电压钳荧光法在 非洲爪蟾 利用荧光非天然氨基酸研究卵母细胞

本实验的总体目标是将一种荧光非天然氨基酸引入在非洲爪蟾卵母细胞中表达的膜蛋白，并同时利用电压钳荧光法测定该蛋白的功能及其结构重排。该技术将有助于解答膜蛋白结构与功能关系领域的关键科学问题。通过电压钳荧光法，我们能够直接将结构重排与蛋白功能相关联。

引入荧光非天然氨基酸标记有助于克服以往标记技术的局限性，这些问题曾包括标记位点的可及性以及由于内源性结合位点导致的背景标记。该技术的应用意义在于能够更深入地理解膜蛋白的生物物理特性，因为现在可以探测此前利用传统电压钳荧光法难以触及的蛋白结构域。

切除非洲爪蟾卵母细胞后，用 SOS 溶液清洗卵母细胞三次。逐个挑选体积大且状态健康的卵母细胞，并在添加抗生素和 5% 马血清的 Barth 溶液中于 18 摄氏度下孵育至少四小时，然后再进行注射。进行 DNA 核注射时，需制备细长的注射针尖，以便能够到达细胞核且不损伤卵母细胞。

然后，用油填充注射尖端，并将注射尖端安装到纳米注射仪装置上。接着，将纳米注射仪安装在体视显微镜下，用镊子折断尖端末端。之后，排出油液，直至尖端末端无残留气泡。

随后，在体视显微镜下，将1微升浓度为0.1微克/微升的pAnap溶于无核酸酶水的溶液滴加至一片Parafilm上，并用该溶液填充注射针尖。然后，将卵母细胞转移至含有网格的注射培养皿中，该培养皿内盛有添加了抗生素的Barth溶液。由于卵母细胞的细胞核位于动物极，应将注射针尖对准动物极中心位置刺入，使针尖到达动物半球近中心区域。

接下来，向每个卵母细胞的细胞核内注射 9.2 纳升的 pAnap 溶液。随后，将卵母细胞在含有抗生素和 5% 马血清的 2 毫升巴氏溶液中，于 18 摄氏度孵育 6 至 24 小时，以促进 Anap 特异性 tRNA 和 tRNA 合成酶的高效表达。现在，再次准备纳米注射仪，但此次注射尖端无需像 DNA 注射时那样细。

从此步骤开始，仅在红光下操作，以防止Anap发生光漂白。取1微升1毫摩尔的Anap与1微升浓度为1至2微克/微升的mRNA，在Parafilm膜上直接混合，并用该混合液填充注射针尖。将针尖刺入卵母细胞植物极膜下方，向每个注射pAnap的卵母细胞中注入46纳升混合液。

随后，将卵母细胞放入避光盒中或用铝箔包裹容器，以避免光照。在含有抗生素和5%马血清的Barth溶液中，于18°C条件下孵育2至3天。每天更换新鲜的Barth溶液，并移除死亡的卵母细胞，以防污染。

在此装置中，切开式电压钳设备已整合到荧光显微镜系统中。记录室安装在一个滑轨上，可在用于放置卵母细胞的标准体视显微镜和用于进行荧光检测的显微镜之间移动。光电二极管检测系统连接至荧光显微镜的C型接口输出端口，光电流读数则连接至数字信号处理器的第二个输入通道。

使用一个100瓦、12伏的卤素灯作为荧光激发的光源。激发光通过位于激发光源与显微镜之间的机械快门进行控制。快门的开启由来自数字信号处理器的TTL脉冲触发，该脉冲在记录软件中定时，使快门在记录开始前约100毫秒打开，同时需要在滤光片转轮中配置合适的滤光片组。

进行双色VCF实验时，在记录前立即用含5 µM TMR马来酰亚胺的标记溶液孵育制备好的卵母细胞15分钟。然后用标记溶液洗涤卵母细胞三次，以去除多余的染料后再进行记录。此时，蛋白质已特异性地标记了两种不同的荧光染料。

卵母细胞装片后，动物极朝上并完成透化处理，将样品室移至显微镜下，使用4X物镜对卵母细胞进行聚焦。接着，用电压感应的V1电极穿刺卵母细胞。然后，切换至40X水浸物镜。

聚焦于朝上的动物极。随后关闭红光。通过旋转滤光立方转盘，选择Anap滤光立方，并选择连接至光电二极管的光学输出端口。

随后，将卤素灯调至最高强度并打开快门2到5秒，以读取卵母细胞自身产生的背景荧光强度。之后，打开钳制装置，将浴液/保护开关拨至激活状态，并通过调节头部放大器上的旋钮将膜电位调整至指令电位。接着，在记录软件中选择钳制电位、阶跃电压方案、脉冲次数和脉冲持续时间。

然后，记录电压依赖性电流和Anap荧光强度。对于双色VCF，通过旋转滤光片转轮选择TMR滤光片组。按照Anap的方法读取TMR的背景荧光，并同时记录电压依赖性电流和TMR荧光强度。

该图展示了使用步进方案从表达Shaker突变体的同一卵母细胞获得的Anap和TMR荧光信号。通过在L382终止W434F背景中引入一个可从外部溶液接触的半胱氨酸，并用TMR马来酰亚胺对其进行标记，可实现对同一蛋白质不同区域实时运动的同步检测。通过将稳态荧光强度对电压作图，可获得荧光-电压关系曲线。

观看本视频后，您应能够充分理解如何在非洲爪蟾卵母细胞中表达荧光非天然氨基酸，以及如何进行单色或双色电压钳荧光检测。一旦掌握该技术，实验所需时间大致与传统的电生理实验相当，唯一的额外步骤是将DNA注射到卵母细胞的细胞核中。在进行该操作时，务必注意在缺乏非天然氨基酸的情况下检测是否存在泄漏表达。

每个突变都必须进行此项操作，因为渗漏表达的量取决于终止密码子在蛋白质中的插入位点。该技术现在使研究人员能够研究蛋白质胞质侧的构象变化，而许多调控机制正是发生在该区域。