档案福尔马林固定，石蜡包埋的人类口咽鳞状细胞癌样品中T细胞亚群的四色荧光免疫组织化学

本实验的总体目标是对口咽鳞状细胞癌样本中存档福尔马林固定石蜡包埋组织切片中的各种 T 淋巴细胞亚群进行多色免疫组织化学可视化和计数。这种方法可以帮助回答免疫肿瘤学领域的关键问题，例如，肿瘤组织浸润免疫细胞亚群与患者预后之间是否存在联系。使用这种技术，您可以在一个组织切片中可视化多个生物标志物。

该技术的意义延伸到癌症治疗，因为同时评估多个免疫细胞或免疫相关因素可能有助于患者对特定免疫疗法进行分层。首先使用微舌获得四微米厚的福尔马林固定石蜡包埋的组织切片，在获得组织带时将组织带铺在 45 摄氏度的去离子水浴表面上。要捕获切片，请将载玻片放入水中，直接位于组织样本下方，然后小心地将载玻片向上倾斜。

当滑梯从水中抬起时，该部分将粘附在玻璃表面。在 37 摄氏度下干燥样品过夜后，在 100% 二甲酚中完全浸泡 3 次，每次 5 分钟，使组织脱蜡。当切片完成脱蜡后，用 3 次下降乙醇浸泡对组织样品进行再水化。

然后用去离子水洗涤 5 分钟。然后，将样品浸入沸腾的 EDTA 缓冲液中，在微波炉中浸泡 10 分钟，让玻片在缓冲液中冷却 2 小时。要标记目标抗原，请用两次 5 分钟的 PBS 洗涤液冲洗样品。

第二次洗涤后，将组织与一抗和兴趣在室温下用 1% 牛血清白蛋白的 PBS 溶液稀释孵育过夜。第二天早上，用 3 次 5 分钟的 PBS 洗涤液冲洗切片，并将样品与用 1% 血清的 PBS 溶液稀释的适当二抗在室温下孵育 1 小时。在孵育结束时，如刚才所示，在 PBS 中洗涤载玻片 3 次，并使用含有核复染剂的水性抗淬灭封固剂封固载玻片。

要分析样品，首先在荧光显微镜上选择 20 至 25 倍物镜，并使用适当的二抗和复染滤光片每张载玻片捕获四张图像。在获取图像时保存图像。接下来，在相应的图像分析软件中，打开第一张感兴趣的图像，然后单击叠加选项卡。

选择闭合多边形线形状以取消对感兴趣区域的边界进行选框。当形状闭合时，测量的表面积将出现在感兴趣区域旁边。将所有表面积数据保存在电子表格文件中，以计算每张幻灯片的平均表面积和声音编号。

将图像导出为 TIFF 或 JPG 文件，以便在 ImageJ 中打开。然后，在 ImageJ 中，打开第一个感兴趣的图像并在插件菜单下选择细胞计数器。然后，单击初始化，单击类型 1 并单击指定为类型 1 的每个单元格。

为每种细胞类型选择不同的类型，以根据荧光染料表达计算图像中不同类型细胞的数量。最后，在电子表格文件中记录每个图像的每个计数器箱中分析的细胞数。在这个具有代表性的实验中，分析了从一系列福尔马林固定石蜡包埋的治疗前肿瘤样本中获得的四个随机图像，这些样本来自 1970 年至 2011 年间在莱顿大学医学中心诊断的原发性口咽肿瘤，这些样本的制备如刚刚所示。

在该实验样品中，观察到一些自发荧光细胞，其特征是其完全黄色的外观，而阴性对照玻片在背景组织自发荧光之上没有表现出任何特异性染色。确定所有肿瘤样本均被不同数量的 fox p3 阳性、CD3 阳性 T 细胞浸润，其中只有一个小 T 细胞亚群表达 IL-17。与低 T 细胞成员的患者样本相比，来自总浸润 CD3 阳性 T 细胞数量较高的患者的样本显示出与无病生存率提高相关的趋势。

此外，在 IL-17 阳性细胞数量较少的样本中，高数量的总浸润 T 细胞也与无病生存率的提高相关，这表明口咽鳞状细胞癌中有效的肿瘤浸润 T 细胞可能与存在的 IL-17 阳性细胞数量少有关。一旦掌握，这些样品制备步骤可以在一天半内完成，每次染色最多 25 张玻片。对样品进行去伪泛化非常重要，否则你会得到很多背景。

开发后，这项技术为病理学和免疫学领域的研究人员铺平了道路。用于探索各种免疫细胞亚群定位的微环境。观看此视频后，您应该对如何在单个存档组织切片中可视化各种蛋白质和细胞类型有很好的了解。

不要忘记，使用筒仓工作是非常危险的，您应该始终在流动柜中工作。