一种眼组织中效应记忆T细胞增加的慢性自身免疫性干眼大鼠模型

本实验的总体目标是通过皮下免疫结合结膜下及泪腺内注射泪腺提取物，在大鼠中诱导出类似临床上泪液功能障碍和泪腺炎症的表现，以用于评估自身免疫性干眼病的治疗方法。该方法有助于回答干眼病研究中的关键问题，例如在自身免疫性疾病中抑制T细胞的药物是否具有疗效。该技术的主要优势在于，它能够产生类似于人类干眼病的眼部疾病体征，并可定量检测浸润泪腺及眼部的T细胞。

该动物模型的意义在于有助于理解淋巴细胞迁移，因为可以对脾脏和淋巴结进行研究。通常，初次接触该方法的研究者会面临困难，原因是缺乏合适的仪器来记录大鼠小眼球内的变化。由于大鼠眼球在麻醉后干燥迅速且缺乏眨眼反射，某些操作步骤难以掌握，因此对该方法的直观演示至关重要。

按照文本方案实施安乐死之后，将一只雌性Sprague Dawley大鼠平放，使一侧耳朵紧贴桌面，另一侧朝上。使用剪刀在暴露的耳朵下方沿头尾方向做一个10毫米的切口。随后，从周围结缔组织及排泄导管中仔细解剖分离，取出泪腺。

接下来，使用剪刀在冰上将组织尽可能充分地剪碎。然后，每份泪腺组织中加入 150 µL 含 1× 蛋白酶抑制剂的 PBS。将超声破碎仪设置为开启 10 秒、关闭 10 秒、振幅 30%，在冰上以 20 kHz 超声处理样品 5 分钟。

然后，在 13,000 × g 条件下于 4 °C 离心超声处理后的样品 20 分钟。将上清液转移至新管中。随后将上清液分装至 1.5 mL 离心管中，并于 -80 °C 保存。

将含有5毫克/毫升结核分枝杆菌H37Ra的完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂转移至50毫升离心管中，确保佐剂与抗原混合物的体积比为1:1。在涡旋振荡（转速调至不引起液体溅出的最高档）的同时，逐滴加入含有2毫克/毫升卵清蛋白和10毫克/毫升泪腺提取物的抗原混合液。待全部抗原加入后，继续涡旋振荡5分钟。

将乳剂转移至一个5毫升注射器中，并使用注射器连接器将其与另一个5毫升注射器连接。然后将乳剂在两个注射器之间来回推注，以充分混匀。在第0天，将含有1毫克泪腺提取物和200微克卵清蛋白的200微升乳剂（溶于完全弗氏佐剂中）分装至1毫升鲁尔锁扣注射器中，并为每个注射器安装27号针头。

在不使用麻醉的情况下，将乳剂皮下注射至大鼠尾根部。随后在第14天，以相同方式注射200微升含不完全弗氏佐剂的相同抗原。同一天，腹腔注射300纳克百日咳毒素溶于100微升PBS中的溶液。

第48天，称取所需量的卵清蛋白并将其溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中。随后，将卵清蛋白与本视频先前制备的解冻泪腺提取物混合，制备含有1毫克/毫升卵清蛋白和1毫克/毫升泪腺提取物的抗原溶液。麻醉大鼠后，向眼部穹隆部结膜下注射5微升抗原溶液。

然后，向泪腺注射 20 微升抗原。按照文本方案固定一只麻醉大鼠，使用一对镊子夹住酚红线，另一对镊子拉开大鼠的下眼睑，以测量泪液体积。将线置于下穹窿的近端角落处 1 分钟，然后取出线。

然后，将线置于带有毫米刻度的直尺旁，拍摄线的湿润部分的长度图像。为测量角膜泪膜的光滑度，将大鼠置于配备环形照明器和相机的体视显微镜下，随后向大鼠角膜滴加5 µL生理盐水。

戴手套的手指通过被动眨眼，上下眼睑轻轻活动约五次，以使生理盐水均匀分布。在1.6倍放大条件下，将环形照明器对准角膜表面中央。随后，等待10秒后拍摄照片图像。

使用荧光素扫描法检测角膜损伤：向大鼠角膜滴加两微升0.2%荧光素。戴手套的手指轻轻被动开闭大鼠眼睑三次，使荧光素染料均匀分布于眼球表面。一分钟后，用三毫升注射器抽取一毫升生理盐水。

然后，将注射器置于角膜前方约2至3毫米处，轻柔地向眼部滴加生理盐水。关闭背景光源后，在裂隙灯显微镜的钴蓝滤光片下采集图像。根据文本方案实施安乐死后，使用剪刀去除大鼠的上眼睑和下眼睑。

切断眼外肌、视神经和穹隆部结膜，游离眼球。切开眼球以打开球壁。在玻璃体中取出晶状体。

然后，将解剖得到的眼球置于冰上的 1.5 毫升离心管中。最后，按照本视频前面所述方法收集泪腺。该图显示了对照组和干眼症（DED）大鼠酚红棉线试验的代表性图像。

DED 组酚红线的长度短于对照组，表明泪液量较少。荧光素可结合受损的角膜上皮，因此用于评估损伤程度。在本实验中，对 DED 大鼠角膜表面的荧光素染色斑点进行 0 至 2 级评分，并与对照组大鼠进行比较。

与对照组大鼠相比，干眼症（DED）大鼠的荧光素染色更明显，提示存在角膜损伤。如图所示，若角膜表面光滑且泪膜稳定性高，则眼表上的照明环图像呈完整圆形。图像出现畸变表明角膜光滑度下降及泪膜不稳定，而DED组大鼠的图像畸变程度更高。

该流式细胞术分析显示，正常大鼠眼球组织中主要的T细胞亚群为效应记忆T细胞。在干眼病（DED）大鼠的眼球中，约70%的CD3阳性T细胞为效应记忆T细胞，而在对照组大鼠中，该比例约为50%。DED大鼠眼球中的效应记忆T细胞数量显著高于对照组大鼠。在完成该实验步骤后，可对其他类型的免疫细胞进行染色，以回答更多科学问题。

例如，您可以对先天免疫细胞或B淋巴细胞进行染色。该技术开发后，为研究人员理解眼表免疫学以及进一步研究人类干眼症和干燥综合征铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在大鼠中诱导自身免疫性干眼症，并对实验结果进行可靠的记录。