用于筛选蜜蜂驱避化学物质的视频追踪实验方案
2017年6月12日
蜂群的丧失对作物授粉服务构成了挑战。当前的传粉昆虫保护措施需要采用一种替代方法，即利用驱避性化学物质来尽量减少蜜蜂与有害农药的接触。本文提供了用于筛选蜜蜂驱避剂的视觉追踪实验方案的详细方法。
本实验的总体目标是评估对蜜蜂具有驱避作用的化学物质。该方法有助于回答昆虫学领域的一些关键问题，例如哪些化学物质可使蜜蜂远离食物源。本方案的主要优势在于，它提供了一种相对快速、简便的方法，用于筛选对蜜蜂具有驱避作用的化学物质。
为制备对照处理用的糖-琼脂糖立方体，将半冷却的糖-琼脂糖溶液倒入称量舟模具中。对于驱避剂处理，将所需量的化合物加入半冷却的琼脂糖溶液中。本示例中，使用终浓度为1%的避蚊胺（DEET）。
轻轻摇晃烧瓶以混匀化合物，然后将溶液倒入称量舟模具中。待糖-琼脂糖块冷却凝固后，从称量舟模具中取出，并置于含有湿润滤纸的塑料容器内。将容器放入冰箱中保存。
在追踪软件中，通过屏幕左侧的实验资源管理器栏进入实验设置。确保已选择正确的相机，并且视频录制画面以培养皿区域为中心。如果需要调整视频录制画面的中心位置，请进入相机设置，在“兴趣区域”控制部分选择“中心X”和“中心Y”选项。
在实验设置中，将区域数量更改为16。在追踪特征中，选择中心点检测。然后选择区域设置，以建立实验所需的区域。
将16个培养皿以4×4的阵列方式放置在相机下方的光源箱顶部。在实验区域设置中，使用右侧工具面板上的“抓取背景”按钮拍摄16个培养皿的图像。该图像将用作设置实验区域的模板。
在竞技场设置界面顶部的工具栏中选择“创建椭圆”，并绘制一个与抓取图像中某个培养皿直径相匹配的圆形。将竞技场标记一放入该圆形内。然后在右侧工具面板中，选择位于竞技场一下方的区域组一。
从屏幕顶部的工具栏中选择“创建矩形”工具。使用此工具创建一个 30 × 30 像素的正方形，然后将其置于上一步所创建圆形的中心位置。
从顶部工具栏中选择“添加区域”，然后点击正方形的中心位置。移动该区域一个标记，使其位于正方形内。接着，在右侧工具面板中选择区域一，然后点击“复制完整区域”。
从下拉菜单中选择所有其他区域，然后点击“确定”。将复制的区域设置移动到抓取图像中剩余的培养皿中。接着选择区域一，并在顶部工具栏中选择“校准比例尺”。在校准区域一的培养皿直径位置绘制校准线。
将直径测量值更改为九厘米。在右侧工具面板上选择“验证实验区域设置”。接着，在左侧控制栏中选择“检测设置”。
选择检测设置一，然后在右侧工具箱的下拉菜单中选择灰度模式。在检测项下，将范围设置为 0 到 83。右键单击检测设置，新建一个名为检测设置二的设置。
确保仍选择灰度缩放，但不要更改其他参数。在实验资源管理器中选择试次列表，然后点击顶部工具栏中的“添加变量”。将用户定义的变量命名为 Treatment。
在用户定义处理列中选择预设值下拉栏，并将“对照”和“处理”添加为预设值。单击顶部工具栏中的“添加试验”按钮，并添加两个试验。然后针对每个区域，选择其为对照区域或处理区域。
接下来，在实验资源管理器面板中选择数据谱型。在左侧栏中，选择“用户定义的自变量”标题下的处理条件。这将在流程图区域中添加一个筛选框。
在弹出框中选择 C，然后将新创建的过滤器放置在起始框与结果框之间。流程图的箭头应自动调整，使其从起始框指向过滤器，最后指向结果框。重复此步骤，但此次在过滤器中选择 T，然后在常用元素部分选择结果。
将新创建的方框移入流程图区域，并用箭头连接各个方框，保存文件。启动视觉追踪程序，打开为此实验创建的已保存实验文件。选择检测设置二。
然后将对照组糖-琼脂立方体放入16个培养皿中8个的中央。对剩余8个培养皿中的糖-琼脂复合立方体重复此操作。用镊子从塑料盒中取出一只蜜蜂，并将其放入其中一个对照组培养皿中。
对剩余的 15 个培养皿重复此步骤。将所有培养皿放置在光源箱上。使用设定为红光光谱的 LED 灯阵列从下方照亮光源箱，并调整其位置，使检测区域与每个培养皿中的 arena 区域对齐。
用黑色塑料布将整个盒子和相机完全包裹，以消除外部光线并减少实验区域内的阴影。放置好培养皿后，确保已选择“检测设置一”。此时，视频追踪软件应仅能识别培养皿实验区域内的蜜蜂。
然后在实验浏览器中选择“采集”。点击右侧采集控制弹出框中的绿色开始试验按钮，以开始记录。运行检测 10 分钟后，点击采集控制弹出框中的红色停止试验按钮，以停止记录。
此处展示了 DEET 对单只蜜蜂取食行为影响的代表性结果。暴露于对照组凝胶的个体在取食区域平均停留 343 秒，而暴露于含 DEET 凝胶的个体平均仅停留 16 秒。此处还展示了两种不同化合物对单只蜜蜂取食行为影响的代表性结果。
暴露于非驱避化合物的个体在摄食区域平均停留282秒，而对照组个体在该区域停留约352秒。暴露于驱避化合物的个体在摄食区域停留时间显著减少，仅约23秒，相比之下，对照组个体在该区域平均停留493秒。
一旦熟练掌握，若操作得当，该技术可在20分钟内完成。在实施该程序时，重要的是要提前准备好所有物品，并对蜜蜂进行适当时间的饥饿处理。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用视频追踪软件来评估将某种化合物添加至食物来源后对个体蜜蜂所产生的影响。
完成此操作后，还可进行其他方法，如近场和田间试验，以回答有关化合物对蜂群水平影响的其他问题。该技术开发后，为昆虫学领域的研究人员探索新型化学物质及其对蜜蜂取食行为的影响开辟了道路。请注意，操作化合物可能具有极高危险性，在执行此操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴个人防护装备。
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概述
本文介绍了一种利用视频追踪检测法评估意大利蜜蜂（Apis mellifera L.）对化学驱避剂反应的实验方案。该方法可快速筛选可能使蜜蜂远离食物源的化合物，为制定减少传粉昆虫接触农药的策略提供了有力工具。
关键研究组成部分
科学领域
- 昆虫学
- 行为生态学
- 传粉者健康
背景
- 蜜蜂是具有重要经济和农业价值的关键传粉者。
- 自1947年以来，美国和欧洲的蜂群数量持续下降。
- 农药暴露是导致蜜蜂数量减少的主要因素之一。
- 开发能够驱避蜜蜂远离已施药作物的驱避剂，有助于降低农药对蜜蜂的风险。
研究目的
- 建立一种简单高效的蜜蜂化学驱避剂筛选方案。
- 评估个体蜜蜂对含有潜在驱避化合物的食物源的行为反应。
- 为传粉昆虫安全的害虫管理策略的进一步研究提供基础。
使用的方法
- 制备含或不含测试化合物（例如，1% DEET）的糖-琼脂糖块。
- 在测试前对采集蜂进行过夜禁食。
- 将单只蜜蜂放入含有对照组或驱避剂处理糖块的培养皿中。
- 使用专用软件在光照箱中对蜜蜂的运动活动进行视频追踪。
- 分析蜜蜂在10分钟实验期间于取食区域停留的时间。
主要结果
- 与暴露于DEET处理立方体的蜜蜂相比，暴露于对照立方体的蜜蜂在取食区域停留的时间显著更长（例如，343秒对比16秒）。
- 与对照组相比，非驱避性化合物对取食时间的减少无显著影响。
- 驱避性化合物导致蜜蜂在取食区域停留的时间明显减少（例如，23秒对比对照组的493秒）。
- 该方案可快速、可重复地评估化学驱避剂的效果。
结论
- 该方法为筛选蜜蜂潜在驱避剂提供了一种简便的途径。
- 它使研究人员能够鉴定出有效阻止蜜蜂接近食物来源的化合物。
- 该实验方案有助于推动对传粉昆虫友好的害虫管理实践的开发。
常见问题
行业重要性概述
利用视频追踪技术对蜜蜂进行驱避化学物质的快速筛选，可直接支持传粉媒介安全型农用化学品研发早期阶段的靶标验证。本方案能够实现定量的行为学评估，减少机制上的不确定性，并为候选化合物的“推进/终止”决策提供依据。该方法在发现生物学与环境安全应用转化的交叉领域，提升了预测的可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可实现对候选驱避化合物在传粉昆虫行为上进行基于假设的探究。
- 通过量化对特定化学物质的回避反应，支持生物学风险排除。
- 在开展田间规模研究之前，促进对驱避靶标的生物学功能验证。
- 为农业化学品候选物的机制性风险排除提供可重复的实验系统。
筛选与检测方法开发
- 提供标准化的高通量行为分析，用于化合物筛选。
- 确保对摄食区域停留时间的可重复性和定量测量。
- 为下游化合物评价工作流程准备经过验证的行为终点指标。
- 可在受控条件下并行进行多种化学物质的可扩展筛选。
转化与临床前研究
- 将实验室行为终点与传粉者安全的转化风险评估相一致。
- 实现从体外筛选到近田间及田间水平验证研究的连续性。
- 支持具有环境相关性的驱避化学物质的风险调整型推进。
- 加强针对监管和保护考量的预测性降风险评估。
流程与工作流整合
该视频追踪方案位于从发现到临床前研究的连续过程中，连接了早期化合物筛选与传粉者安全性的转化风险评估。
- 发现生物学：通过量化行为回避反应来直接评估驱避剂的有效性，支持假设检验和通路机制的阐明。
- 筛选：提供具备检测就绪性和可重复性的实验体系，用于候选化合物的快速评估。
- 分析：生成定量的“区域停留时间”数据，实现对不同处理效应的统计学比较。
- 转化研究：促进向田间及群体水平研究的衔接，以开展全面的风险评估。
- 企业级复用：建立可重复使用的行为筛选平台，用于持续的农用化学品及环境安全研发。
运营与企业影响
- 科学价值：提高驱避化合物筛选的预测可信度，降低作用机制的模糊性。
- 操作价值：标准化行为测定方法，确保在不同化合物库间的可重复性和可扩展性。
- 战略价值：为授粉媒介安全的化学产品组合提供“推进/终止”决策依据和资本配置支持。
- 组合影响：实现基于风险调整的优先排序，推动环境友好型农用化学品候选物的开发进程。
实施注意事项
- 需要具备行为测定设计和视频追踪分析方面的专业知识。
- 需要使用经过校准的视频追踪仪器以及可控光照环境。
- 要求跨团队在测定设置和数据分析方案上实现标准化。
- 可能需要针对不同的传粉昆虫物种或化合物类别进行调整。
- 实际限制包括化合物操作的安全性以及向蜂群水平效应的转化。
