Name: 慢性创伤性脑病模型的一种新方法果蝇 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 了解利用Drosophila melanogaster建立慢性创伤性脑病模型的新方法。该技术通过可调节强度的重复性头部冲击，为研究神经元退行性病变机制提供了可靠的实验工具。

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作者无任何利益冲突需要披露。

1. 打击装置的组装（图1）
<ol>
	<li>从1 mL注射器中取出活塞&#160;mL 结核菌素注射器。在注射器筒身的 1 处切割&#160;mL 刻度</li>
	<li>从200 µL移液枪头上去除一个气溶胶屏障（3 mm高 × 4 mm直径），并将其用作撞击器。将撞击器放入注射器筒内，轻轻敲击筒身，使撞击器移至枪头端，平面一侧覆盖喷嘴开口。</li>
	<li>将桶形尖端连接至与二氧化碳（CO₂）气源相连的塑料管2流量调节器 黑腹果蝇 麻醉工作站</li>
	<li>将桶体垂直固定，并用标准夹具支架夹紧，使冲击头保持在桶体底部。</li>
	<li>改造一个 200 µL 移液器吸头以制作果蝇固定装置。
	<ol>
		<li>从尖端切下4 mm，形成一个直径为0.8 mm的开口，仅使果蝇头部暴露。 
		注意：胸部及果蝇身体的其他所有部分将保留在移液器吸头内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>修改一个1,000 µL移液器吸头和一个1&#160;mL 注射器针头帽以制作连接器。
	<ol>
		<li>从尖端开口处截去44毫米。取一个6&#160;1 毫米长度的&#160;毫升注射器针帽并将其紧密插入1,000 µL移液器吸头的剩余段中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 击打装置的操作
<ol>
	<li>在果蝇操作板上使用 CO2 麻醉一只2日龄的成年雌性果蝇。</li>
	<li>用细毛刷轻轻将其转移至果蝇固定装置中。轻敲固定装置，使果蝇头部从末端露出。如果果蝇的喙部伸出末端外，用钝化的1&#160;mL 注射器针头轻轻将其推回装置内部。 
	注意：务必确保果蝇的喙部保持在固定装置内，否则果蝇可能因喙部吸伤而死亡。</li>
	<li>使用连接器将果蝇固定装置紧固到注射器筒上，使果蝇头部朝下。</li>
	<li>将气体压力设定为 100 kPa。根据实验设计调节气流速率。</li>
	<li>快速打开并关闭流量调节拨动开关，使撞击装置仅撞击果蝇头部一次。</li>
	<li>提起果蝇固定装置并移至果蝇操作板上方。将固定装置倒置，轻轻敲击侧面使果蝇脱出。将果蝇放入空的培养管中恢复。</li>
</ol>
3. 视频辅助运动追踪
<ol>
	<li>用透明硅胶弹性体填充一个直径为 6 cm 的培养皿，以制作追踪场地。硅胶与培养皿盖之间预留 3&#160;mm 的空间，使果蝇能够自由行走但无法飞行。</li>
	<li>每次从假手术组或处理组中麻醉四只果蝇，并将其放入场地中。在 22 °C 下静置果蝇 1 小时。</li>
	<li>在场地正上方放置一个电荷耦合器件（CCD）相机，并连续记录 5 分钟。</li>
	<li>使用 Ctrax 软件（可从加州理工学院免费获取）16 分析记录的运动轨迹。将追踪数据导出为编程语言（例如 Matlab）兼容的格式，并基于每帧移动的距离对数据进行分析17。计算每只果蝇的平均行走距离，并将其与同组其他所有记录的果蝇数据合并，以获得该组果蝇群体的平均累积移动距离。</li>
</ol>

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</ol>

本工作获得了约翰斯·霍普金斯大学医学院教员启动基金对 L.C. 的资助。

能够准确模拟慢性创伤性脑病（CTE）特征的动物模型，包括神经生理学改变、神经病理学标志以及神经行为学缺陷，在揭示疾病机制以及开发诊断和治疗靶点方面至关重要。可以理解的是，任何人类疾病的动物模型都无法完美地复制所有临床相关终点。然而，我们认为一个可靠的CTE模型应满足以下三个要求：（1）冲击必须直接施加于具有完整头皮和颅骨保护的头部；（2）在冲击暴露期间，头部不应被固定，以允许快速的加速-减速以及旋转和线性运动；（3）实验设计应包含单次和重复性冲击方案，且冲击后果应为轻度性质，不造成可见损伤，如组织水肿、挫伤或明显出血。
我们的果蝇模型与其他造成果蝇创伤性脑损伤的方法有所不同13,14,15。珠击破碎仪模型和HIT装置均通过随机的撞击位置和强度造成损伤。在这两种方法中，数量不等的果蝇被置于标准塑料小瓶或2&#160;mL螺口管中，在每次撞击或损伤过程中多次撞击容器壁并反弹。由于果蝇在容器内可自由移动...

慢性创伤性脑病（Chronic Traumatic Encephalopathy, CTE）最近被确认为一种独立的神经退行性疾病，与其他tau蛋白病（如阿尔茨海默病）相区别1与阿尔茨海默病及其他常见tau蛋白病不同，后者最重要的危险因素是年龄增长和痴呆家族史，&#160;慢性创伤性脑病（CTE）顾名思义，提示其与脑外伤史密切相关，最常见于接触性运动运动员（如拳击手和足球运动员）以及退伍军人。2,3,4,5据认为，该病由反复的脑震荡和亚脑震荡性头部损伤引发。患者可能出现认知功能障碍、情绪与行为改变以及运动功能障碍等症状和体征，这些表现与阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、路易体痴呆及帕金森病存在显著重叠。6相比之下，脑组织的尸检显示，在大脑皮层沟回深处的小血管周围存在一种独特的高磷酸化tau蛋白聚集模式，这一特征性病理表现未在其他退行性疾病中观察到。7然而，迄今为止，关于导致疾病发生的致病机制仍知之甚少。这在很大程度上是由于缺乏可靠的动物模型——直到最近才建立起啮齿类动物模型。5,8这些模式生物具有饲养成本高和寿命相对较长的缺点，因此不太适合用于神经退行性疾病的研究。
与哺乳动物相比，无脊椎动物（如 黑腹果蝇&#160;是极佳的替代选择，因其维护成本低、可用于解析遗传决定因素的工具丰富，且寿命相对较短9值得注意的是，果蝇和人类的大脑在进化上具有保守的分子与细胞通路，以及解剖学上的相似性10,11,12. 两个巧妙的 果蝇 既往已有报道用于研究创伤性脑损伤的模型13,14第一步 &#34;高冲击创伤&#34; 由Katzenberger及其同事设计的（HIT）装置将自由活动的果蝇置于一个塑料小瓶中，该小瓶被固定在金属弹簧的自由端13,15当塑料离心管被竖直倾斜并释放后，会撞击聚氨酯垫，使果蝇在管壁间弹起并受到创伤。相比之下，Barekat 及其同事设计了一种不同的递送方法，使用 Omni Bead Ruptor-24 匀浆仪平台14果蝇用CO₂麻醉2 并置于一个2&#160;mL 螺口管中，该管固定于匀浆仪上，并接受预设的振荡条件处理。使用组织匀浆仪系统的一个优点是实验者可调节损伤强度、损伤持续时间以及损伤重复次数。然而，这两种方法均存在相同的缺点：头部原发性损伤在撞击位置和力度上具有随机性。此外，两种方法均导致较高的死亡率，原因是不可避免地对身体其他部位及内脏器官造成附带损伤。本文中，我们描述了一种在果蝇中诱导轻度创伤性脑损伤（mTBI）的新方法。我们的装置由一种气体驱动的弹道冲击器组成。与现有方法相比 果蝇 模型14,15我们的方法具有独特优势，能够仅针对自由活动的果蝇头部产生可测量的冲击，从而精确控制多种因素，例如冲击强度、冲击间的时间间隔以及所受冲击的总次数。

<table><tbody><tr><td>气溶胶屏障</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td>用作撞击器</td></tr><tr><td>200 &amp;#956;L 移液器吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0706</td><td>用作果蝇头部固定器</td></tr><tr><td>1000 &amp;#956;L 移液器吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1122-1830</td><td>用作连接器</td></tr><tr><td>1 mL 结核菌素注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td>用作行为追踪区域</td></tr><tr><td>流量调节器</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122WC</td><td></td></tr><tr><td>标准夹持器/支架</td><td>EISCO Scientific</td><td>CH0688</td><td></td></tr><tr><td>细毛刷</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-204</td><td></td></tr><tr><td>果蝇固定垫（Flypad）</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 有机硅弹性体</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>CCD 相机</td><td>Microsoft&amp;nbsp;</td><td>HD-5000</td><td></td></tr><tr><td>Ctrax 果蝇行走追踪系统</td><td>加州理工学院（Caltech）</td><td>Ctrax 0.2.11</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 图像处理工具箱</td><td>MATLAB</td><td>R2015b</td><td></td></tr></tbody></table>

一种在drosophila中模拟慢性创伤性脑病的新方法

A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila

慢性创伤性脑病（Chronic Traumatic Encephalopathy, CTE）是一种明确的神经退行性疾病，与反复轻度创伤性脑损伤（mild Traumatic Brain Injury, mTBI）暴露密切相关。尽管近期已达成共识并确立了神经病理学诊断标准，但导致其复杂病理改变的机制仍 largely 不明确。本文介绍一种建立CTE模型的新方法 黑腹果蝇&#160;(果蝇&#160;)&#160;旨在鉴定导致大脑中特征性高磷酸化tau蛋白累积和神经元死亡的关键基因与通路。通过可调节强度的冲击直接作用于果蝇头部，造成轻度闭合性损伤，使头部经历快速加速与减速过程。本方法消除了其他方法固有的潜在问题 果蝇 轻度创伤性脑损伤模型（例如，动物死亡可能由身体其他部位或内脏器官的损伤引起）。果蝇在饲养上所需人力和成本较低，生命周期短，并拥有丰富的遗传工具，因此是研究慢性创伤性脑病（CTE）发病机制的理想模型，也使其能够开展大规模、全基因组范围的正向遗传学筛选和药物筛选。我们预计，对该模型的持续表征将为疾病预防和治疗策略提供重要的机制性见解。

为了利用成年Drosophila建立慢性创伤性脑病（CTE）模型，我们评估了该装置在造成单次闭合性头部损伤方面的有效性。为消除与基因型、性别或年龄相关的变异，实验中采用了2日龄的Canton-S野生型雌性果蝇。通过在100 kPa的恒定气压下调节CO2的流速，可轻松控制撞击强度。在最高流速（15 L/min）下单次撞击的果蝇仅表现出轻微的外部缺陷（图2），其外部眼睛和口器均保持完整。然而，我们发现15 L/min的流速具有急性致死性，导致24小时内存活率低于10%（图3A）。相比之下，在10 L/min或7.5 L/min流速下撞击后，果蝇的存活率分别为61.1%和96.3%；而在5.0 L/min和2.5 L/min流速下，所有果蝇在24小时后均存活（图3A）。因此，我们将后续研究标准化为使用5.0 L/min的CO2流速。在5.0...

本文介绍了一种在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中诱导闭合性头部创伤性脑损伤的新方法。该方法的优势在于能够直接对头部施加可调节强度的重复性冲击。进一步研究无脊椎动物系统将有助于阐明慢性创伤性脑病的发病机制。

一种在Drosophila中模拟慢性创伤性脑病的新方法

慢性创伤性脑病（Chronic Traumatic Encephalopathy, CTE）是一种明确的神经退行性疾病，与反复轻度创伤性脑损伤暴露密切相关……

本新方法的总体目标是通过对果蝇（Drosophila）造成闭合性创伤性脑损伤，建立一种新的慢性创伤性脑病模型。该方法有助于回答慢性创伤性脑病研究领域中的关键问题，例如重复性创伤如何诱导神经元变性。该技术的主要优势在于，能够直接对果蝇头部施加强度可调的重复性冲击，同时不会对动物身体的其他部位造成损伤。该方法的实际操作演示至关重要，因为装置的组装以及果蝇装载步骤较难掌握，果蝇头部非常小，且必须仅对头部施加冲击。为了制作用于震荡或击打果蝇的装置，首先制作装置的冲击部分。从一个1毫升聚碳酸酯结核菌素注射器中取出活塞，然后在1毫升刻度处切断注射器筒身。对于撞击器，使用200微升移液器吸头上的气溶胶屏障。该撞击器长度应为3毫米，直径为4毫米。然后将撞击器装入注射器筒内，使平面一侧朝向喷嘴。为提供动力，将注射器筒体连接至二氧化碳流量调节器。该调节器必须配有开关切换按钮，并能良好控制气体流速。然后，将筒体垂直夹持于铁架台上，使冲击体可下落至筒体底部。接下来，制作果蝇固定器。取一个 200 微升移液枪头，从细端起 5 毫米处剪断，形成直径为 8 毫米的开口。果蝇的头部可以通过此孔，但胸部无法通过。最后，制备果蝇固定装置和撞击装置。首先，从1毫升移液器吸头的小端开口处截取44毫米长的一段。其次，从一毫升注射器的针头套管上截取一段六毫米长的套管，然后将两者套接在一起。用二氧化碳麻醉一只两天大的成年雌性果蝇。从二氧化碳垫上，使用细毛刷轻轻将果蝇转移至固定器中。然后轻敲固定器，直至果蝇头部从尖端露出。若吻部已伸出，可用钝化的1毫升注射器针头轻轻将其推回固定器尖端内。必须确保果蝇身体，尤其是口器部分，完全置于固定器内，否则果蝇可能因内部器官受损或无法摄取食物而死亡。接下来，将气体压力设置为100千帕，并根据需要调节流量。将果蝇装入后，使用连接器将固定器拧紧到注射器筒上，使果蝇头部朝下。然后，通过拨动开关释放一股气体脉冲，推动撞击杆仅撞击果蝇一次。随后，取下果蝇固定器，将果蝇倒回二氧化碳操作垫上。将果蝇轻轻刷入一个空的样品瓶中，直至其恢复活动，每瓶只放一只果蝇。恢复过程仅需几分钟。每实验组测试四只果蝇，重复此过程。处理两组（实验组和假手术组）仅需20至30分钟。假手术组的处理方式与实验组动物相同，但撞击管中不放置气溶胶屏障。为了追踪果蝇在培养皿中的运动，首先用透明硅胶弹性体填充一个六厘米的培养皿以制作追踪区域。在硅胶与皿盖之间留出三毫米的间隙，使果蝇可在间隙中自由行走但无法飞行。在追踪区域下方放置白色背景。接下来，从同一处理组中麻醉四只果蝇，并将其放入实验 arena 中。让果蝇在完全照明、温度约为 22 摄氏度的 arena 中适应一小时，温度不得超过室温。一小时后，使用位于行为箱上方的感光耦合元件相机记录果蝇活动五分钟。五分钟后结束记录，将行为箱中的果蝇麻醉并转移至新的培养管中饲养。随后，弃去行为箱。随后，使用免费提供的 Ctrax 软件分析录制的视频。该软件可生成追踪数据，并能以支持编程语言的格式导出，例如 MATLAB 格式。根据数据计算每帧中果蝇移动的距离、每只果蝇的平均行走距离以及每只果蝇移动的平均距离。为了达到统计学显著性，每个处理组预计需要检测约100只果蝇。为建立慢性创伤性脑病模型，采用不同冲击速度的撞击装置对2日龄Canton-S雌性果蝇进行单次闭合性头部损伤，分析其效果。气体压力保持在100千帕。在最高测试流速下仅受到一次冲击的果蝇，表现出极轻微的外部缺陷。尽管没有明显的外部损伤证据，但在每分钟15升流速下，果蝇受到急性致死性伤害，24小时内存活率不足10%。随着流速降低，存活率有所提高。在每分钟五升或更低的流速下实现了百分之百的存活率，因此选择每分钟五升作为该模型的标准。果蝇在受到冲击后，通常在四分钟内逐渐恢复活动能力。假手术组的恢复时间则大约快一分钟。撞击后，采用视频辅助运动追踪技术来测量运动功能。在撞击后的两天内，运动功能逐渐恢复至正常水平。这种逐步恢复的证据与人类慢性创伤性脑病（CTE）的恢复过程一致。为了评估长期效应，采用了一种重复性创伤性脑损伤方案，即在连续五天内进行五次击打。治疗后20天，比较各组存活个体的运动能力，结果显示经处理组的行走明显减少。经处理组的寿命也显著缩短，中位生存期为26天，而对照组为37天。该技术建立后，为研究轻度重复性脑外伤领域的科研人员利用经典动物模型黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）探索致病机制提供了可能。在实施该操作时，需注意使用气溶胶屏障保护吻部、胸部和腹部，避免其受到直接冲击。

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科研

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Neuroscience

神经科学

慢性创伤性脑病模型的一种新方法<em&gt;果蝇</em

用于测量运动功能、学习和记忆能力的行为学实验 果蝇.

评估运动、学习和记忆功能障碍 果蝇 神经退行性疾病模型

本视频介绍了如何追踪自由行走的果蝇以评估其基本运动能力。所展示的实验方案演示了如何使用视频追踪软件进行实验设置和数据分析。...

追踪自由行走的果蝇：一种评估运动能力的方法 果蝇

本视频演示了一种使用气体驱动撞击装置对麻醉的黑腹果蝇（Drosophila）造成闭合性头部创伤性损伤的操作步骤。该损伤会影响神经元功能，并损害果蝇的行走能力。...

一种在Drosophila果蝇中诱导闭合性头部创伤性脑损伤的技术

该视频展示了使用高冲击创伤（HIT）装置在Drosophila中诱导闭合性颅脑损伤（TBI）的方法。TBI引起机械性脑损伤，影响神经元功能，并随时间推移导致神经变性和死亡。...

一种在Drosophila中诱导闭合性头部创伤性脑损伤的方法

本视频展示了在果蝇大脑中诱导穿透性创伤性脑损伤的方法。选取新羽化的果蝇，进行麻醉后置于配备荧光装置的体视显微镜下定位。识别表达GFP的蘑菇体，并插入微型针以造成损伤。随后让果蝇恢复，以供后续研究使用。...

诱导成年个体穿透性创伤性脑损伤 果蝇 果蝇

本文介绍了从黑腹果蝇（Drosophila）头部提取和纯化mRNA及代谢物的操作步骤。我们正在应用这些技术以更深入地理解神经元变性过程中潜在的细胞紊乱机制。这些方法可轻松进行规模调整，并适用于其他“组学”研究项目。...

转录本和代谢物的纯化 果蝇 头部

本文介绍了两种已建立的实验方法，用于研究黑腹果蝇（Drosophila）中多巴胺能（DA）神经元随年龄增长而发生的神经退行性变化：攀爬/惊吓诱导的负向趋地性实验，可用于研究DA神经元功能退化的效应；以及酪氨酸羟化酶免疫染色，用于在全脑制片中识别并计数DA神经元。...

评估神经退行性表型 黑腹果蝇 通过攀爬实验和全脑免疫染色检测多巴胺能神经元

我们提出了一种优化的、低成本且可靠的黑腹果蝇（Drosophila...

神经退行性疾病果蝇模型中攀爬缺陷的定量分析

本文介绍了一种在果蝇（Drosophila）中诱导闭合性头部创伤性脑损伤（TBI）的方法。该方法可利用果蝇丰富的实验工具和技术，为研究TBI病理过程中所涉及的细胞与分子机制提供途径。...

果蝇（Drosophila）被广泛用作研究神经变性的模式系统。本方案描述了一种通过检测大脑中空泡形成来量化神经变性的方法。此外，通过将对照组和实验组果蝇作为同一样本进行处理和切片，该方法还能最大限度地减少实验操作带来的影响。...

大规模组织学定量分析神经退行性变 果蝇

本方案描述了成年个体的解剖与免疫染色方法 黑腹果蝇 脑组织。具体而言，本方案重点介绍了使用 果蝇...

成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）大脑中蘑菇体与光感受器神经元的解剖及免疫荧光染色

了解利用Drosophila melanogaster建立慢性创伤性脑病模型的新方法。该技术通过可调节强度的重复性头部冲击，为研究神经元退行性病变机制提供了可靠的实验工具。

一种在Drosophila中模拟慢性创伤性脑病的新方法

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