Name: 档案福尔马林固定，石蜡包埋的人类口咽鳞状细胞癌样品中T细胞亚群的四色荧光免疫组织化学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 学习多色荧光免疫组织化学技术，用于口咽鳞状细胞癌中T细胞亚群的可视化与定量分析。该方法利用福尔马林固定石蜡包埋组织，帮助研究者评估肿瘤微环境中的免疫细胞分布及其与患者预后的关系。

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Simone Punt 获得了荷兰癌症协会资助项目（编号：UL2010-4801）的支持。我们谨向本 JoVE 实验方案所依据的原始论文的所有合著者致以诚挚感谢：Emilie A. Dronkers、Marij J. P. Welters、Renske Goedemans、Senada Koljenović、Elisabeth Bloemena、Peter J. F. Snijders、Arko Gorter 和 Sjoerd van der Burg。

患者样本的处理遵循荷兰生物医学科学学会联合会（www.federa.org）发布的《人体组织适当二次使用行为准则》中所述的医学伦理指南。
1. 准备载玻片
<ol>
	<li>在获得医学伦理委员会批准使用切除组织的许可后，从病理科获取切除的组织材料（任何类型的组织）。 
	注：本实验所用的治疗前肿瘤样本来自荷兰莱顿大学医学中心（Leiden University Medical Center, Leiden）于1970年至2011年间诊断的原发性口咽部肿瘤，样本选择方法如前所述（n = 162）13。组织大小仅需满足能在肿瘤内部可靠地获取4个显微图像所需的足够肿瘤组织量即可。</li>
	<li>将组织在4%中性缓冲福尔马林中固定至少12小时。使用梯度乙醇进行脱水处理。在二甲苯中清洗，然后使用自动组织处理机将组织包埋于石蜡中。</li>
	<li>使用切片机在载玻片上切取4 µm厚的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织切片。按照标准操作程序将组织包埋块放入切片机的组织夹持器中。
	<ol>
		<li>切取组织带，并将其置于盛有去离子水、温度为45 ºC的水浴表面。使用适用于免疫组织化学染色的载玻片，将玻片置于组织切片正下方的水中，轻轻以倾斜角度提起玻片，使切片脱离水面并牢固贴附于玻片上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将载玻片在37 °C下干燥过夜。</li>
	<li>通过将FFPE切片完全浸入新鲜的100%二甲苯中三次，每次5分钟，进行脱蜡处理。随后将切片依次浸入新鲜的100%乙醇、70%乙醇和50%乙醇中，每种浓度各两次，每次5分钟，以完成再水化处理。</li>
</ol>
2. 进行抗原修复
<ol>
	<li>将载玻片在去离子水中清洗 5 分钟。</li>
	<li>使用微波炉将三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液（10 mM Tris 加 1 mM EDTA，pH 9.0）加热至沸腾。将载玻片浸入预热的 EDTA 缓冲液中，并在微波炉中保持该温度 10 分钟，以进行抗原修复。 
	注意：可使用任何功率为 900 W 的微波炉。</li>
	<li>让载玻片在缓冲液中冷却 2 小时。</li>
</ol>
3. 染色组织切片
<ol>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤载玻片两次，每次5分钟。</li>
	<li>用疏水性笔在组织周围画一个圈，以防止稀释的抗体从载玻片上溢出。再用 PBS 洗涤一次；此步骤可选。</li>
	<li>将组织与一抗（抗-CD3 1:50、抗-FoxP3 1:200 和抗-IL-17 1:50）在含1%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）的PBS中稀释，室温孵育过夜。 
	注意：每张切片的液体体积取决于组织大小，通常为 50 - 150 µL。对于阴性对照切片，使用与 CD3、CD8 和 FoxP3 抗体相同稀释度、同一种属同型类别的特异性未知的抗体替代一抗。即， 兔Ig同型对照抗体、小鼠IgG1同型对照抗体和山羊IgG同型对照抗体</li>
	<li>用 PBS 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次。</li>
	<li>将组织与针对一抗物种和/或亚型的荧光标记二抗混合物共同孵育（即， 1:200 的驴抗山羊IgG Alexa 488、驴抗兔IgG A546 和驴抗小鼠A647，用含1% BSA的PBS稀释，在室温下孵育1小时。 
	注意：每张载玻片的液体体积取决于组织大小，通常为 50 - 150 µL。
	<ol>
		<li>加入二抗后，应将切片尽可能避光保存，可置于暗盒中或用铝箔包裹容器。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 组织切片的封片与复染
<ol>
	<li>将载玻片在PBS中清洗三次，每次5分钟。</li>
	<li>使用含核复染剂的水溶性抗荧光淬灭封片剂封片例如， DAPI）。尽快使用荧光显微镜分析载玻片（两周内）。分析前将载玻片置于4 °C避光保存。</li>
</ol>
5. 分析染色组织切片
<ol>
	<li>使用配备20-25倍物镜的荧光显微镜，对每张切片采集四幅图像。在切片所包含的整个肿瘤区域内随机选取位置拍摄图像，以获取具有代表性的肿瘤区域比例。 
	注意：应使用250倍的标准放大倍数。任何荧光或激光扫描显微镜均可使用，前提是其配备有用于观察所用荧光染料所需的滤光片和激光器。
	<ol>
		<li>为观察Alexa 488，使用490的激发最大值和525的发射最大值；为观察Alexa 546，使用556的激发最大值和573的发射最大值；为观察Alexa 647，使用650的激发最大值和665的发射最大值；为观察DAPI，使用358的激发最大值和461的发射最大值。</li>
		<li>将图像保存为图像文件（即， jpeg 和 tiff）格式，具体取决于用户所使用的软件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在咨询病理学家后，根据肿瘤上皮细胞与间质细胞的核形态和细胞形态，区分肿瘤上皮区域与肿瘤间质区域。
	<ol>
		<li>为确定间质的总面积，使用显微镜制造商提供的图像分析软件，在间质细胞（而非肿瘤细胞）所占据的所有区域周围绘制轮廓线，并记录其表面积。
		<ol>
			<li>点击 &#34;覆盖&#34; 图像下方的标签；选择 &#34;闭合多段线&#34; 形状并点击。通过在区域周围点击，直至回到起始点，来划定肿瘤上皮与间质区域之间的边界；此操作可获得该区域的测量值。 
			注意：一旦闭合图形，图形旁边将显示一个数字，表示所选图像的表面积（A = x µm2).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从总图像表面积（在图像属性中提供）中减去该表面积，以计算上皮表面积。通过在血管、坏死和自发荧光区域周围画线，记录所选区域的大小，并从上皮表面积中减去该值，以排除这些区域。</li>
		<li>将所有表面积数值保存在电子表格文件中，以计算每张载玻片的平均表面积和细胞数量。</li>
		<li>使用图像分析软件，通过检测四个通道的荧光信号，判断细胞为单阳性、双阳性或三阳性。
		<ol>
			<li>使用 ImageJ 对每张图像中的单阳性、双阳性和三阳性细胞进行计数。
			<ol>
				<li>下载 ImageJ。通过点击打开图像 &#34;文件&#34; 和 &#34;打开&#34; 并选择要分析的图像。右键点击 &#34;点工具&#34; （四个线条中间的一个红色方块），然后选择 &#34;多点工具&#34; 双击 &#34;多点工具&#34; 通过为每种细胞类型选择不同的计数编号，在图像中统计不同细胞类型的数量。 
				注意：根据每种细胞是否呈现一种、两种或三种荧光颜色来识别并计数所有不同类型的细胞。排除DAPI，因为这种细胞核复染剂存在于所有细胞中，仅用于区分肿瘤细胞与免疫细胞。每种细胞类型使用不同的计数器编号进行计数。在肿瘤上皮区和间质区中，每次选择不同的计数器编号，分别对各细胞类型的细胞数量进行单独计数。不要计数血管内或具有强烈自发荧光区域中的细胞。</li>
				<li>在电子表格文件中记录每张图像中每个计数区域所分析的细胞数量。</li>
				<li>将每种细胞类型的细胞总数除以所分析的肿瘤上皮和肿瘤间质的总面积。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 统计学分析
注意：所有统计分析均应与统计学家讨论，以确保数据质量。对于一般性统计分析，请参考任何一本医学统计学指南14。
<ol>
	<li>使用斯皮尔曼等级相关性 rho 检验分析细胞频率之间的相关性。</li>
	<li>使用Wilcoxon Mann-Whitney检验分析患者组间阳性细胞数量的统计学差异。</li>
	<li>检验细胞数量与无病生存期之间的相关性（即， 根据细胞数量的截断值将患者分组，采用Kaplan-Meier曲线法和对数秩检验分析从诊断至局部或远处复发、死亡或疾病进展的时间15.</li>
	<li>使用Cox比例风险回归分析进行多变量分析。</li>
</ol>

<ol><li>Westra, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+face+of+head+and+neck+cancer+in+the+21st+century%3A+the+impact+of+HPV+on+the+epidemiology+and+pathology+of+oral+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck+Pathol%22%5BJournal%5D)">The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer.</a> Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).</li>
<li>Rietbergen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+papillomavirus+detection+and+comorbidity%3A+critical+issues+in+selection+of+patients+with+oropharyngeal+cancer+for+treatment+De-escalation+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Human papillomavirus detection and comorbidity: critical issues in selection of patients with oropharyngeal cancer for treatment De-escalation trials.</a> Ann Oncol. 24 (11), 2740-2745 (2013).</li>
<li>Wallis, S. P., Stafford, N. D., Greenman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+immune+parameters+in+the+tumor+microenvironment+of+head+and+neck+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of immune parameters in the tumor microenvironment of head and neck cancers.</a> Head Neck. 37 (3), 449-459 (2015).</li>
<li>Ye, J., Livergood, R. S., Peng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+and+regulation+of+human+Th17+cells+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The role and regulation of human Th17 cells in tumor immunity.</a> Am J Pathol. 182 (1), 10-20 (2013).</li>
<li>Amedei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+analysis+of+pancreatic+cancer-infiltrating+T+lymphocytes+reveals+that+ENO-specific+Tregs+accumulate+in+tumor+tissue+and+inhibit+Th1%2FTh17+effector+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Ex vivo analysis of pancreatic cancer-infiltrating T lymphocytes reveals that ENO-specific Tregs accumulate in tumor tissue and inhibit Th1/Th17 effector cell functions.</a> Cancer Immunol Immunother. 62 (7), 1249-1260 (2013).</li>
<li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+regulatory+T+cells+%28Treg%29+regulating+in+cancer+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">What are regulatory T cells (Treg) regulating in cancer and why?</a> Semin Cancer Biol. 22 (4), 327-334 (2012).</li>
<li>Punt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angels+and+demons%3A+Th17+cells+represent+a+beneficial+response%2C+while+neutrophil+IL-17+is+associated+with+poor+prognosis+in+squamous+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Angels and demons: Th17 cells represent a beneficial response, while neutrophil IL-17 is associated with poor prognosis in squamous cervical cancer.</a> Oncoimmunology. 4 (1), e984539(2015).</li>
<li>Bamias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+differences+of+lymphocytes+isolated+from+ascites+of+patients+with+ovarian+cancer+compared+to+blood+and+tumor+lymphocytes.+Association+of+CD3%2BCD56%2B+cells+with+platinum+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Significant differences of lymphocytes isolated from ascites of patients with ovarian cancer compared to blood and tumor lymphocytes. Association of CD3+CD56+ cells with platinum resistance.</a> Gynecol Oncol. 106 (1), 75-81 (2007).</li>
<li>Gasparoto, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patients+with+oral+squamous+cell+carcinoma+are+characterized+by+increased+frequency+of+suppressive+regulatory+T+cells+in+the+blood+and+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Patients with oral squamous cell carcinoma are characterized by increased frequency of suppressive regulatory T cells in the blood and tumor microenvironment.</a> Cancer Immunol Immunother. 59 (6), 819-828 (2010).</li>
<li>Jordanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+leukocyte+antigen+class+I%2C+MHC+class+I+chain-related+molecule+A%2C+and+CD8%2B%2Fregulatory+T-cell+ratio%3A+which+variable+determines+survival+of+cervical+cancer+patients%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Human leukocyte antigen class I, MHC class I chain-related molecule A, and CD8+/regulatory T-cell ratio: which variable determines survival of cervical cancer patients?</a> Clin Cancer Res. 14 (7), 2028-2035 (2008).</li>
<li>van Esch, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+classical+and+nonclassical+HLA+expression+in+recurrent+and+progressive+HPV-induced+usual+vulvar+intraepithelial+neoplasia+and+implications+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Alterations in classical and nonclassical HLA expression in recurrent and progressive HPV-induced usual vulvar intraepithelial neoplasia and implications for immunotherapy.</a> Int J Cancer. 135 (4), 830-842 (2014).</li>
<li>Heeren, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+effect+of+different+PD-L1+expression+patterns+in+squamous+cell+carcinoma+and+adenocarcinoma+of+the+cervix%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prognostic effect of different PD-L1 expression patterns in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the cervix.</a> Mod Pathol. 29 (7), 753-763 (2016).</li>
<li>Punt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beneficial+tumor+microenvironment+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma+is+characterized+by+a+high+T+cell+and+low+IL-17%28%2B%29+cell+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">A beneficial tumor microenvironment in oropharyngeal squamous cell carcinoma is characterized by a high T cell and low IL-17(+) cell frequency.</a> Cancer Immunol Immunother. 65 (4), 393-403 (2016).</li>
<li>Kirkwood, B. R., Sterne, J. A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKirkwood%2C+BR+%22Essential+Medical+Statistics%22">Essential Medical Statistics</a>. , 2nd ed, Wiley-Blackwell. (2003).</li>
<li>Kleinbaum, D. G., Klein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKleinbaum%2C+DG+%22Survival+Analysis%3A+A+Self-Learning+Text%22">Survival Analysis: A Self-Learning Text</a>. , 2nd ed, Springer. (2005).</li>
<li>Fabre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Tumor+Microenvironment%3A+The+Protumor+Effects+of+IL-17+Related+to+Cancer+Type%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting the Tumor Microenvironment: The Protumor Effects of IL-17 Related to Cancer Type.</a> Int J Mol Sci. 17 (9), (2016).</li>
<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+imaging+of+formalin-fixed+tissue+predicts+ability+to+generate+tumor-infiltrating+lymphocytes+from+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma.</a> J Immunother Cancer. 3 (47), (2015).</li>
</ol>

作者声明不存在商业或财务利益冲突。

对于所述实验方案，最关键的步骤之一是确定所用一抗的合适稀释比例。标记二抗的稀释比例为1:200，这是由该特定Alexa标记抗体的制造商推荐的。一抗的稀释比例应通过系列稀释法确定，最好使用两种不同的目标组织样本（本例中为口咽鳞状细胞癌，OPSCC）。最佳工作稀释度是指在该稀释度下可获得清晰信号，无背景干扰，且在相同浓度下阴性对照无信号出现。根据可用显微镜类型及研究者的偏好，可对所用二抗类型和封片介质进行调整。如果未达到预期结果，我们建议检查所用载玻片的类型，因为某些载玻片已知会对特定染色液产生背景信号问题。例如， Perma Blue）。其次，某些抗原可能会因热诱导表位修复而遭到破坏，此时研究人员可采用其他技术替代缓冲液加热步骤，例如酶诱导表位修复。第三，若使用疏水笔标记，划线位置不应过于靠近组织，以免影响染色液的正常作用。关于每个样本所需的切片数量以及每张切片需采集的图像数量，应由研究人员根据具体研究问题决定，以确保具有足够的统计学效力。在本研究中，我们每个样本使用一张切片，每张切片采集四幅图像。最后，进行免疫荧光染色时，使用指甲油封固盖玻片需格外小心，因为指甲油溶液中的酒精可能影响荧光信号。
<p class...

口咽部鳞状细胞癌（OPSCC）是一组起源于口咽部的异质性鳞状细胞癌。OPSCC 的危险因素包括人乳头瘤病毒（HPV）感染以及酒精和烟草的使用1,2。免疫反应的作用及其在临床环境中的应用目前尚处于初步探索阶段。肿瘤微环境会浸润大量被吸引至肿瘤部位的免疫细胞。尽管高频率的 CD8+ 细胞毒性 T 细胞已被证实与 OPSCC 患者生存率的提高相关3，但其他 T 细胞亚群（如 Treg 细胞和 Th17 细胞）的作用仍不明确4。Th1 和 Th17 细胞被认为有助于针对肿瘤细胞的免疫应答，而 Treg 细胞则以其抑制其他 T 细胞活性的能力而著称5。然而，在不同类型的肿瘤中，Treg 细胞的存在已被发现既与有利的预后相关，也与不良预后相关6。由于并非所有存在于血液中的免疫细胞都能以相同程度浸润肿瘤，因此对局部肿瘤微环境的研究能够提供针对肿瘤免疫应答最可靠的评估指标。本研究旨在确定免疫细胞的数量和类型与临床结局之间的相关性。我们采用四色荧光免疫组化成像技术，分析人类 OPSCC 中多种 T 细胞亚群的数量及其定位情况。
我们重点关注了总T淋巴细胞（CD3+）、Th17细胞以及具有免疫抑制功能的FoxP3+调节性T细胞（Tregs），后者的分化途径与Th17细胞密切相关。Th17细胞的特征是同时表达CD3和IL-17。细胞因子IL-17也可由非T细胞产生7。我们分析了大量口咽鳞状细胞癌（OPSCC）病例中上皮内和间质中T细胞、Tregs、Th17细胞以及IL-17+非T细胞的分布情况，并探讨了这些细胞分布与患者生存之间的相关性。采用多色荧光免疫组化（IHC）技术，联合DAPI复染，检测CD3、Foxp3和IL-17的表达。该检测方法可清晰、简便地区分肿瘤细胞（通过DAPI核染色）和浸润的T细胞亚群（通过多种标记物组合）。在完成样本制备和染色后，使用荧光显微镜及成像软件分离不同的荧光信号，进而确定肿瘤上皮区和肿瘤相关间质区中各类细胞的数量和类型。
另一种用于定量和表型分析免疫细胞群体的方法是对肿瘤或外周样本（例如，血液或腹水）进行流式细胞术分析，或飞行时间质谱流式细胞术（CyTOF）分析。使用该技术时，有关不同类型细胞的空间定位及其相对分布的所有信息均会丢失。此外，对外周样本的使用和分析也无法提供关于哪些细胞能够浸润肿瘤微环境的信息。已有研究表明，血液和腹水中的免疫细胞分析结果并不能反映肿瘤组织中免疫细胞浸润的表型特征和频率8,9。
另一种选择是使用明场显微镜。与荧光成像相比，该技术的优势在于不存在组织自发荧光。尽管某些样本含有较强的自发荧光——尤其是红细胞，也包括中性粒细胞等其他细胞类型——但在几乎所有样本的分析过程中，这些区域均可被轻松去除。免疫荧光技术的优势在于可通过一组特异性荧光波长，在同一样本中同时分析多个标记物。由于针对特定抗原的标签种类不足，以及 commercially available 抗体同种型有限，目前明场显微镜尚无法在同等程度上实现多标记分析。
本文所述的多色荧光免疫组化技术已用于多种不同癌症类型和抗体组合，以研究不同的免疫细胞群体以及肿瘤细胞表达的分子，例如人类白细胞抗原（HLA）和PD-L110,11,12。该方案已采用多种不同类型的样本和抗体进行建立和验证。

<table><tbody><tr><td>Pathos Delta 超快速组织处理仪</td><td>Milestone 和 Histostar</td><td></td><td>全自动组织处理仪</td></tr><tr><td>Histostar</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>组织包埋机</td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超纯水（milliQ 水）</td><td>Elaga Purelab Chorus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>石蜡/Paraclean</td><td>Klinipath</td><td>5079A</td><td></td></tr><tr><td>切片机组织夹持器</td><td>Leica</td><td>RM225</td><td></td></tr><tr><td>Flex IHC 侧向切片仪</td><td>Dako</td><td></td><td>组织切片</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merk-Milipore</td><td>1,083,821,000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Baker</td><td>1073</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Bio-Rad</td><td>BUF036A</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 CD3 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab828</td><td>需滴定确定最佳抗体稀释度</td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 抗 FoxP3 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab20034</td><td>需滴定确定最佳抗体稀释度</td></tr><tr><td>山羊 IgG 抗 IL-17 抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF-317-NA</td><td>需滴定确定最佳抗体稀释度</td></tr><tr><td>兔 Ig 同型对照抗体</td><td>Abcam</td><td>ab27472</td><td>使用浓度应与抗 CD3 抗体终浓度相同</td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 同型对照抗体</td><td>Abcam</td><td>ab91353</td><td>使用浓度应与抗 FoxP3 抗体终浓度相同</td></tr><tr><td>山羊 IgG 同型对照抗体</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-6202</td><td>使用浓度应与抗 IL-17 抗体终浓度相同</td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG A546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10040</td><td>用 1% BSA/PBS 稀释至 1:200</td></tr><tr><td>驴抗小鼠 A647</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A31571</td><td>用 1% BSA/PBS 稀释至 1:200</td></tr><tr><td>驴抗山羊 IgG A488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11055</td><td>用 1% BSA/PBS 稀释至 1:200</td></tr><tr><td>含 DAPI 的 VectaShield 封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>LSM700 共聚焦激光扫描显微镜&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 物镜</td><td>Zeiss</td><td>420852-9972-720</td><td></td></tr><tr><td>LSM Zen 软件</td><td>Zeiss</td><td>版本 2009</td><td></td></tr><tr><td>LSM 图像浏览器</td><td>Zeiss</td><td>版本 4.2.0.121</td><td>可从 www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html 下载。</td></tr><tr><td>SPSS</td><td>IBM Corp.</td><td>版本 20.0</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>版本 1.50i</td><td>可从 http://rsb.info.nih.gov/ij 下载。</td></tr></tbody></table>

石蜡包埋福尔马林固定人咽部鳞状细胞癌样本中t细胞亚群的四色荧光免疫组织化学检测

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

四色荧光免疫组织化学（IHC）技术是一种在考虑目标细胞群相对分布及其在组织中定位的前提下，对其进行定量分析的方法。该技术已被广泛应用于研究多种肿瘤类型中的免疫浸润情况。肿瘤微环境会受到被吸引至肿瘤部位的免疫细胞的浸润。不同的免疫细胞亚群在肿瘤微环境中发挥着不同的作用，并对疾病的预后产生不同的影响。本文以口咽鳞状细胞癌（OPSCC）为例，描述了多参数荧光IHC技术的应用。该技术也可推广至其他组织样本及感兴趣的细胞类型。在本研究中，我们分析了一个较大的OPSCC队列（n = 162）的上皮内和间质区室。我们重点关注了总T淋巴细胞（CD3+）、具有免疫抑制功能的调节性T细胞（Tregs；即 FoxP3+）以及T辅助17（Th17）细胞（即 IL-17+CD3+），并使用核复染标记以区分肿瘤上皮与间质。研究发现，当肿瘤内IL-17+非T细胞数量较少时，T细胞数量较多与患者无病生存期的延长显著相关。这提示IL-17+非T细胞可能与OPSCC中较差的免疫应答相关，这一结果与既往报道的IL-17与癌症患者不良预后之间的关联一致。目前，新型多参数荧光IHC技术正在发展之中，可同时使用多达7种不同的荧光染料，从而实现对肿瘤微环境中免疫细胞更精确的表征与定位。

1970年至2011年间，从荷兰莱顿大学医学中心诊断的原发性口咽肿瘤中获取的一系列福尔马林固定石蜡包埋预处理肿瘤样本（n = 162），按照先前描述的方法进行选择，并采用所述方案进行染色。13每张切片随机选取1至4个图像进行分析（图1）。图中指示了一些自发荧光细胞，其完全呈黄色，可被清晰区分。真正双阳性或三阳性的细胞仅在预期位置（此例中为细胞膜或细胞核）对特定抗体呈现阳性染色。阴性对照切片未显示任何超出背景组织自发荧光的特异性染色图2 和 图 4)，证实所有信号均特异性地来自初级抗体所识别的目标。所有肿瘤样本均发现有CD3浸润+ T细胞在不同程度上。FoxP3+ Tregs 始终表达 CD3，是浸润性 T 细胞群中的主要亚群之一。表达 IL-17 的 CD3 细胞（Th17 细胞）仅占浸润性 T 细胞中的...

多参数荧光免疫组织化学可用于评估肿瘤微环境中免疫细胞群体的数量、相对分布及定位情况。本文描述了利用该技术分析口咽癌中T细胞亚群的方法。

石蜡包埋福尔马林固定人咽部鳞状细胞癌样本中T细胞亚群的四色荧光免疫组织化学检测

四色荧光免疫组织化学（IHC）技术是一种在考虑目标细胞群体空间分布的同时，对其进行定量分析的方法……

本实验的总体目标是对口咽鳞状细胞癌样本的存档福尔马林固定石蜡包埋组织切片进行多种颜色的免疫组织化学染色，以可视化并计数不同T淋巴细胞亚群。该方法有助于回答肿瘤免疫学领域的关键问题，例如：肿瘤组织中浸润的免疫细胞亚群与患者预后之间是否存在关联。利用该技术，可在同一组织切片中同时可视化多个生物标志物。该技术的应用前景涉及癌症治疗，因为同时评估多种免疫细胞或免疫相关因子可能有助于针对特定免疫疗法的患者分层。首先使用微型刀片获取四微米厚的福尔马林固定石蜡包埋组织切片，在获得组织条带时将其铺展于45摄氏度的去离子水浴表面。为捕获切片，将一张玻片置于水下组织样本正下方，并小心地以一定角度将玻片向上提起。当载玻片从水中取出时，该切片将附着在玻璃表面。在37摄氏度下过夜干燥样本后，用100%二甲苯对组织进行脱蜡处理，共浸入三次，每次五分钟。当切片完成脱蜡后，使用梯度递减的乙醇溶液进行三次浸入，使组织样本重新水化。随后用去离子水洗涤五分钟。然后将样品置于微波炉中，在沸腾的EDTA缓冲液中孵育10分钟，并让载玻片在缓冲液中冷却两小时。如需标记目标抗原，用PBS缓冲液洗涤两次，每次五分钟。第二次洗涤后，将组织与用含1%牛血清白蛋白的PBS稀释的一抗和目标物在室温下孵育过夜。次日早晨，用PBS冲洗切片三次，每次五分钟，然后将样品与用含1%血清的PBS稀释的相应二抗在室温下孵育一小时。孵育结束后，按前述方法用PBS洗涤载玻片三次，并使用含有核复染剂的水性抗荧光淬灭封片剂封片。为分析样品，首先在荧光显微镜上选择 20 至 25 倍物镜，使用针对二抗和复染的适当滤光片，每张玻片采集四幅图像。获取图像后立即保存。接着，在相应的图像分析软件中打开首幅目标图像，点击叠加选项卡。选择闭合的多段线形状以划定感兴趣区域的边界。当形状闭合后，测量的表面积将显示在感兴趣区域旁边。将所有表面积数据保存至电子表格文件中，用于计算每张切片的平均表面积和声音数量。将图像导出为可在ImageJ中打开的TIFF或JPG文件。然后，在ImageJ中打开第一个感兴趣图像，并在插件菜单下选择细胞计数器。接着，点击初始化，点击“类型一”，并逐一点击所有指定为类型一的细胞。为每种细胞类型选择不同的类别，根据荧光染料的表达情况对图像中不同类型细胞的数量进行计数。最后，在电子表格文件中记录每幅图像在各个计数区间内分析的细胞数量。在此代表性实验中，从1970年至2011年间在莱顿大学医学中心诊断的原发性口咽部肿瘤福尔马林固定石蜡包埋治疗前样本系列中，随机选取四幅图像中的一幅进行分析，这些样本的制备方法如前所述。在此实验样本中，观察到一些自发荧光细胞，其特征为完全呈黄色，而阴性对照切片未显示超出背景组织自发荧光的任何特异性染色。所有肿瘤样本均被确定有数量不等的 foxp3 阳性、CD3 阳性 T 细胞浸润，仅有少量 T 细胞亚群表达 IL-17。来自总浸润 CD3 阳性 T 细胞数量较多患者的样本，与疾病无复发生存期改善之间呈现出相关趋势，而 T 细胞数量较少的患者样本则无此趋势。此外，在 IL-17 阳性细胞数量较少的样本中，大量总的浸润性 T 细胞也与改善的无病生存期相关，提示在口咽鳞状细胞癌中，有效的肿瘤浸润性 T 细胞可能与 IL-17 阳性细胞数量较少有关。一旦掌握，这些样本制备步骤可在每次染色过程中最多处理 25 张载玻片，耗时一天半。必须彻底脱蜡，否则会产生较强的背景信号。该技术问世后，为病理学和免疫学领域的研究人员开辟了新的途径，可用于探索不同免疫细胞亚群定位的微环境。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在单个存档组织切片中对多种蛋白质和细胞类型进行可视化观察。请务必注意，操作筒仓非常危险，您应始终在通风柜中进行操作。

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癌症研究

档案福尔马林固定，石蜡包埋的人类口咽鳞状细胞癌样品中T细胞亚群的四色荧光免疫组织化学

本文介绍一种利用定量免疫荧光、图像分析及异质性统计度量方法，在肿瘤组织病理切片中量化分子异质性的技术。该方法适用于临床生物标志物的开发与分析。...

肿瘤中蛋白质表达异质性的定量免疫荧光图谱绘制

本研究优化并实施了一种六重标志物多重免疫荧光检测方案，采用自动化染色仪以获得更一致的结果并缩短操作时间。该方法可被任何实验室直接应用于免疫肿瘤学研究。...

用于福尔马林固定癌组织样本免疫肿瘤学研究的自动化多重免疫荧光检测 panel

人乳头瘤病毒（HPV）RNA 色原原位杂交被认为是检测肿瘤内活性人乳头瘤病毒感染的金标准之一。该方法可实现对 HPV E6-E7 mRNA...

染色原位杂交作为人乳头瘤病毒相关头颈部癌症诊断的工具

本文介绍一种简单且易于实施的策略，用于对福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织切片中的免疫细胞进行可视化、定量和定位分析。该方法结合了现有的成像技术和数字分析手段，旨在拓展成像检测的多重检测能力和多参数分析水平。...

肿瘤微环境中免疫细胞群体的可视化、定量与定位分析

我们介绍一种对冷冻组织进行多光谱成像的快速染色方法。...

一种用于冷冻组织切片多光谱荧光成像的快速方法

在癌症免疫治疗时代，人们对阐明肿瘤微环境动态的研究兴趣显著增加。本方案详细介绍了质谱成像技术的染色和成像步骤，可实现高度多重的空间分析。...

利用质谱成像技术分析福尔马林固定石蜡包埋组织样本以拓展对肿瘤微环境的理解

本实验方案描述了一种RNA荧光原位杂交方法，用于定位人骨肉瘤细胞中的长链非编码RNA（lncRNA）。...

RNA 荧光 原位 杂交法用于长链非编码 RNA 在人骨肉瘤细胞中的定位

本实验方案描述并优化了一种多重免疫组织化学（IHC）染色方法，主要通过优化单通道抗体孵育条件，并调整抗体与通道的设置，以解决来源于临床肺癌组织中的自发荧光和通道串扰问题。...

多重免疫组织化学染色法用于石蜡包埋的肺癌组织

多重循环免疫组织化学技术能够 原位...

多重循环荧光免疫组织化学

本报告介绍了一种在自动化载片染色机上进行多重免疫荧光（mIF）检测的自动化方案。该方案展示了在标准高通量组织自动染色机和全片荧光成像系统上实现空间蛋白质组学的高度可重复性，非常适合在转化研究中对大量组织切片进行定制化的mIF检测。...

用于转化研究的高通量自动化多重免疫荧光检测方法

学习多色荧光免疫组织化学技术，用于口咽鳞状细胞癌中T细胞亚群的可视化与定量分析。该方法利用福尔马林固定石蜡包埋组织，帮助研究者评估肿瘤微环境中的免疫细胞分布及其与患者预后的关系。

石蜡包埋福尔马林固定人咽部鳞状细胞癌样本中T细胞亚群的四色荧光免疫组织化学检测

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