Name: 在神经肌肉疾病的模型小鼠呼吸肌肉活动和通风的重复测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 了解肌萎缩侧索硬化症小鼠模型中呼吸肌活动与通气的连续测量方法。该技术利用全身体积描记法和肌电图，可在自由活动的小鼠中同步监测呼吸参数，为神经肌肉疾病研究提供重要见解。

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本研究工作得到了辛辛那提儿童医院医学中心受托人奖（授予 S.A.C.）以及美国国立卫生研究院培训基金（T32NS007453，授予 V.N.J.）的支持。

实验操作已获辛辛那提儿童医院医学中心机构动物照护与使用委员会批准，并依照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物照护与使用指南》的规定进行。
1. 遥测设备植入手术的准备工作
<ol>
	<li>穿戴个人防护装备（即， 刷手服、鞋套、隔离衣、发网、口罩和外科手套。 
	注意：该手术需要无菌环境。</li>
	<li>打开培养箱（伺服控制加湿器/婴儿培养箱，设定为 29 °C）°C并用干燥的白色毛巾铺垫，以确保适当的保暖，促进恢复。</li>
	<li>手术前，使用环氧乙烷对所有手术器械进行灭菌，并在使用前用酶类清洁剂和化学消毒剂（或按照制造商说明）对发射器进行灭菌。 
	注意：手术器械应包括#2号椎板切除钳（标准头/直头/12 cm）（x4）、窄型齿状钳（有齿/弯头/12 cm）、组织分离剪（直头/钝头-钝头/11.5 cm），以及持刀柄和刀片。建议另备一套灭菌器械（两把#2号钳和剪刀），专门用于处理发射器导线，以保持手术器械的良好状态。</li>
	<li>用合适的消毒剂对手术区域内的所有表面进行消毒。在手术区域内放置体视解剖显微镜、异氟烷麻醉机、手术器械和毛发剪（参见 材料表).</li>
	<li>在麻醉期间为维持小鼠体温，将加热垫或水毯放置在体视解剖显微镜前无菌毛巾下方。</li>
	<li>使用前确保发射器功能完好。 
	注意：将一块小磁铁放置在距离发射器2英寸范围内，可打开或关闭该设备。当发射器开启并靠近调至500 Hz AM频率的收音机时，会发出持续的高音嗡嗡声。为延长电池寿命，在将设备植入动物体内前应先关闭电源。</li>
	<li>手术前准备电极导线，使用专用于处理导线的剪刀修剪远端导线，使导线长度约为3 cm（足以到达目标肌肉）图1A）或者，将设备近端的导线盘绕并用缝线绑在一起，使未盘绕的导线长度约为3 cm。 
	注意：请保存电极导线剪下的部分，用于制备“导线帽”（塑料绝缘套管），具体方法见步骤1.9。在步骤3中，发射器导线将穿过肌肉，因此必须使用导线帽固定导线远端暴露部分并进行绝缘处理。</li>
	<li>使用手术刀修剪掉导线塑料外皮的0.5 cm，注意不要切断内部金属丝。使用专用的导线操作工具，将导线末端拉伸至原始长度的4–5倍，使其能够轻松插入25号针头内。图1B-B''将导线暴露的金属部分剪裁至长度为0.5 cm。</li>
	<li>手术前准备好铅帽（用于覆盖导线末端的塑料管）。使用手术刀从步骤1.7中保存的电极导线节段周围的塑料外皮上切下长约0.25 cm的管状片段。 
	注意：每只接受植入手术的小鼠需要四个铅帽，但最好准备所需数量两倍的铅帽。额外准备无菌铅帽有助于在首次固定铅帽失败时使用。</li>
	<li>记录植入式发射器的序列号，并保留带有校准信息的原始包装。每个发射器的肌电图（EMG）记录具有不同的频率校准参数；需将这些参数输入采集软件，以获得可接受的EMG记录。</li>
</ol>
2. 手术前小鼠的准备
<ol>
	<li>选择用于移植的小鼠即， SOD1(G93A) 或对照组）并称量动物体重。 
	注意：接受该手术的小鼠（雄性或雌性）推荐年龄为出生后56至120天，体重推荐≥24 g。</li>
	<li>使用3.5%异氟烷（氧气流速为2 L/min）对小鼠进行麻醉。通过脚趾夹捏和尾部夹捏测试确认小鼠已完全麻醉。</li>
	<li>麻醉后，将小鼠从麻醉盒中取出，并通过鼻罩维持麻醉，异氟烷浓度设为1.5%，氧气流速设为1 L/min。进行足趾夹捏和/或尾部夹捏以确认麻醉状态是否维持。</li>
	<li>手术期间涂抹眼用润滑软膏以防止眼睛干涩。</li>
	<li>剃除小鼠耳部与肩部之间的毛发，以暴露手术区域（图1C).</li>
	<li>修剪手术侧同侧的脚趾甲，以减少小鼠在愈合过程中抓挠导致引线脱落或造成伤口的风险。</li>
	<li>交替使用消毒剂和异丙醇对手术部位进行擦拭，先用消毒剂，再用异丙醇，重复此过程2次。</li>
</ol>
3. 植入遥测装置以记录肩胛提肌和斜方肌的肌电活动
<ol>
	<li>将动物置于解剖显微镜下，侧卧于覆盖在加热垫上的无菌垫上，并用胶带固定鼻罩。注意最好选择右侧植入，以减少来自心脏的ECG信号干扰。 
	注意：监测呼吸情况，必要时调整异氟烷浓度，以维持规律的呼吸频率和适当的外科麻醉深度。</li>
	<li>将前肢沿躯干向同侧足部牵拉。 
	注意：此体位可使肩胛骨向尾侧移位，从而为斜角肌和斜方肌提供手术入路。
	<ol>
		<li>用钝性弯镊夹住与手术部位同侧的前肢，将前肢向后牵拉并用胶带固定图1C). 使用强效粘性手术胶带，确保足部在操作过程中固定牢固。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>戴上一副新的外科手套。使用手术刀在肩部与耳部之间做一个约2厘米长的斜切口（图中红线所示）。 图1C).</li>
	<li>使用两把#2号咬骨钳，双手各持一把，向后牵拉脂肪垫，并分开斜方肌和颈阔肌，以暴露覆盖胸锁乳突肌和斜角肌的筋膜（图1D和E).</li>
	<li>利用胸锁乳突肌和膈神经作为解剖标志，辨认斜角肌. 注意，膈神经与斜角肌平行走行, 而胸锁乳突肌位于其下方。斜角肌从颈椎斜向延伸至肋骨，位于斜方肌下方。生物电位导联将插入前斜角肌，该肌肉可被识别为与膈神经相邻走行的肌肉。图1F 和 G). 
	注意：该区域血管丰富，需小心操作以避免损伤锁骨下动脉。应避免损伤膈神经和臂丛神经。</li>
	<li>一旦已识别出斜角肌和斜方肌（图1G在动物背部肩胛骨之间做一个皮下囊袋用于放置发射器。
	<ol>
		<li>使用组织分离剪，将剪刀的钝端轻轻插入皮肤下方，然后撑开剪刀，直至形成一个约为发射器宽度1.25倍的皮下囊袋开口（图1H). 
		注意：植入发射器时应尽量减少阻力，但皮下囊袋不可过大，以免发射器自行移动。若囊袋过小，发射器可能摩擦皮肤，引起刺激，导致动物抓挠皮肤和/或拉出导联。若囊袋过大，则可能形成血清肿，或导致发射器移位至不利位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用温热的无菌生理盐水冲洗，并将发射器较平坦的一侧紧贴肌肉插入。放置发射器时应使其平贴组织，导线从组织袋中引出，彼此平行，避免扭曲。图1I将多余的导线在设备下方卷起并压平。</li>
	<li>将发射器的导线连接至斜角肌和斜方肌，使两组双极导线平直且相互平行地放置。</li>
	<li>使用椎板咬骨钳将前斜角肌与周围肌肉分离，并将25号针头垂直于肌纤维方向插入斜角肌。
	<ol>
		<li>将一根导线插入针头尖端，然后将针头从肌肉中抽出，使导线留在肌肉内，直至导线的绝缘部分为止图1J和K记录不同颜色的导联插入哪块肌肉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在导线暴露端靠近插入肌肉处的导线上放置少量氰基丙烯酸酯粘合剂，然后迅速将导线帽滑过导线，确保导线帽与肌肉之间无导线外露图2A和B). 
	注意：尽管使用氰基丙烯酸酯固定肌电图导联是一种被认可的做法17,18另一种方法是用丝线缝合结在引线帽周围将其固定。</li>
	<li>剪去帽端远端多余的导线，并在导线帽/导线末端滴加一滴氰基丙烯酸酯粘合剂。待胶水充分聚合后，再松开固定图2C和D).</li>
	<li>按照相同的步骤（步骤 3.10–3.12），将极性相反的电极平行插入同一肌肉中，距离第一个电极 1–2 mm。</li>
	<li>重复步骤 3.10 - 3.12，将导联插入位于斜角肌前方的斜方肌中（图1L和M).</li>
	<li>确保导线引线固定到位，且留有足够余量，使动物在活动时不会牵拉引线。同时确保引线多余部分不会压迫皮肤，以免引起刺激，导致动物抓挠或拉扯引线。必要时重新调整引线位置，以避免任何可能的不适。</li>
	<li>轻轻取下固定前肢的胶带。将脂肪垫拉回肌肉上方，用以覆盖已插入的导联。使用氰基丙烯酸酯粘合剂闭合切口，将皮瓣轻轻拉拢对齐切口边缘。用弯头镊子夹住部分皮瓣使其闭合，并沿闭合线涂抹少量氰基丙烯酸酯粘合剂。</li>
	<li>在动物仍处于麻醉状态时，皮下注射0.1 mL卡洛芬以缓解术后疼痛。 
	注意：术后继续每天给予一次 0.1 mL 卡洛芬，持续 1 - 2 天，之后根据需要给予。</li>
	<li>将动物从鼻罩中取出，放入预热的培养箱内的清洁笼子中，直至动物苏醒并能自主在笼内活动。之后至少再将其留在培养箱中15分钟，期间持续观察其活动情况和警觉状态。</li>
</ol>
4. 术后护理
<ol>
	<li>术后将动物单独饲养。为恢复中的动物提供饮食凝胶和饮水瓶。</li>
	<li>术后密切观察动物30分钟。术后5小时内，至少每小时检查一次。术后数天内，每天至少检查两次。</li>
	<li>观察切口处及植入物所在体腔内的坏死和感染情况即， 发热、肿胀和发红）以及血清肿形成。 
	注意：这些体征出现在术后第一周内。术后一个月健康愈合的动物如图所示 图1N尽管植入后可立即进行肌电图记录，但为避免植入后心电图信号过高，动物至少恢复一周后才开始记录肌电图和体积描记。</li>
</ol>
5. 同时采集肌电图和体积描记信号
<ol>
	<li>打开所有采集设备，包括偏置气流。 
	注意：小鼠的流速通常设定为1.0 L/min。</li>
	<li>使用流量计校准体积描记室。 
	注意：定期检查容积描记室，确保密封圈无裂纹或破损。每周使用真空脂等润滑剂涂抹橡胶密封圈，以保持其良好状态。</li>
	<li>按照制造商的说明进行发射器校准。</li>
	<li>将小鼠放入体积描记室中至少1小时，以在记录肌电图和体积描记之前使其适应环境。使用多个体积描记室时，可在第二个体积描记室中使下一只小鼠适应环境的同时，对一只小鼠进行记录。在适应期间不要开启发射器，以节省电池电量。图1O).</li>
	<li>在开始记录之前（但完成校准后），将强磁铁置于植入动物距离1英寸范围内以开启发射器；接收器前端的红灯将指示发射器已开启。</li>
	<li>使用标有“Acquisition”的下拉菜单开始采集，选择“Start Acquisition”。尽管记录时长可能因实验而异，典型的体积描记和肌电图记录持续1 - 3 h。 
	注意：发射器的固有采样率为 240 Hz。软件中设置为 500 Hz 的更高采样率，用于对数据点进行插值，从而提供更平滑的波形。植入设备中的低通滤波器（作为抗混叠滤波器）和高通滤波器共同设定了该遥测设备 1 至 50 Hz 的带宽。由于植入设备由电池供电，且动物身体可屏蔽植入体及导线免受电场干扰，因此 60 Hz 交流电干扰不会在肌电图（EMG）信号中引入额外噪声。体积描记法、肌电图和视频信号在实时过程中自动同步 通过 采集软件。</li>
	<li>当采集结束后，使用磁铁关闭发射器，并将动物从腔室中取出。</li>
	<li>若需开始下一次记录，请清洗舱室，输入下一个动物的发射器校准参数，并开始第二次记录。若当日数据采集结束，请关闭发射器，清洗体积描记舱室，并关闭所有数据采集设备及偏置气流。</li>
</ol>
<img alt="啮齿类动物电生理实验装置；膈神经分离；实验示意图与设备" src="/files/ftp_upload/55599/55599fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图1. 植入遥测装置以测量呼吸肌肌电图 (A) 带有两对生物电位导联的遥测发射器，用于测量肌电图（EMG）。导联可根据需要剪短至合适长度（底部），或盘绕后置于发射器下方（顶部）。B) 发射器导线。B') 剪除导线末端的塑料绝缘层以露出金属导线，并制作导线帽（插图）。B'') 导线拉伸至原始长度的4-5倍。应修剪导线，使其长度为0.5 cm（图中未显示）。C) 手术准备就绪的小鼠，手术区域已剃毛，前肢位置正确。红色虚线表示切口位置。D) 脂肪垫和筋膜下方的浅层肌肉，初次切开后可见。T = 斜方肌。S = 胸锁乳突肌。P = 颈阔肌。黄色箭头 = 膈神经。E) 图D所示肌肉和膈神经的示意图。应使用镊子分开斜方肌和颈阔肌，以到达更深层的斜角肌，如图F和G所示。F用于确定斜角肌和斜方肌位置的解剖标志。该图像显示了锁骨下动脉（白色箭头）、膈神经/臂丛（黑色箭头）以及颜色较浅的胸锁乳突肌（黄色箭头）。G) 示意图展示深层肌肉的位置（即， 中斜角肌、前斜角肌和胸锁乳突肌）、锁骨下动脉以及膈神经。后斜角肌不可见。只有当浅层肌肉（D 和 E）被分开时，才能暴露这些结构。H使用钝头剪刀为发射器制作一个囊袋。I将发射器插入皮下囊袋，导线平行放置并从囊袋中引出。J将25号针头垂直插入斜角肌肌纤维，以创建导线通路。K两根导线均插入斜角肌中。导线帽置于末端并粘合固定。L将25号针头垂直插入斜方肌肌纤维，以创建导线通道。M) 所有四根导线均已插入斜方肌和斜角肌，并在关闭切口前平放于肌肉表面。N完全恢复的小鼠，发射器皮下植入于背部。O) 同时使用体积描记室（黄色箭头）、遥测接收垫（红色箭头）和摄像机（黑色箭头）分别记录体积描记图、肌肉EMG活动和视频。多功能偏置气流连接至体积描记室 通过 一根塑料管（蓝色箭头）用于向小鼠供氧。 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55599/55599fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="基因编辑示意图；CRISPR 过程显示 DNA 切割与修复序列。" src="/files/ftp_upload/55599/55599fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2. 使用氰基丙烯酸酯粘合剂固定导联帽。（A）在电极导联线（E）靠近肌肉端暴露的金属丝上滴加少量氰基丙烯酸酯（紫色圆圈）。（B）迅速将预先准备好的导联帽（LC）套入涂有氰基丙烯酸酯的暴露金属丝上，使导联帽紧邻肌肉放置。（C）剪除导联帽远端及导联线末端的一小段，确保无任何未被塑料绝缘层覆盖的电极暴露。（D）在导联帽末端再滴加一滴氰基丙烯酸酯粘合剂。将剪下的导联帽远端部分从动物体上移除。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55599/55599fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
6. 前臂肌电图与体积描记法分析
<ol>
	<li>打开分析软件并查看目标文件（进入“File”并选择“Open review file”）。通过右键点击EMG轨迹，选择“Analyze Attributes”，高亮“Advanced Attributes 1”选项卡，并将高通滤波器设置为30 Hz，对EMG信号进行30 Hz高通滤波。 
	注意：此滤波步骤可去除无特异性的低频信息。</li>
	<li>通过目视检查确定小鼠无活动的时段，依据为同步视频文件中无运动，以及体积描记图轨迹（图3A中的红色框）中无因运动引起的大而无规律的压力变化；无活动状态出现在小鼠睡眠或清醒但静止时。</li>
	<li>针对每块肌肉独立识别EMG活动“阵发”（bouts）。
	<ol>
		<li>对滤波后的EMG信号进行整流并以30 ms为窗口进行积分（图4）。 
		注意：由于小鼠呼吸频率约为3 Hz，每次呼吸大约对应11个积分值。</li>
		<li>在小鼠无活动且体积描记图显示正常呼吸（eupnea）的3秒时间段内，对整流并积分后的EMG信号值取平均，以确定基础EMG幅值（图4）。</li>
		<li>识别“阵发”活动，定义为至少连续3个整流并积分后的值，其幅值至少比基础EMG信号（步骤6.3.2中确定）高出50%。 
		注意：连续3个值代表90 ms的时间窗，但部分阵发可能包含超过3个高于阈值的值，持续时间超过90 ms。</li>
		<li>利用同步视频和体积描记图轨迹，排除发生在叹息（图3B）、嗅探（图3C）或自主运动（如转头或理毛）期间的阵发活动。</li>
		<li>对第二块肌肉重复步骤6.3.1至6.3.4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算每块肌肉的阵发频率。记录a）每个无活动期的起始和结束时间，以及b）根据上述标准识别出的每个阵发的发生时间。将所有无活动时间加总，用阵发总次数除以整个记录期间的无活动总分钟数，计算阵发频率。</li>
	<li>判断通气变化是否与所记录肌肉的激活相关。
	<ol>
		<li>选择要测量的呼吸参数（例如，峰值吸气流速、潮气量、每分钟通气量和每分钟呼吸次数）。 
		注意：所有可选参数均可在P3 Setup下拉菜单的“Derived Parameters”中找到。</li>
		<li>识别发生在EMG阵发活动期间和EMG基础活动期间的呼吸事件（图4）。</li>
		<li>创建覆盖与EMG阵发活动相关的体积描记呼吸的解析段（parser segments），并创建独立的与基础EMG活动相关的解析段。确保将分析类型设置为“Parser Seg”。 
		注意：该选项位于P3 Setup下拉菜单的“Data Reduction Setup”中。</li>
		<li>通过右键点击体积描记图轨迹，在每个解析段的起始位置标记事件。在下拉菜单中将包含阵发的解析段指定为“Event 1”，将基础解析段指定为“Event 2”，以区分两类片段。</li>
		<li>在“Functions”菜单下，保存“Marks Section”和“Marks Derived Data”；在Data Parser菜单下，保存“Parsed Review File”和“Parsed Derived Data”。 
		注意：每个呼吸所选呼吸参数可在标签为“Derivations”的Marks Derived Data表格中找到。</li>
		<li>比较发生在ARM阵发期间（标记为Event 1）与基础活动期间（标记为Event 2）的呼吸参数，以判断肌肉活动是否与通气变化相关。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Weiergraber, M., Henry, M., Hescheler, J., Smyth, N., Schneider, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrocorticographic+and+deep+intracerebral+EEG+recording+in+mice+using+a+telemetry+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrocorticographic and deep intracerebral EEG recording in mice using a telemetry system.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 14 (3), 154-164 (2005).</li>
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<li>Morrison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+inhibitory+amino+acids+in+control+of+hypoglossal+motor+outflow+to+genioglossus+muscle+in+naturally+sleeping+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol.+552+%28Pt%22%5BJournal%5D)">Role of inhibitory amino acids in control of hypoglossal motor outflow to genioglossus muscle in naturally sleeping rats.</a> J Physiol. 552 (Pt. 3, 975-991 (2003).</li>
<li>Tscharner, V., Eskofier, B., Federolf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+the+electrocardiogram+signal+from+surface+EMG+recordings+using+non-linearly+scaled+wavelets%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electromyogr+Kinesiol%22%5BJournal%5D)">Removal of the electrocardiogram signal from surface EMG recordings using non-linearly scaled wavelets).</a> J Electromyogr Kinesiol. 21 (4), 683-688 (2011).</li>
<li>Hof, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+remove+ECG+artifacts+from+trunk+muscle+EMG+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electromyogr+Kinesiol%22%5BJournal%5D)">A simple method to remove ECG artifacts from trunk muscle EMG signals.</a> J Electromyogr Kinesiol. 19 (6), e554-e555 (2009).</li>
<li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removing+ECG+noise+from+surface+EMG+signals+using+adaptive+filtering%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Removing ECG noise from surface EMG signals using adaptive filtering.</a> Neurosci Lett. 462 (1), 14-19 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所展示的方法能够在同一动物体内，于初次手术植入发射器后，以非侵入性方式长期（数月）测量呼吸肌活动和通气功能。该技术相较于在麻醉小鼠中使用标准肌电图（EMG）技术具有多项优势：1）实验所需小鼠数量更少，并可在同一只小鼠的不同疾病阶段持续记录同一部位的数据（而非在不同疾病阶段使用多只小鼠）；2）数据分析可采用更强大的统计学方法（即采用重复测量设计，而非比较独立的实验组）；3）同步记录肌电图（EMG）和整体身体容积描记法（WBP）可直接评估呼吸辅助肌（ARM）活动对通气功能的影响；4）实验可在小鼠处于不同睡眠/觉醒状态时进行。此外，由于健康小鼠在静息状态下呼吸辅助肌（ARM）阵发性活动频率极低，该技术能够在肌萎缩侧索硬化（ALS）模型小鼠出现早期症状阶段即检测到ARM活动频率的微小变化10。然而，由于该技术测量的是自然行为过程中大量但未知数量的肌纤维活动，而非在实验可控强度下通过神经刺激来记录，因此不适用于运动单位大小或数量的估算。另一项局限性在于，目前适用于小鼠植入的遥测发射器仅支持两组生物电势引线，因此每只小鼠只能同时记录两个部位的信号。对于需要在同一小鼠中同步记录两个...

在高通气需求情况下（例如，运动时），辅助呼吸肌（ARMs）可增加通气量，并在因损伤或疾病导致膈肌功能受损时帮助维持通气1,2。尽管肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者及小鼠模型中膈肌功能的变化已有较充分的描述3,4,5,6，但关于ALS中ARMs的活动或功能所知甚少。然而，有研究提示，能够动员ARMs的ALS患者相较于膈肌功能障碍程度相似但无法动员ARMs的患者具有更好的预后7。此外，在膈肌麻痹的情况下，ARMs的活动足以维持呼吸8。这些研究表明，增强ARMs功能的策略可能改善患有神经肌肉疾病、脊髓损伤或其他导致膈肌功能障碍疾病的患者的呼吸功能。然而，控制ARMs在呼吸过程中被募集的机制在很大程度上仍不清楚。为了研究ARMs是如何被募集的，并评估改善ARMs募集和通气功能的治疗方法，亟需建立可在疾病或损伤动物模型中随时间测量呼吸功能及ARMs活动变化的方法。此外，在膈肌功能进行性丧失的同时，ARMs活动的增加可能成为ALS等神经肌肉疾病进展过程中一个有价值的生物标志物7,9,10。
本方案描述了一种在清醒、自由活动的小鼠中，非侵入性（在初次手术后）且可重复地测量呼吸肌活动和通气功能的方法。通过同步记录肌电图（EMG）、全身体积描记法（WBP）和视频，研究者可以评估辅助呼吸肌（ARM）活动的变化如何影响通气，并判断动物处于静息或运动状态。该方法的主要优势在于可在清醒、自由活动的小鼠中进行，而某些其他测量EMG的方法则需要麻醉和/或属于终末性操作11,12,13。长时间记录清醒小鼠的EMG活动也可通过慢性植入EMG导线实现，但此类方法需将小鼠用导线连接至数据采集系统14,15。由于导线连接可能干扰小鼠的正常活动或行为，且可能与标准体积描记室不兼容，本方案采用遥测装置将EMG信号无线传输至采集系统。通过磁铁可开启或关闭发射器，以节省电池电量，从而实现数月内对EMG活动的多次测量。本方案可轻松调整，用于通过将EMG导线插入不同肌肉来测量其他呼吸肌或非呼吸肌的活动。此外，两条导线中的一条可用于测量脑电图（EEG）活动，以评估睡眠状态或识别癫痫样放电16。该技术已成功应用于肌萎缩侧索硬化（ALS）小鼠模型中，在疾病进展过程中持续监测静息状态下ARM活动的变化，并用于识别驱动ARM活动的关键神经元10。

<table><tbody><tr><td>B6.Cg-Tg (SOD1*G93A)1 Gur/J</td><td>杰克逊实验室</td><td>4435</td><td></td></tr><tr><td>体积描记室</td><td>Buxco 呼吸产品 / 数据科学国际公司</td><td>601-1425-001</td><td></td></tr><tr><td>遥测接收器（型号 RPC-1）</td><td>数据科学国际公司</td><td>272-6001-001</td><td></td></tr><tr><td>偏置流泵（型号 BFL0500）</td><td>数据科学国际公司</td><td>601-2201-001</td><td></td></tr><tr><td>ACQ-7000 USB</td><td>数据科学国际公司</td><td>PNM-P3P-7002XS</td><td></td></tr><tr><td>Dataquest A.R.T. 数据交换矩阵</td><td>数据科学国际公司</td><td>271-0117-001</td><td></td></tr><tr><td>新版 Ponemah 分析系统</td><td>数据科学国际公司</td><td>PNM-POST-CFG</td><td></td></tr><tr><td>Ponemah 生理学平台采集软件 v5.20</td><td>数据科学国际公司</td><td>PNM-P3P-520</td><td></td></tr><tr><td>Ponemah 无束缚全呼吸体积描记分析模块 v5.20</td><td>数据科学国际公司</td><td>PNM-URP100W</td><td></td></tr><tr><td>配置型 Ponemah 软件系统</td><td>数据科学国际公司</td><td>PNM-P3P-CFG</td><td></td></tr><tr><td>分析模块（URP）</td><td>数据科学国际公司</td><td>PNM-URP100W</td><td></td></tr><tr><td>通用放大器</td><td>数据科学国际公司</td><td>13-7715-59</td><td></td></tr><tr><td>同步板</td><td>数据科学国际公司</td><td>271-0401-001</td><td></td></tr><tr><td>同步电缆</td><td>数据科学国际公司</td><td>274-0030-001</td><td></td></tr><tr><td>压力换能器 Buxco</td><td>数据科学国际公司</td><td>600-1114-001</td><td></td></tr><tr><td>流量计</td><td>数据科学国际公司</td><td>600-1260-001</td><td></td></tr><tr><td>F20-EET 启动套件中包含的磁铁和无线电装置</td><td>数据科学国际公司</td><td>276-0400-001</td><td></td></tr><tr><td>Axis P1363 视频摄像机&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>数据科学国际公司</td><td>275-0201-001</td><td></td></tr><tr><td>Terg-A-Zyme</td><td>菲舍尔科技公司</td><td>50-821-785</td><td>酶类清洁剂</td></tr><tr><td>Actril</td><td>明特科技公司</td><td>78337-000</td><td>化学消毒剂</td></tr><tr><td>体视解剖显微镜（型号 MEB126）</td><td>徕卡</td><td>10-450-508</td><td></td></tr><tr><td>伺服控制加湿器/婴儿培养箱</td><td>OHMEDA Ohio Care Plus</td><td>6600-0506-803</td><td></td></tr><tr><td>TL11M2-F20-EET 发射器</td><td>数据科学国际公司</td><td>270-0124-001</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #2 脊椎切除镊 - 标准尖端/直型/12 cm（x2）&amp;nbsp;</td><td>精细科学仪器公司</td><td>11223-20</td><td>用于处理导线</td></tr><tr><td>Dumont #2 脊椎切除镊 - 标准尖端/直型/12 cm（x2）</td><td>精细科学仪器公司</td><td>11223-20</td><td>用于手术</td></tr><tr><td>窄型图案镊 - 有齿/弯型/12 cm</td><td>精细科学仪器公司</td><td>17003-12</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪 - 耐用切割/直型/锐利/12.5 cm/6 mm 刃口</td><td>精细科学仪器公司</td><td>15124-12</td><td></td></tr><tr><td>组织分离剪 - 直型/钝头-钝头/11.5 cm</td><td>精细科学仪器公司</td><td>14072-10</td><td></td></tr><tr><td>精细剪 - 耐用切割/弯型/锐头-锐头/9 cm&amp;nbsp;</td><td>精细科学仪器公司</td><td>14058-11</td><td>用于剪切导线和修剪指甲</td></tr><tr><td>手术刀柄 #3</td><td>世界精密仪器公司</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>精细科学仪器公司</td><td>10010-00</td><td>用于制备导线帽</td></tr><tr><td>Polysorb 编织可吸收缝合线</td><td>Coviden</td><td>D4G1532X</td><td>用于缠绕发射器导线</td></tr><tr><td>Gluture&amp;nbsp;</td><td>硕腾公司</td><td>6606-65-1</td><td>氰基丙烯酸酯粘合剂</td></tr><tr><td>3 mL 软质滑动接头注射器</td><td>Vitality Medical</td><td>118030055</td><td></td></tr><tr><td>25 G 针头（x2）</td><td>贝克顿·迪金森公司</td><td>305-145</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>亨利·谢恩动物健康公司</td><td>100-9175</td><td></td></tr><tr><td>Andis Easy Cut 理发剪套装</td><td>Andis</td><td>049-06-0271</td><td>Target 商店销售的电动剃须刀</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>亨利·谢恩动物健康公司</td><td>29404</td><td>麻醉剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>70% 异丙醇</td><td>Priority Care 1</td><td>MS070PC</td><td></td></tr><tr><td>Dermachlor 2% 医用擦洗液（含 2% 氯己定）</td><td>Butler Schein</td><td>55482</td><td></td></tr><tr><td>人工泪液</td><td>亨利·谢恩动物健康公司</td><td>48272</td><td>润滑性眼用软膏</td></tr><tr><td>真空润滑脂</td><td>道康宁公司</td><td>1597418</td><td></td></tr><tr><td>水毯</td><td>JorVet</td><td>JOR784BN</td><td></td></tr></tbody></table>

神经肌肉疾病小鼠模型中呼吸肌活动与通气功能的重复测量

Repeated Measurement of Respiratory Muscle Activity and Ventilation in Mouse Models of Neuromuscular Disease

当膈肌功能受损时，辅助呼吸肌有助于维持通气。以下方案描述了一种在非麻醉、自由活动的小鼠中，对辅助呼吸肌活动进行数周至数月重复测量的方法，同时监测其通气功能。该技术包括外科手术植入无线发射器，并将电极导线插入斜角肌和斜方肌，以记录这些吸气肌的肌电图活动。通气功能通过全身体积描记法进行测量，动物运动通过视频监测，并与肌电图活动同步记录。本文展示了在肌萎缩侧索硬化小鼠模型中对肌肉活动和通气功能的测量结果，以说明该工具如何用于研究呼吸肌活动随时间的变化，以及评估肌肉活动对通气功能的影响。所描述的方法可轻松调整，用于测量其他肌肉的活动，或在其他疾病或损伤的小鼠模型中评估辅助呼吸肌的活动。

所描述的方案用于植入遥测设备，并记录SOD1(G93A) ALS模型小鼠的斜角肌和斜方肌肌电图、全身体积描记（WBP）以及视频。动物处于非活动状态的时段例如， 通过视频记录识别出未移动的个体（即无运动），并结合全身压电记录（WBP）轨迹中缺乏与运动相关活动予以确认（图3A）。非活动期包括处于快速眼动（REM）睡眠或非快速眼动（REM）睡眠的时间，以及清醒但静止不动的时间（图3A）。在此非活动期间，当至少连续3个经整流和积分（30 ms）的信号值振幅较基线EMG水平升高至少50%时，记为一次活动事件。图4）。通过体积描记法确定的在叹息或嗅探期间发生的活动，以及通过视频评估的自主运动，均被排除在分析之外（图3B-C). 处于早至中期症状阶段的 SOD1(G93A) 小鼠（表1）在静息状态下表现出阵发性上肢肌肉活动增强，持续时间为一至数次呼吸周期（图4). 在...

本文介绍了一种利用全身容积描记法和通过植入式遥测装置进行的肌电图记录，在肌萎缩侧索硬化症（ALS）小鼠模型自由活动状态下，于疾病进展过程中反复测量通气功能和呼吸肌活动的方法。

辅助呼吸肌在膈肌功能受损时有助于维持通气。以下方案描述了一种用于重复……的方法。

本实验的总体目标是在疾病进展过程中持续多次测量呼吸肌活动和通气功能。通过手术植入遥测装置，并将肌电图导联插入选定的肌肉中。该方法可用于回答一些关键问题，例如在疾病或损伤导致膈肌功能受损后，辅助呼吸肌如何代偿其功能。该技术的主要优势在于，可以在疾病进展过程中对同一只自由活动的小鼠持续测量其通气功能和呼吸肌活动。该方法不仅有助于肌萎缩侧索硬化症（ALS）的诊断与治疗研究，还可应用于其他神经肌肉疾病或脊髓损伤模型。首先准备肌电图（EMG）电极引线。使用专用于处理导线的剪刀修剪远端导线，使其保留约三厘米长度，以便连接至目标肌肉。然后使用手术刀剥离导线末端约0.5厘米的塑料外层，注意不要切断内部金属导线。接下来，使用导线处理工具将导线末端拉伸至原始长度的四到五倍。将导线裸露的金属部分剪至0.5厘米长。然后通过从先前移除的塑料外皮上截取0.25厘米长的小管制备导线保护帽，用于覆盖导线末端。在小鼠麻醉后，进行足趾夹捏和尾部夹捏，确认小鼠无反应，以确保其已完全麻醉。然后将小鼠转移至手术台，连接鼻罩以维持术中麻醉。涂抹眼用润滑软膏，防止小鼠眼睛在手术期间干燥。剪除手术侧同侧的脚趾甲，以降低小鼠在愈合过程中抓挠导致导联脱落或造成伤口的风险。剃除小鼠耳部与肩部之间的毛发，以暴露手术区域。随后交替使用消毒剂和异丙醇擦拭手术区域。开始植入时，将前肢向同侧足部牵拉，使肩胛骨向尾侧移位，从而暴露斜角肌和斜方肌，便于进行手术操作。使用钝性弯头镊子将与手术部位同侧的前肢固定并拉开，用胶带将前肢固定在原位。戴上一副新的外科手套后，用手术刀在肩部与耳部之间做一个长约2厘米的斜切口。然后双手各持一把椎板切除镊，向后牵拉脂肪垫，并分开斜方肌和颈阔肌，以暴露覆盖胸锁乳突肌和斜角肌的筋膜。利用胸锁乳突肌和膈神经作为解剖标志来辨认斜角肌。注意膈神经与斜角肌平行走行，而胸锁乳突肌位于其下方。斜角肌从颈椎横突斜向延伸至肋骨，位于斜方肌深面。将生物电位导联插入前斜角肌，该肌肉可识别为与膈神经相邻走行的肌肉。接下来，用组织分离剪刀尖端插入小鼠皮下，然后撑开剪刀，直至形成一个略大于发射器宽度的皮下囊袋。用温热的无菌生理盐水冲洗囊袋。然后将发射器插入，较平坦的一侧紧贴肌肉。放置发射器时应使其平贴于组织，引线从囊袋中引出，彼此平行而非相互缠绕。将发射器的导线分别引向斜角肌和斜方肌，使两组生物电位导线平贴并相互平行。接下来，使用椎板切除钳将前斜角肌与其周围肌肉分离。然后将一根25号针头垂直于肌纤维方向插入斜角肌。将一根导线插入针头尖端，随后将针头从肌肉中抽出，使导线保留在肌肉内，直至导线的绝缘部分。记录各颜色导线插入的肌肉位置。将一滴氰基丙烯酸酯粘合剂涂于21号针头，以辅助将胶水涂抹到导线上。随后，将粘合剂涂至导线插入肌肉处附近暴露的导线末端。迅速将电极帽滑至导线上，确保电极帽与肌肉之间无导线外露。剪除电极帽远端多余的导线，并在电极帽末端及导线上滴加一滴氰基丙烯酸酯粘合剂。待胶水充分聚合后，再行松开。接着以相同方式将相反极性的导线平行插入同一肌肉中，位置距离第一根导线1至2毫米。重复上述操作，将导线插入位于前斜角肌前方的斜方肌，位置如图所示。接下来检查导线是否已固定到位，并确保导线留有适当余量，使动物在活动身体时不会牵拉导线。然后轻轻移除固定前肢的胶带。将脂肪垫拉回肌肉上方，并用其覆盖已插入的导线。接下来将皮瓣轻轻拉拢对齐切口。用弯头镊子夹住部分皮瓣，沿切口线涂抹少量氰基丙烯酸酯粘合剂。在动物仍处于麻醉状态下，皮下注射0.1毫升卡洛芬以缓解术后疼痛。将动物从鼻罩中取出，放入预热的培养箱内的清洁笼子中，直至动物清醒并能自主在笼内活动。将小鼠放入体积描记室中至少一小时，以适应环境，然后再进行肌电图和体积描记记录。在记录前但完成校准后，将强磁铁置于植入动物距离一英寸范围内，以开启发射器。接收器前端的红灯将指示发射器是否开启。通过下拉菜单中 labeled Acquisition 选项开始采集，并选择 Start Acquisition。尽管记录时长可能因实验而异，典型的体积描记和肌电图记录持续一至三小时。采集完成后，使用磁铁关闭发射器，并将动物放回饲养笼中。以下是出生后第98天的SOD-1(G93A)小鼠在症状前阶段的WBP及斜角肌和斜方肌的EMG信号图。分析所用数据来自动物处于静息状态的时段。红色框内显示的是处于静息状态且无肌电爆发的肌电图（EMG）轨迹，这是无症状期小鼠的特征。红色框外的轨迹显示体积描记图和肌肉活动及肌电图轨迹中出现大而不规则的峰，这在动物活动时较为典型。该图像显示了一只症状期SOD-1(G93A)小鼠在出生后第126天斜方肌的全身体积描记（WBP）和肌电图（EMG）轨迹，此时小鼠处于静息状态但仍出现肌电爆发。一旦掌握，若操作得当，该技术可在35分钟内完成。通过该实验流程，可利用植入动物模型评估药物在疾病或损伤模型中增强辅助呼吸肌活性的效果。

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医学

在神经肌肉疾病的模型小鼠呼吸肌肉活动和通风的重复测量

重复测量啮齿类动物呼吸生理参数并采集气道炎症细胞是理想的研究手段，但通常难以实现。本文介绍一种可重复的小鼠经口插管方法，该方法允许对气道高反应性进行多次测量，并可重复采集气道炎症细胞。...

一种可逆、非侵入性的小鼠气道阻力测量与支气管肺泡灌洗液采集方法

来源：Jensen, V. N.，等．神经肌肉疾病小鼠模型中呼吸肌活动与通气功能的重复测量．J. Vis.

在肌萎缩侧索硬化小鼠模型中同步记录体积描记图与肌电图

本方案详细描述了使用强迫振荡技术（flexiVent；SCIREQ...

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慢性脊髓损伤患者呼吸肌激活的评估：基于呼吸运动控制评估（RMCA）的方法

呼吸生理学的评估传统上依赖于需要对动物进行束缚或麻醉的技术。然而，无束缚式整体容积描记法能够对动物模型的呼吸生理学提供精确、无创且定量的分析。此外，该技术允许对小鼠进行重复的呼吸评估，从而实现纵向研究。...

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了解肌萎缩侧索硬化症小鼠模型中呼吸肌活动与通气的连续测量方法。该技术利用全身体积描记法和肌电图，可在自由活动的小鼠中同步监测呼吸参数，为神经肌肉疾病研究提供重要见解。

神经肌肉疾病小鼠模型中呼吸肌活动与通气功能的重复测量

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