电压钳荧光测定爪蟾使用荧光非天然氨基酸的卵母细胞

本文介绍了使用荧光非天然氨基酸（fUAA）代替马来酰亚胺染料的常规电压钳子荧光测量（VCF）的增强，以探测离子通道中的结构重排。该程序包括非洲爪蟾卵母细胞DNA注射，RNA / fUAA共注射，以及同步电流和荧光测量。

该程序的总体目标是将荧光非天然氨基酸引入非洲爪蟾卵母细胞中表达的膜蛋白中，并使用电压钳荧光法同时确定蛋白质的功能和结构重排。这项技术将有助于回答膜蛋白结构功能关系领域的关键问题。使用电压钳荧光法，我们可以直接将结构重排与蛋白质功能相关联。

在其中添加荧光非天然氨基酸标记有助于克服以前标记的限制。这曾经是标记位点的可及性以及由于内源性结合位点而导致的背景标记。这项技术的影响延伸到对膜蛋白的更好的生物物理理解，因为您现在可以探测以前传统电压钳荧光测定法无法接近的结构域。

手术取出非洲爪蟾卵母细胞后，用 SOS 溶液洗涤卵母细胞 3 次。单独选择大而健康的卵母细胞，并在注射前将它们在 18 摄氏度下在补充有抗生素和 5% 马血清的 Barth 溶液中孵育至少四个小时。对于 DNA 的核注射，准备一个细长的注射头，以到达细胞核而不会损坏卵母细胞。

然后，在注射头中注满油，并将注射头安装在纳注射装置上。接下来，在立体显微镜下安装纳注射器，并用镊子折断尖端的末端。之后，喷出油，直到吸头末端没有气泡。

之后，将 1 微升每微升 0.1 μg pAnap 的无核酸酶水溶液放在立体镜下的一块封口膜上，并用 DNA 填充注射头。然后，将卵母细胞转移到含有 Barth 溶液并补充抗生素的含网片注射皿中。由于卵母细胞核位于动物极中，因此将注射头对准动物极的中心并刺穿，使注射头到达动物半球中心附近。

接下来，将 9.2 纳升 pAnap 溶液注射到每个卵母细胞的细胞核中。随后，将卵母细胞在 2 毫升补充有抗生素和 5% 马血清的 Barth 溶液中在 18 摄氏度下孵育 6 至 24 小时，以允许 Anap 特异性 tRNA 和 tRNA 合成酶的稳健表达。现在，再次准备纳注射剂，但这一次，注射头不需要像 DNA 注射那样薄。

从这一点开始仅在红光下工作，以防止 Anap 的光漂白。将 1 微升 1 毫摩尔 Anap 与每 μL mRNA 1 至 2 微克的 1 微升直接混合在一块封口膜上，并将混合溶液填充注射吸头。将尖端刺穿膜正下方的植物杆中，并在每个 pAnap 注射的卵母细胞中注入 46 纳升混合溶液。

然后，将卵母细胞放入不透光的盒子中或用铝箔包裹培养瓶，以保护卵母细胞避光。将它们在 18 摄氏度下补充有抗生素和 5% 马血清的 Barth 溶液中孵育 2 到 3 天。每天用新鲜的 Barth 溶液替换，并去除死卵母细胞以避免污染。

在此设置中，切开电压钳设备被集成到荧光显微镜设置中。记录室安装在一个滑块上，允许它在用于放置卵母细胞的标准立体镜和显微镜之间移动以进行荧光测量。光电二极管检测系统连接到荧光显微镜的 C 接口出口，光电流读数器连接到数字信号处理器中的第二个输入通道。

100 瓦、12 伏卤素灯用作荧光激发的光源。激发由激发光源和显微镜之间的机械快门控制。激活是通过来自数字信号处理器的 TTL 脉冲触发的，该脉冲在记录软件中定时，因此快门在记录开始前约 100 毫秒打开，并且在滤光片立方体转塔中需要一个合适的滤光片立方体。

对于双色 VCF，在记录前立即将制备好的卵母细胞在标记溶液中的 5 微摩尔 TMR 马来酰亚胺中孵育 15 分钟。然后，用标记溶液洗涤卵母细胞 3 次，以在记录前去除多余的染料。此时，蛋白质用两种不同的荧光团特异性标记。

卵母细胞安装后，动物杆朝上并透化，将腔室滑到显微镜上，并使用 4 倍物镜聚焦卵母细胞。接下来，用电压感应 V1 电极刺穿卵母细胞。然后，切换到 40 倍水浸物镜。

专注于朝上的动物杆。之后，关掉红灯。通过转动滤光片立方体转盘和连接到光电二极管的光学出口端口来选择 Anap 滤光片立方体。

然后，以最高强度打开卤素灯，然后打开快门 2 到 5 秒，以读取来自卵母细胞的背景荧光强度。然后，打开夹子，将浴槽/防护开关拨到活动状态，并通过转动头部平台上的旋钮将膜电位调整到指令电位。随后，在记录软件中选择保持电位、步进协议、脉冲数量和长度。

然后，记录电压依赖性电流和 Anap 荧光强度。对于双色 VCF，通过转动立方体转盘选择 TMR 滤光片立方体。读取 TMR 的背景荧光，如 Anap 所述，并同时记录电压依赖性电流和 TMR 荧光强度。

该图显示了使用从表达 Shaker 突变体的同一卵母细胞获得的步骤方案的 Anap 和 TMR 荧光信号。通过将可从外部溶液进入的半胱氨酸添加到 L382 终止 W434F 背景中并用 TMR 马来酰亚胺标记，可以同时探测同一蛋白质不同区域的实时运动。通过绘制稳态荧光强度与电压的关系来获得荧光电压关系。

看完这个视频，你应该对如何将荧光非天然氨基酸表达到非洲爪蟾卵母细胞中以及如何进行单色或双色电压钳荧光法有了很好的了解。一旦你掌握了这项技术，它应该需要与传统电生理学实验大致相同的时间，你只需要额外的步骤，将 DNA 注射到卵母细胞的细胞核中。尝试此程序时，请务必记住在没有非天然氨基酸的情况下检查泄漏表达。

必须对每个突变进行此作，因为泄漏表达量取决于蛋白质内终止密码子的插入位点。这项技术现在使研究人员能够研究蛋白质胞质位点的构象变化，许多调节机制都发生在该位点。