10至15厘米水柱，填充周期期间该压力可能保持不变，或逐渐升高不超过10厘米水柱，且运动伪影最小。随后在排尿过程中出现突然的脉冲式压力升高和下降。一旦掌握，若操作得当，该技术可在30分钟内完成。在实施该操作时，重要的是要注意尽量减少对膀胱的损伤，以保持组织的生理状态。通过该操作流程，还可以开展其他方法，例如单次循环充盈测压，以进一步探究膀胱功能容量相关问题。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过显微外科手术将导管植入小鼠膀胱，以及如何利用清醒状态下充盈性膀胱测压法评估小鼠下尿路功能。

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