慢性自身免疫性干眼鼠模型增加效应记忆T细胞在眼球组织

该程序的总体目标是使用皮下免疫和结膜下和泪腺注射泪腺提取物诱导大鼠泪腺功能障碍和泪腺炎症的临床特征，以评估自身免疫性干眼症的治疗。这种方法可以帮助回答干眼症的关键问题，例如抑制自身免疫性疾病中 T 细胞的药物是否有效。这项技术的主要优点是，它会产生类似于人类干眼症的眼部疾病迹象，并且还可以量化浸润泪腺和眼睛的 T 细胞。

这种动物模型的影响延伸到了解淋巴细胞运输，因为可以研究脾脏和淋巴结。通常，由于缺乏合适的仪器来记录小大鼠眼睛的变化，新接触这种方法的个体会很挣扎。这种方法的视觉演示至关重要，因为由于大鼠眼睛的快速干燥和麻醉后缺乏眨眼，某些步骤很难学习。

根据文本协议对雌性 Sprague Dawley 大鼠实施安乐死后，将动物平放，一只耳朵靠在桌子上，另一只耳朵朝上。用一把剪刀在裸露的耳朵下方上下切开 10 毫米。然后，通过从周围的结缔组织和引流管中解剖泪腺来去除泪腺。

接下来，用剪刀在冰上将组织尽可能细碎。然后，每个泪腺加入 150 μL 含 1X 蛋白酶抑制剂的 PBS。将超声仪设置为 10 秒开启、10 秒关闭和 30% 振幅，在 20 kHz 的冰上对样品进行 5 分钟的超声处理。

然后，将超声处理的样品在 13， 000 倍 g 和 4 摄氏度下离心 20 分钟。将上清液转移到新试管中。然后，将上清液分装到 1.5 毫升试管中，并储存在零下 80 摄氏度。

每毫升含有 5 毫克结核分枝杆菌 H37Ra 的完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂转移到 50 毫升管中，确保抗原混合物的佐剂体积呈一比一的比例。将含有 2 毫克/毫升卵清蛋白和 10 毫克/毫升泪腺提取物的抗原混合物逐滴加入佐剂溶液中，同时以不会导致溢出的最高速度涡旋。添加所有抗原后，继续涡旋 5 分钟。

将乳剂转移到 5 毫升注射器中，并使用注射器连接器将其与另一个 5 毫升注射器连接。然后，将乳剂从一个注射器推到另一个注射器进行混合。在第 0 天，将 200 微升乳剂（含有 1 毫克泪腺提取物和 200 微克卵清蛋白的完全弗洛伊德佐剂）分配到 1 毫升鲁尔锁注射器中，并为注射器配备 27 号针头。

在不使用麻醉的情况下，皮下注射大鼠尾巴基部的乳剂。然后，在第 14 天，以类似的方式，在不完全的弗氏佐剂中注射 200 微升相同的抗原。同一天，腹膜内注射 300 ng百日咳毒素，溶于 100 μL PBS 中。

在第 48 天，称取所需量的卵清蛋白并将其溶解在 PBS 中。然后，将卵清蛋白与本视频前面制备的解冻泪腺提取物混合，制成每毫升含有 1 毫克卵清蛋白和每毫升 1 毫克泪腺提取物的抗原溶液。麻醉大鼠后，将 5 微升抗原注射到眼睛的穹窿结膜下膜中。

然后，将 20 微升抗原注射到泪腺中。根据文本协议握住麻醉的大鼠，要用酚红线测量泪液量，使用一对镊子固定线，另一对拉动大鼠的下眼睑。将线放在下穹窿的近端角一分钟，然后取下线。

然后，将线放在带有毫米标记的尺子旁边，并拍摄线的润湿部分的长度图像。为了测量角膜撕裂的光滑度，将大鼠置于配备环形照明器和相机的立体显微镜下。然后，在大鼠角膜上涂抹 5 微升生理盐水。

戴手套的手指，被动地眨眼，将上下眼睑移动约 5 次以涂抹盐水。在 1.6 倍放大倍率下，将环形照明器聚焦在角膜表面的中间。然后，在 10 秒后，获取摄影图像。

使用荧光素扫描通过向大鼠角膜中添加两微升 0.2% 荧光素来测量角膜损伤。用戴手套的手指，被动地打开和关闭大鼠眼睑 3 次，将荧光素染料涂抹在眼睛表面。一分钟后，使用 3 毫升注射器抽取 1 毫升生理盐水。

然后，将注射器放置在角膜前方约 2 到 3 毫米处，轻轻地将生理盐水涂抹在眼睛上。关闭背景灯，在目测成像显微镜的钴蓝色滤光片下采集图像。根据文本协议对大鼠实施安乐死后，用剪刀去除上下眼睑。

通过切断眼外肌、视神经和穹窿结膜来释放眼球。做一个切口，打开眼球。取下玻璃体晶状体。

然后，将解剖的眼球放入冰上的 1.5 毫升试管中。最后，按照本视频前面所述收集泪腺。该图显示了来自对照和 DED 大鼠的酚红线的代表性图像。

DED 组中酚红线的长度短于对照组，表明泪液量较小。荧光素与受损的角膜上皮结合，因此用于测量损伤程度。在本实验中，将 DED 大鼠角膜表面的荧光素斑点从 0 到 2 分级，并与对照大鼠进行比较。

患有 DED 的大鼠比对照大鼠有更多的荧光素染色，表明角膜损伤。如图所示，如果角膜表面光滑且泪液稳定性高，则眼表上的照明环图像是圆润完美的。图像失真表明角膜光滑度降低和泪膜不稳定，正如在 DED 组中观察到的更高的失真程度。

该流式细胞术分析表明，正常大鼠眼球组织中的主要 T 细胞亚群是效应记忆 T 细胞。在 DED 大鼠的眼球中，大约 70% 的 CD3 阳性 T 细胞是效应记忆 T 细胞，而在对照大鼠中，这个数字约为 50%DED 大鼠的眼球具有明显高于对照大鼠的效应记忆 T 细胞。按照此程序，可以对其他种类的免疫细胞进行染色以回答其他问题。

例如，您可以对先天免疫细胞或 B 淋巴细胞进行染色。开发后，这项技术为研究人员了解眼表免疫学以及进一步研究人类干眼症和干燥综合征铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何诱导大鼠自身免疫性干眼症并对结果进行有力的记录有一个很好的了解。